響應(yīng)面法優(yōu)化百香果中原花青素提取工藝研究

羅應(yīng)，李彥青，涂睿，程昊，孔紅星，李利軍,

(1.廣西科技大學(xué) 鹿山學(xué)院，廣西 柳州 545616；2.廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006)

原花青素(PC)為生物類黃酮混合物，其分子結(jié)構(gòu)獨(dú)特，具有較強(qiáng)的清除人體內(nèi)自由基功效，為公認(rèn)天然抗氧化劑[1-2]。在目前以植物提取原花青素的研究中，以葡萄籽為最佳原料[3]，同時(shí)藍(lán)莓[4]、油茶殼[5]、白刺果[6]、珊瑚樹葉[7]、蓮子殼[8]、紅樹莓籽[9]、鎖陽等[10]也存在原花青素。

百香果屬多年生熱帶藤本植物，富含人體必需的17種氨基酸及多種維生素、微量元素等，具有消炎止痛、活血降壓、醒酒、抗疲勞、增強(qiáng)免疫力、排毒養(yǎng)顏等保健作用，其果汁和籽可直接食用，果皮可提取果膠和醫(yī)藥成份，具有重要的食用和藥用價(jià)值。周菊英等利用百香果葉提取的粗多酚實(shí)現(xiàn)了較好的抗氧化活性和抑制α-葡萄糖甘酶的作用[11]；近期熊建華等探究表明，天然百香果中花青素穩(wěn)定性較差，最佳提取工藝下，百香果中花青素提取率3.125 mg/g[12]。

本研究立足廣西百香果資源優(yōu)勢，在前期相關(guān)研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化原花青素提取工藝，提高原花青素提取率。該研究以綠色安全的乙醇為溶劑，采用鐵鹽催化比色法(正丁醇-鹽酸法)對原花青素含量進(jìn)行測定，以單因素法與響應(yīng)面法相結(jié)合，對原花青素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立原花青素提取率與因變量的二次回歸模型方程，并確定其最佳提取工藝，以期為廣西百香果資源開發(fā)應(yīng)用和原花青素提取提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，成都德銳可生物科技有限公司；十二水合硫酸鐵銨(Ⅲ)，Alfa Aesar；正丁醇、濃鹽酸、無水乙醇均為分析純；百香果，市售。

UV-2102PC紫外可見分光光度計(jì)；100～1 000 μmL 移液槍；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；皇代800Y粉碎機(jī)；UV-2102PC紫外可見分光光度計(jì)。

1.2 原花青素提取

取大小、色澤均一的新鮮百香果10顆，去除汁與籽，用粉碎機(jī)粉碎3 min(R=3×104r/min)，得百香果原料。準(zhǔn)確稱取2 g百香果原料于有磁力攪拌子和回流裝置的單口100 mL反應(yīng)瓶，按固液比 1∶15 g/mL 加入水-乙醇混合溶液，升溫至40 ℃，提取1 h，得原花青素提取母液。

1.3 原花青素檢測

1.3.1 鐵鹽催化比色法顯色劑溶液配制 鐵鹽催化比色法顯色劑溶液包括質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的硫酸鐵銨溶液和正丁醇-鹽酸溶液，實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[13]。準(zhǔn)確稱取1.029 8 g十二水合硫酸鐵銨(Ⅲ)，溶于4 mL的2 mol/L鹽酸中，得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的硫酸鐵銨溶液。另外，將正丁醇與2 mol/L鹽酸溶液按體積比V(正丁醇)∶V(鹽酸)=95∶5混合均勻，即得正丁醇-鹽酸溶液。

1.3.2 原花青素測定 原花青素經(jīng)熱酸處理后，由無色轉(zhuǎn)變?yōu)樯罴t的花青素離子，用紫外-可見分光光度法測定原花青素含量。

取10 mL比色管，分別加入1.0 mL樣品溶液、6.0 mL正丁醇-鹽酸溶液和0.2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的硫酸鐵銨溶液，振蕩搖勻，于100 ℃下反應(yīng)40 min；取出后置于冰水中冷卻至室溫，采用UV-2102PC紫外可見分光光度計(jì)為測試平臺，用正丁醇建立基線，于547 nm處測定樣品溶液的吸光值，以此實(shí)現(xiàn)對原花青素的有效測定。

1.3.3 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 稱取50.0 mg的原花青素標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL的容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度線，然后混合搖勻，得2 mg/mL的原花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。再以4 mL為基準(zhǔn)，分別配制稀釋溶液質(zhì)量濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，于 547 nm 處測定各濃度的吸光值，建立吸光度對原花青素濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖1表明在0.2～1.8 mg/mL范圍內(nèi)，吸光值與原花青素質(zhì)量濃度呈良好線性關(guān)系，其線性方程為：A=0.489 9C(R2=0.973)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve for proanthocynidins

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)溫度對原花青素提取率的影響

取百香果2 g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，反應(yīng)時(shí)間1 h、固液比1∶20 g/mL條件下，考察了反應(yīng)溫度對原花青素提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 反應(yīng)溫度對提取率的影響Fig.2 Effects of reaction temperature on theextraction rate of proanthocynidins

由圖2可知，原花青素提取率隨反應(yīng)溫度升高呈先增加后減小趨勢，40 ℃時(shí)達(dá)最大值1.20%。溫度對反應(yīng)體系萃取效果具有雙重效應(yīng)，一方面，溫度升高有利于改善體系傳質(zhì)效能，加大擴(kuò)散系數(shù)，利于原花青素向溶劑中擴(kuò)散，提高萃取率；另一方面，隨著萃取溫度升高，因原花青素對熱不穩(wěn)定，導(dǎo)致提取率下降。所以，反應(yīng)溫度以40 ℃為宜。

