一株高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的鑒定及其特性研究

張國華，張緯珍，梁武龍，王 偉，涂 建

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 太原030006）

傳統(tǒng)發(fā)酵酸面團(tuán)（Sourdough），在我國也稱為老面、酵子、面肥或起子，是傳統(tǒng)制作饅頭或面包的主要發(fā)酵劑，其主要由小麥粉和水混合發(fā)酵而成，是酵母菌、乳酸菌、霉菌等多菌群組成的混合發(fā)酵體系[1-3]。酸面團(tuán)在發(fā)酵過程中由于其含有多種微生物及各種化學(xué)酶系，因此伴隨著一系列的生化反應(yīng)，如酸化作用、蛋白質(zhì)降解、胞外多糖和風(fēng)味底物的生成等，使得面團(tuán)物性特征發(fā)生變化，因而制備的發(fā)酵面制品感官品質(zhì)更佳[4-6]。在酸面團(tuán)發(fā)酵過程中，酵母菌主要將面粉中的糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為CO2及醇、醛類等物質(zhì)，形成穩(wěn)定的面筋結(jié)構(gòu)及獨特風(fēng)味[7-8]；乳酸菌則利用面團(tuán)中可發(fā)酵糖，產(chǎn)生乳酸、醋酸及丙酸等有機(jī)酸，可與酵母發(fā)酵中產(chǎn)生的醇、醛等物質(zhì)相互作用，形成新的風(fēng)味物質(zhì)，此外乳酸菌還能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，如細(xì)菌素，可延長產(chǎn)品的保質(zhì)期[8]。

由于酸面團(tuán)制備的發(fā)酵食品口感細(xì)膩，風(fēng)味獨特且更有嚼勁，因此得到國內(nèi)外許多專家學(xué)者的關(guān)注。如Dal Bello 等[9]研究證實酸面團(tuán)中的舊金山乳桿菌（L.sanfranciscensis LTH 2581）和植物乳桿菌（L.plantarum FST 1.7）可有效增加面包體積，酸化面團(tuán)及產(chǎn)生抗真菌因子，延緩面包瓤老化3 d 時間。Van Kerrebroeck 等[10]利用Meta-Analysis 對已報道的300 多個酸面團(tuán)進(jìn)行分析，從酸面團(tuán)中微生物多樣性角度分析酸面團(tuán)可分為I型和II 型酸面團(tuán)，在酸面團(tuán)中酵母菌種的數(shù)量普遍低于乳酸菌種的數(shù)量。Martorana 等[11]通過對酸面團(tuán)中乳酸菌和酵母菌的分離鑒定，得出舊金山乳桿菌和釀酒酵母為其中的優(yōu)勢菌種。國內(nèi)孫銀鳳等[12]應(yīng)用我國傳統(tǒng)酸面團(tuán)的區(qū)域特色乳酸菌——舊金山乳桿菌發(fā)酵酸面團(tuán)，結(jié)果表明酸面團(tuán)能夠減少面包硬度增加量，降低水分遷移量和老化焓值，具有改善面包老化特性的效果。Zhang等[2]利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)與變性梯度凝膠電泳（DGGE）方法研究了來自中國不同地區(qū)的酸面團(tuán)中微生物的多樣性，最終分離并鑒定了131 種酵母菌、2 種霉菌和106 種乳酸菌菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)舊金山乳桿菌是中國傳統(tǒng)酸面團(tuán)中的主要優(yōu)勢菌種。劉若詩等[13]研究發(fā)現(xiàn)凍干舊金山乳桿菌酸面團(tuán)發(fā)酵劑對發(fā)酵面團(tuán)和面包香氣的影響顯著，酸面團(tuán)面包面團(tuán)中有機(jī)酸和游離氨基酸含量均高于相應(yīng)的非酸面團(tuán)面包面團(tuán)，乳酸菌酸面團(tuán)發(fā)酵顯著提高了面包中揮發(fā)性物質(zhì)的含量。此外，乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）對面制品有延緩老化，增加吸水性，維持結(jié)構(gòu)，增加體積的作用，產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)有效抑制真菌與細(xì)菌的生長，從而延長面制品保藏時間[14]。如Tamani 等[15]研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)EPS 的乳酸菌具有抗面包老化的效果，而不產(chǎn)EPS 的乳酸菌對面包品質(zhì)及老化無明顯作用，其原因可能是乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的EPS 增強(qiáng)面包保水性，進(jìn)而改善面包品質(zhì)及老化特性。

