真空耦合超聲波提取酸漿果中黃酮的工藝研究 ①

夏秋霞， 段騰飛， 柳雅麗， 李 瑞， 賈健凱

(1.宿州學院,安徽 宿州 234000;2.宿州市天然產(chǎn)物與功能性食品工程技術研究中心，安徽 宿州 234000)

0 引 言

酸漿果(Physalis peruviana L.)又名燈籠果、菇?jīng)龉?，口感適中有酸甜味，又因為其中富含多種微量營養(yǎng)物質(zhì)例如Vc、胡蘿卜素等，所以深受我國北方人群喜愛[1-2]。同時酸漿果也是一種中草藥植物[3]，具有消除炎癥，促進排尿解毒的功效[4]，文獻研究表示，酸漿果成分中的超臨界二氧化碳萃取物對脂多糖引起的炎癥能達到有效的抑制與治療作用[5]。除此之外，酸漿果中含有的黃酮[6]，能夠在降低體循環(huán)的動脈血壓和預防血管內(nèi)栓塞方面有顯著的療效[7]，同時在抗氧化、消除炎癥、抗自由基作用與抑菌、抗病毒以及預防腫瘤等方面都有一定的積極影響。

有關酸漿果的食用與藥用價值的研究較多，關于真空耦合超聲波技術提取酸漿果中的黃酮的報道較少，目前黃酮的提取研究一般采取有機試劑浸提、微波提取、超臨界流體萃取、超聲波等。真空耦合超聲波具有作業(yè)環(huán)境要求低、提取時間短、提取率高、儀器設備少等優(yōu)點[9]。采取真空耦合超聲波技術對酸漿果內(nèi)的黃酮成分進行提取優(yōu)化，從而提高提取效率，為酸漿果的開發(fā)和利用提供一定數(shù)據(jù)參考。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗器材

1.1.1 實驗原料與試劑

實驗原料：酸漿果購于大潤發(fā)超市，成熟度好、大小均勻，無霉變。

實驗試劑:蘆丁標準品、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇等，購于國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

1.1.2 實驗儀器

超聲波SYU-3-100DT(鄭州生元有限公司)、電熱鼓風干燥箱DHG-9245A(上海一恒科學儀器有限公司)、中草藥粉碎機XL-04B、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52-864(上海亞榮生化儀器廠)、可見光光度計722(上海元析儀器有限公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的繪制

蘆丁標準使用液(0.2 mg/mL)：根據(jù)表1利用亞硝酸鈉—硝酸鋁法獲得待測液[12-13]。將待測液在分光光度計510 nm波長下進行測定，得出線性回歸方程[14]。

表1 標準曲線配制表

1.2.2 酸漿果粉末、果汁中黃酮含量的比較

液態(tài)待測液制備：將酸漿果打漿均勻，稱取酸漿果汁于圓底燒瓶中，加入70% (v/v)乙醇，采用真空耦合超聲波進行黃酮提取，將提取液進行真空抽濾[15]，結(jié)束后將其轉(zhuǎn)移至25 mL(或50 mL)容量瓶中用70%乙醇進行定容。固態(tài)待測液的制備：將酸漿果切片干燥研磨成粉末狀，經(jīng)過50目篩得到酸漿果粉末，同上述操作定容得到待測液。

取2 mL上述容量瓶中的待測液內(nèi)于試管內(nèi)，加入60 % (v/v)乙醇2 mL，然后加利用亞硝酸鈉—硝酸鋁法制備黃酮待測液，將得到的待測液在510 nm處測得吸光值。