2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對原花青素提取率的影響

以40 ℃為最優(yōu)溫度，乙醇體積分?jǐn)?shù)對原花青素提取率的影響見圖3。

由圖3可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)過低或過高均不利于提高原花青素提取率，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，原花青素提取率達(dá)到最佳值1.41%。這是由于作為多酚化合物，原花青素易溶于水和多數(shù)有機(jī)溶劑，當(dāng)體系極性與原花青素極性相近時(shí)，更容易將其萃取出來。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration on theextraction rate of proanthocynidins

2.3 固液比對原花青素提取率的影響

在最優(yōu)反應(yīng)溫度40 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%條件下，固液比對原花青素提取率的影響見圖4。

圖4 固液比對提取率的影響Fig.4 Effects of the volume of extractant on theextraction rate of proanthocynidins

由圖4可知，原花青素提取率呈先增加后降低，固液比1∶15 g/mL時(shí),原花青素提取率達(dá)最佳值1.52%。

2.4 反應(yīng)時(shí)間對原花青素提取率的影響

在上述工藝優(yōu)化基礎(chǔ)上，由圖5可知，反應(yīng)時(shí)間過短，原花青素不能充分?jǐn)U散到溶劑中，使體系萃取效果不完全；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間過長時(shí)，原花青素分解量增加，也不利于其產(chǎn)率提高。反應(yīng)時(shí)間為60 min時(shí)，可實(shí)現(xiàn)對百香果中原花青素的有效萃取。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對提取率的影響Fig.5 Effects of reaction time on the extractionrate of proanthocynidins

2.5 原花青素提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化

2.5.1 模型建立及顯著性檢驗(yàn) 在單因素優(yōu)化基礎(chǔ)上，選取反應(yīng)溫度為40 ℃，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、反應(yīng)時(shí)間及固液比為變量，以原花青素提取率為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6軟件，依據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，因素水平見表1,結(jié)果見表2。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels graph

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of the response surface methodology

利用Design-Expert 8.0.6軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合，原花青素提取率=1.55-0.034A+0.071B+0.011C+0.20AB-0.14AC+0.062BC+0.064A2-0.031B2- 0.20C2，方差分析見表3。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

由表3可知，該回歸模型Prob=0.004 3，表明該二次回歸方程模型高度顯著，且失擬項(xiàng)Prob=0.125 6，說明該方程對實(shí)驗(yàn)擬合較好；同時(shí)B、AB、AC、C2對原花青素提取率的影響是顯著的。

2.5.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 利用Design-Expert 8.0.6軟件對乙醇體積分?jǐn)?shù)、反應(yīng)時(shí)間、固液比3因素間的交互作用進(jìn)行響應(yīng)面法分析，繪制出以原花青素為響應(yīng)值的響應(yīng)面3D曲線圖。依據(jù)3D曲線圖中各因素對應(yīng)曲線陡峭趨勢，可直觀判斷出該因素對原花青素提取率影響程度。從圖6(a)、6(b)可以看出，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較大時(shí),反應(yīng)時(shí)間延長有利于提高原花青素提取率；圖6(c)、6(d)表明當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)一定時(shí)原花青素提取率隨固液比增加先增加后減??；同樣，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間不變時(shí)，圖6(e)、6(f)中原花青素提取率也隨固液比增加呈先增大后減小趨勢。

由各響應(yīng)面3D圖可知，響應(yīng)值存在最大值。利用Design-Expert 8.0.6軟件，在實(shí)驗(yàn)因素范圍內(nèi)選擇最低點(diǎn)為出發(fā)點(diǎn)，響應(yīng)值選擇最大值優(yōu)化，優(yōu)化得到原花青素提取率的最佳理論工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，反應(yīng)時(shí)間70 min，固液比14.6 g/mL及反應(yīng)溫度40 ℃，該條件下原花青素提取率為1.83%。

圖6 兩因素交互作用對提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour pots for the effects of operating parameters on the extraction rate

2.5.3 響應(yīng)面法的可靠性 為驗(yàn)證該模型的可靠性，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)55%,反應(yīng)時(shí)間70 min,固液比1∶15 g/mL及反應(yīng)溫度40 ℃，作3次平行實(shí)驗(yàn)，得原花青素平均提取率為1.82%，與理論值吻合，表明基于響應(yīng)面法優(yōu)化原花青素提取工藝準(zhǔn)確、可靠。

2.6 百香果籽原花青素提取研究

取洗凈、干燥好的百香果籽10 g，采用“1.2”方法對樣品進(jìn)行處理，并準(zhǔn)確稱取2 g百香果籽粉末，于響應(yīng)面法最佳工藝條件下進(jìn)行原花青素萃取，并與百香果皮原花青素提取效果進(jìn)行對比，結(jié)果見圖7。

圖7 百香果皮、籽原花青素提取液吸光值對比圖Fig.7 Comparison of the absorptions of different extractsfrom passion fruit peel and seeds

由圖7可知，百香果皮原花青素提取液在 547 nm 處有明顯吸收峰，百香果籽原花青素提取液在500～600 nm之間沒有任何峰值，吸光度曲線呈逐漸降低趨勢，表明百香果籽原料萃取液不含原花青素。

3 結(jié)論

百香果皮原花青素提取最佳工藝為：反應(yīng)溫度40 ℃，反應(yīng)時(shí)間70 min，固液比1∶15 g/mL及乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，該條件下原花青素提取率可達(dá)1.82%，即質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.2 mg/g，與現(xiàn)有文獻(xiàn)原花青素提取率3.125 mg/g相比，該工藝對原花青素萃取效果顯著。同時(shí)，該工藝下百香果籽中不含原花青素。