本文以實驗室篩選的一株高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌菌株SXU-1001[EPS 產(chǎn)量為（190.32±2.36）mg/L]為研究對象，對其進(jìn)行了系統(tǒng)研究，測定了該菌株的生理生化特性、產(chǎn)酸曲線、抑菌特性及藥敏譜，為開發(fā)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物資源奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

革蘭氏染色液試劑盒HB8278，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

芽孢染色液：5%孔雀綠水溶液，0.5%番紅水溶液。

3%過氧化氫溶液：取30%過氧化氫溶液10 mL，用水定容至100 mL 即可。

乳酸菌成套生化鑒定管：七葉苷1 支，纖維二糖1 支，麥芽糖1 支，甘露醇1 支，水楊苷1 支，山梨醇1 支，蔗糖1 支，棉子糖1 支，菊糖1 支，乳糖1 支，馬尿酸1 支，無菌液體石蠟1 支，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

抗菌藥物藥敏紙片30 種，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為WS/T 125-1999，杭州微生物試劑有限公司。

PHS-3C 型pH 計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SP-2000UV 紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；DSX-280B 型手提式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；YLY-XH-100AD實驗室超純水機(jī)，深圳市億利源水處理設(shè)備有限公司；SC-3614 低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；OLYMPUS BX53 正置熒光顯微鏡，南京伊若達(dá)儀器設(shè)備有限公司；Nicolet IS 50 傅里葉變換紅外光譜儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

乳酸菌SXU-1001 由本實驗室提供。

mMRS 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，牛肉浸粉10 g/L，麥芽糖20 g/L，乙酸鈉5g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，檸檬酸銨2 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.05 g/L，吐溫80 1 mL/L，pH 5.4。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏5 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂15 g/L，pH 7.2～7.4。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的活化與培養(yǎng) 將凍存于-20 ℃的乳酸菌SXU-1001 從冰箱中取出，于mMRS 肉湯培養(yǎng)基中活化2～3 次，然后于mMRS 瓊脂培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)，挑取單菌落于mMRS 液體培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)。

1.3.2 乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將活化后的乳酸菌SXU-1001 使用細(xì)菌DNA 試劑盒提取其基因組DNA，由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。將得到的測序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對分析，找到同源性最接近的已知種屬的序列。用軟件MEGA 7.0 進(jìn)行序列分析，并采用Neighbor-Joining 法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建進(jìn)化樹，研究分離菌株與模式株之間的親緣關(guān)系。

1.3.3 乳酸菌細(xì)胞形態(tài)觀察 將乳酸菌SXU-1001 于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，采用革蘭氏染色法和芽孢染色法[16]對細(xì)菌形態(tài)進(jìn)行觀察，采用電鏡觀察細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行圖像采集。通過光學(xué)顯微鏡測量細(xì)菌的大小，通常使用放在顯微鏡中的顯微測微尺來測量。細(xì)菌的長度單位為微米（μm），其個體大小的測定方法為：寬度×長度[17]。

將培養(yǎng)24 h 后的乳酸菌發(fā)酵液進(jìn)行梯度稀釋，選擇適宜的梯度稀釋液進(jìn)行平板涂布，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d 觀察菌落形態(tài)，觀察時選擇菌落分布比較稀疏處于孤立的菌落。

1.3.4 紅外光譜分析 將培養(yǎng)24 h 的乳酸菌經(jīng)冷凍干燥后于傅里葉變換紅外光譜儀中進(jìn)行400～4 000 cm-1全范圍掃描，分析吸收峰[17]。

1.3.5 乳酸菌生長量及生長曲線的測定

1.3.5.1 生長量的測定 采用細(xì)胞干重法，取乳酸菌發(fā)酵液（24 h）于9 000 r/min 條件下離心15 min，得到的菌體用去離子水清洗2 次，轉(zhuǎn)入已稱重的離心管中，在（100±5）℃烘箱中烘干至恒重，記錄數(shù)值[18]。

1.3.5.2 生長曲線的測定 將分離純化得到的乳酸菌按體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量于mMRS 培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48 h，測量不同時間段的吸光度值A(chǔ)600nm以及相對應(yīng)時間的菌落數(shù)，分別以A600nm，lg（CFU/mL）為縱坐標(biāo)、時間為橫坐標(biāo)，繪制乳酸菌的生長曲線。

對數(shù)期中3 個重要參數(shù)的計算[17]：

1.3.6 乳酸菌pH 值及產(chǎn)酸速率曲線的測定 將分離純化后的乳酸菌按體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量接種到mMRS 肉湯培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48 h，測量不同時間段的pH 值，以時間為橫坐標(biāo)，pH 值為縱坐標(biāo)繪制pH 值曲線。