1.2.3 提取率的計算方法

V為定容的體積，mL;C為由標準曲線計算得到的黃酮濃度，mg/mL;m為所測樣本質(zhì)量，mg

1.2.4 單因素實驗

本次實驗選取超聲波功率、超聲溫度、料液比、真空度和超聲提取時間五個因素進行單因素實驗，探究各個單因素對提取酸漿果中黃酮提取率的影響[16]。

1.2.4.1 超聲波功率對黃酮提取率的影響

稱取1g(±0.002g)酸漿果粉末，將其質(zhì)量記為m(精確到0.0001g)后轉(zhuǎn)移至干凈圓底燒瓶內(nèi)，再量取20 mL 70%(v/v)的乙醇移入圓底燒瓶內(nèi)，真空度0.06 MPa，超聲時間為50 min，水浴加熱溫度設定為50℃，依次探索超聲功率在100 W，120 W，140 W，160 W和180 W情況下酸漿果中黃酮提取率[17]。

1.2.4.2 真空度大小對黃酮提取率的影響探究

稱取1g(±0.002g)酸漿果粉末，將其質(zhì)量記為M(精確到0.0001g)后轉(zhuǎn)移至干凈圓底燒瓶內(nèi)，再量取20 mL 70%(v/v)的乙醇移入圓底燒瓶內(nèi), 以超聲功率160 W、超聲時間為50min、溫度為50℃為實驗控制條件[18-19]，分別測定0 MPa、0.02 MPa、0.04 MPa、0.06 MPa、0.08 MPa、0.1MPa酸漿果中黃酮提取率大小。

1.2.4.3 溫度對黃酮提取率的影響

稱取1g(±0.002g)酸漿果粉末，將其質(zhì)量記為M(精確到0.0001g)后轉(zhuǎn)移至干凈圓底燒瓶內(nèi)，再量取20 mL 70%(v/v)的乙醇移入圓底燒瓶內(nèi), 以超聲功率160 W、真空度0.06 MPa、超聲時間為50 min為實驗控制條件，分別探索超聲時溫度為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃情況下酸漿果中黃酮提取率大小。

1.2.4.4 料液比對黃酮提取率的影響

稱取1g(±0.002g)酸漿果粉末，將其質(zhì)量記為m(精確到0.0001g)后轉(zhuǎn)移至干凈圓底燒瓶內(nèi)，以超聲功率160 W、溫度為60℃，真空度0.06 MPa、超聲時間為50 min為實驗控制條件，分別探索向圓底的燒瓶內(nèi)移取70 % (v/v)乙醇體積分別為10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL情況下酸漿果中黃酮提取率大小。

1.2.4.5 超聲時間對黃酮提取率的影響

稱取1g(±0.002g)酸漿果粉末，將其質(zhì)量記為M(精確到0.0001g)后轉(zhuǎn)移至干凈圓底燒瓶內(nèi)，再量取30 mL 70%(v/v)的乙醇移入圓底燒瓶內(nèi)，分別將超聲功率設為160 W，真空度為0.06 MPa、溫度60℃，在此實驗條件下，分別探索超聲時間為30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min情況下酸漿果中黃酮提取率大小[20]。

1.2.5 響應面優(yōu)化設計

在對單因素實驗的結(jié)果進行分析匯總后，依據(jù)Box-benhnken軟件的中心組合原理設計出優(yōu)化設計實驗方案，以溫度(A)、時間(B)、功率(C)、料液比(D)這四個因素作為自變量，以Y(黃酮總含量)為考察的響應值。實驗方案如下圖表2所示。

表2 響應面法因素水平設計表

2 結(jié)果分析

2.1 蘆丁的標準曲線

由圖1可見，蘆丁的濃度C(mg/mL)和吸光值A的標準線性回歸方程是y=0.3139x+0.0052(R2=0.9992)，通過方程可以發(fā)現(xiàn)，當標液的質(zhì)量濃度在0.025～0.2 mg/mL之間時，C與吸光度A之間線性關系為最優(yōu)。