產(chǎn)酸速率的測定：取10 mL 發(fā)酵樣液加入50 mL 蒸餾水，用0.1 mol/L NaOH 溶液進(jìn)行滴定，直至pH 值為8.2，對所用的NaOH 溶液的體積進(jìn)行記錄，計算總酸含量[19]。計算公式為：

式中：C——標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉濃度，mol/L；V——滴定消耗氫氧化鈉的體積，mL；K——酸的換算系數(shù)，乳酸為0.090；V0——樣品稀釋液總體積，mL；m——樣品體積，mL；V1——滴定時吸取的樣液體積。

1.3.7 乳酸菌的生化鑒定 采用生化鑒定管對乳酸菌的生化特性進(jìn)行鑒定，鑒定項目包括七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、菊糖、乳糖、1%馬尿酸鈉。用接種環(huán)從平板上挑取已純化培養(yǎng)的同一乳酸菌菌落于需要試驗的生化管中，于30 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察試驗結(jié)果，若結(jié)果為黃色（除1%馬尿酸鈉生化鑒定管變?yōu)楹谏猓﹦t為陽性，紫色為陰性。

將乳酸菌SXU-1001 接種于mMRS 瓊脂斜面，于30 ℃培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)好的乳酸菌涂于干凈的載玻片上，向載玻片滴加配制好的過氧化氫溶液，如果在半分鐘內(nèi)有大量氣泡產(chǎn)生則為過氧化氫陽性反應(yīng)，沒有氣泡產(chǎn)生則為過氧化氫陰性反應(yīng)[20]。

1.3.8 乳酸菌的抑菌活性 采用紙片法[21]進(jìn)行抑菌試驗。分別將凍存的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠球菌劃線于營養(yǎng)瓊脂斜面，37 ℃培養(yǎng)24 h 進(jìn)行活化待用。培養(yǎng)結(jié)束后，將3 種指示菌（1×108CFU/mL）均勻涂布在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，將無菌的濾紙片（6 mm）貼在涂有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠球菌的平板上，分別在每個濾紙片上滴加10 μL 乳酸菌SXU-1001 發(fā)酵液，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并計算抑菌圈直徑 （單位：mm），以滴加等量的無菌生理鹽水為對照組。

1.3.9 乳酸菌藥敏譜 將乳酸菌SXU-1001 發(fā)酵液（1×108CFU/mL）均勻涂布在已凝固的mMRS 培養(yǎng)基上，待菌液干燥后，將30 種藥敏紙片分別貼于培養(yǎng)基表面，30 ℃培養(yǎng)48 h 后觀察并記錄抑菌圈直徑。若產(chǎn)生抑菌圈則表明該抗生素對乳酸菌的生長具有抑制作用，若無抑菌圈則表明乳酸菌的生長不受該抗生素的影響[22]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復(fù)3 次，采用SPSS 15.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，所有結(jié)果均采用±s 表示，利用ANOVA 進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05，P＜0.01）；采用Origin 8.5 對試驗結(jié)果進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹

系統(tǒng)發(fā)育樹也稱系統(tǒng)進(jìn)化樹（phylogenetic tree），它是用類似樹狀分支的圖來表示各種（類）生物之間的親緣關(guān)系，通過對生物序列的研究來推測物種的進(jìn)化歷史。為明確乳酸菌SXU-1001的種屬，本試驗將乳酸菌SXU-1001 與傳統(tǒng)酸面團(tuán)中已報道的屎腸球菌 （Enterococcus faecium）、面包乳桿菌（Lactobacillus crustorum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、舊金山乳桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）[2]進(jìn)行對比分析，建立的16S rRNA 系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示，其中測試菌株SXU-1001 與舊金山乳桿菌的親緣關(guān)系最近。此外，在與NCBI 數(shù)據(jù)庫中比對分析得到乳酸菌SXU-1001 與舊金山乳桿菌JCM 5668 的相似性為99%。因此，可鑒定為舊金山乳桿菌，本實驗室將其命名為舊金山乳桿菌Ls-1001。Ganzle 等[23]通過對世界范圍內(nèi)的酸面團(tuán)分析得到酸面團(tuán)中存在80 多種細(xì)菌，主要包括乳桿菌、明串珠菌、乳球菌、腸球菌和鏈球菌，其中舊金山乳桿菌是酸面團(tuán)中的主要微生物（如圖2所示）。