2.2 酸漿果粉末、果汁中黃酮含量的比較結(jié)果

由圖2可知相同條件下，酸漿果粉末比酸漿果汁黃酮提取率要高0.011%。原因可能是酸漿果果汁內(nèi)含有較多糖分及其他成分，不易于黃酮物質(zhì)溶出，對實驗結(jié)果造成干擾。酸漿果粉末經(jīng)烘干粉碎后，內(nèi)部有效成分已經(jīng)初步濃縮，超聲輔助提取法能較有效的利用空洞、震動機理對黃酮物質(zhì)進行提取，提高提取效率。故本實驗采用酸漿果粉末提取黃酮。

圖1 蘆丁的標準曲線

圖2 酸漿果粉末和果汁中黃酮提取率

圖3 超聲功率對黃酮提取率的影響

2.3 超聲功率對黃酮提取率的影響

從圖3可知，在超聲功率達到160 W之前，黃酮提取率隨超聲功率的增強而提高，由100 W時的0.053%提高到160 W時的0.148%，提取率提高了0.095%，并在160 W時達到最高值。原因可能是隨著超聲功率的不斷加強，萃取過程中形成和崩塌的氣泡較多，強烈的沖擊波和高剪切梯度可能導致細胞壁的破壞，這就促進了細胞內(nèi)化合物化合物的釋放，同時提高了傳質(zhì)速率，從而提高了黃酮的產(chǎn)率。當超聲功率大于160W后黃酮提取率隨超聲功率增強而下降，當功率達到180 W時提取率已經(jīng)下降到0.126%。這可能是因為在超聲功率過高的情況下，黃酮結(jié)構(gòu)在此過程中發(fā)生破壞或分解。所以最佳超聲功率為160 W。

2.4 真空度對黃酮提取率的影響

由圖4可知，在0～0.06 MPa時，隨著真空度增加黃酮提取率提高，當真空度大于0.06 MPa時黃酮提取率與真空度成負相關。當真空度由0 MPa增加到0.04 MPa，黃酮提取率從0.128%提高到0.142%。真空度增加到0.1 MPa時，黃酮提取率出現(xiàn)明顯下降趨勢，提取率由0.143%下降到0.084%。當真空度達到0.08 MPa時，圓底燒瓶內(nèi)提取液出現(xiàn)微沸現(xiàn)象，此條件下提取率下降可能是高溫破壞了黃酮結(jié)構(gòu)導致，當真空度達到0.1 MPa后由于反應容器體積小真空度大，反應蒸汽無法有效回流，冷凝管接口部分出現(xiàn)倒吸現(xiàn)象，使得提取物含量受損。綜上所述當最佳真空度為0.06 MPa。

2.5 溫度對黃酮提取率的影響

從圖5中可知，當溫度為40～60℃時，提取液中的黃酮含量與溫度變化呈正相關，黃酮提取率從0.125%提高到0.181%。黃酮提取率在溫度為60℃時達到最高值，當溫度達到80℃時，黃酮提取率下降到0.101%，原因可能是隨著溫度的提高黃酮成分可能被分解或變性，也有可能此時提取溶劑乙醇揮發(fā)速度大于回流速度導致提取效率下降[21]。由上所述超聲最佳提取溫度為60℃。

2.6 料液比對黃酮提取率的影響

從圖6可知，當料液比為1：10～1：30時，提取率隨乙醇含量的增加而上升，由0.161%提高到0.221%，原因可能是當乙醇體積較少時細胞內(nèi)外滲透壓不顯著導致分子從細胞向溶液擴散效率下降，當料液比達到1：30時提取率達到最大，且料液比的不同也會給黃酮的提取帶來一定程度上的影響。當料液比在1：30～1：50之間時黃酮提取率呈下降趨勢，當料液比達到1：50時提取率下降至0.162%。綜合考慮，當料液比為1：30時最佳。

圖4 真空度對黃酮提取率的影響

圖5 溫度對黃酮提取率的影響

2.7 超聲的時間對黃酮提取率的影響

從圖7中可知：在30～60 min時黃酮提取率與超聲時間呈線性關系，提取率由0.144%提高到0.224%。當超聲時長經(jīng)過拐點后，即達到70 min時，黃酮提取率不僅沒有提高，反而出現(xiàn)下降現(xiàn)象，80 min時提取率下降到0.169%。原因可能是隨著超聲時間的增加，提取液中黃酮成分發(fā)生分解現(xiàn)象，導致濃度降低，也有可能是隨著超聲提取時間增長，酸漿果粉末中其他成分也被析出，導致黃酮提取率下降，另外不排除上述兩種原因的綜合影響從而出現(xiàn)該種現(xiàn)象。所以超聲時間選擇60 min較佳。

表3 響應面優(yōu)化實驗結(jié)果

2.8 響應面優(yōu)化實驗結(jié)果分析

2.8.1 模型的建立

利用Design-Expert8.0.6軟件對實驗結(jié)果分析，在二次多項式回歸模型方程擬合后得到關于該實驗方案中四因素三水平，24個試驗點、5個零點與總黃酮提取率的二次回歸模型方程為[22]：

Y=4.42+0.015A+0.030B+0.080C+

0.043D-0.026AB+0.0015AC+0.035AD+

0.00425BC+0.056BD-0.042CD-0.35A2-

0.34B2-0.34C2-0.34D2

2.8.2 方差分析

由表4可知：因為P<0.0001，所以可以表明此模型極為顯著；回歸方程決定系數(shù)R2=0.9805，修正后決定系數(shù)R2=0.9610，該模型能有效擬合真實實驗，能較為理想的反應各因素與響應值Y的關聯(lián)程度；失擬項P=0.2880大于0.05說明其他因素的對結(jié)果影響不顯著；其中交互項和一次項A、B與響應值Y都不顯著，二次項極為顯著，一次項C高度顯著，一次項D差異顯著。方差分析結(jié)果表明所建模型各因素與響應值不是單純的線性關系[23]。

表4 響應面方差分析結(jié)果

圖6 料液比對黃酮提取率的影響

2.8.3 響應曲面分析

由圖8可知，四個因素對酸漿果粉末中黃酮提取率的影響大小分別為：料液比>時間>溫度>超聲功率[23]，在響應面圖坡度越陡這四個因素對黃酮提取率影響越大，為了得到以超聲波輔助法提取酸漿果總黃酮量的最佳理論參數(shù)，現(xiàn)設定最大黃酮提取率，將其作為最優(yōu)的提取因素，最終得到的最佳理論參數(shù)為：提取溫度60.63℃、超聲功率為162.18 W、料液比為1：30.54、超聲時間為60.24 min，在最佳理論參數(shù)條件下，最終預測的最大總黃酮提取量為2.25 mg/g?？紤]實際操作性，最終確定最優(yōu)提取工藝為：超聲波功率162 W、提取溫度60℃、料液比1:30、超聲時間為60 min。在此條件下進行驗證型實驗，結(jié)果測得總黃酮提取量為2.25 mg/g。

圖7 超聲時間對黃酮提取率的影響

圖8 響應面結(jié)果圖

3 結(jié) 論

利用真空耦合超聲波提取工藝提取酸漿果中的黃酮，通過響應面法考察了料液比、超聲時間、溫度、超聲功率等因素，確立了最優(yōu)提取條件模型。通過模型及驗證性實驗得出的最優(yōu)工藝實驗條件為：料液比(v/v)1:30、溫度60℃、超聲波功率162W及真空度為0.06 MPa時對酸漿果粉末超聲60 min為最佳黃酮提取條件，在該實驗條件下酸漿果中黃酮提取率高達0.225%。測得的真實值與響應面回歸模型相吻合，決定系數(shù)R2達到0.9610，該模型能有效擬合真實實驗。真空耦合超聲波具有操作簡便、提取率高、儀器設備少等優(yōu)點，提高了黃酮提取率，為酸漿果的開發(fā)利用提供一定的數(shù)據(jù)參考。