圖1 乳酸菌SXU-1001 16S rRNA 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 16S rRNA phylogenetic tree of LAB SXU-1001

圖2 酸面團(tuán)中典型的乳酸菌[23]Fig.2 Graphic representation on typical sourdough lactic acid bacteria[23]

2.2 舊金山乳桿菌細(xì)胞形態(tài)觀察

如圖3a 所示，舊金山乳桿菌Ls-1001 在mMRS 瓊脂培養(yǎng)基上的菌落為白色，形狀為規(guī)則圓形，具體描述見表1；經(jīng)革蘭氏染色結(jié)果（圖3b）表明舊金山乳桿菌Ls-1001 為紫色，是革蘭氏陽性菌，細(xì)胞呈桿狀，菌體大小（寬度×長度）為（1.28～ 1.60）μm ×（2.4～8.0）μm；經(jīng)芽孢染色（圖3c）后，舊金山乳桿菌Ls-1001 菌體呈現(xiàn)紅色，并未有綠色出現(xiàn)，表明舊金山乳桿菌Ls-1001 不產(chǎn)芽孢；舊金山乳桿菌Ls-1001 在掃描電鏡下的形態(tài)如圖3d 所示，細(xì)菌呈現(xiàn)桿狀，微彎曲，與先前Kline 等[24]報道的舊金山乳桿菌為短到中等細(xì)長桿或較短鏈，具有形成彎曲或絲狀的較小傾向相一致。

圖3 舊金山乳桿菌Ls-1001 的不同形態(tài)Fig.3 Different forms of L.sanfranciscensis Ls-1001

表1 舊金山乳桿菌Ls-1001 菌落形態(tài)描述Table 1 Description of colony morphology of L.sanfranciscensis Ls-1001

2.3 紅外光譜分析

舊金山乳桿菌的傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果如圖4所示，吸收峰主要集中在3 300 ～2 900 cm-1和1 650～850 cm-12 個區(qū)域之間。據(jù)文獻(xiàn)報道，微生物的FTIR 光譜通常分為5 個區(qū)域，這些區(qū)域包含來自不同細(xì)胞組分的信息：1）3 000～2 800 cm-1：細(xì)菌細(xì)胞膜中的脂肪酸；2）1 800～1 500 cm-1：來自蛋白質(zhì)和肽的酰胺條帶；3）1 500～1 200 cm-1：為含有蛋白質(zhì)和脂肪酸的混合區(qū)域；4）1 200～900 cm-1：細(xì)胞壁內(nèi)的多糖；5）900～500 cm-1：包含不屬于特定官能團(tuán)條帶的“真實”指紋區(qū)域[25-26]。由此可知，舊金山乳桿菌細(xì)菌的細(xì)胞成分包括脂肪酸、蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)。由于傅里葉變換紅外光譜分辨率高，不僅能提供分子基團(tuán)特征的振動吸收譜帶，而且能敏銳地探測分子基團(tuán)及其周圍環(huán)境的變化[27]，因此在菌種的鑒定上有較多的應(yīng)用。如Curk 等[26]通過FTIR 光譜法分析了53 株乳桿菌，在物種水平上正確率為94%，菌株水平上正確率為91%。Dziuba 等[28]通過使用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) （ANN）和傅里葉變換紅外光譜（FTIR）在屬水平上鑒定了乳酸菌和丙酸細(xì)菌。Dziuba 等[29]應(yīng)用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和聚類分析（cluster analysis）對乳桿菌、乳球菌、明串珠菌、片球菌和鏈球菌進(jìn)行了鑒定。Srivastava 等[30]利用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）對德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）進(jìn)行了篩選。

2.4 舊金山乳桿菌生長量及生長曲線的測定

圖4 舊金山乳桿菌傅里葉變化紅外光譜分析Fig.4 Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR）analysis of L.sanfranciscensis

舊金山乳桿菌Ls-1001 培養(yǎng)24 h 后的生長量測定結(jié)果如表2所示，為（24±1）g/L。細(xì)菌生長曲線反映了單細(xì)胞微生物在一定環(huán)境條件下的群體生長規(guī)律，依據(jù)其生長速率的不同，一般可把生長曲線分為延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。各時期的長短因菌種遺傳特性、接種量、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件不同而有所改變[31]。觀察圖5中舊金山乳桿菌Ls-1001 在不同時間的吸光度值和菌落數(shù)的對數(shù)值可知，舊金山乳桿菌Ls-1001 在48 h 內(nèi)只出現(xiàn)延滯期（0～4 h）、對數(shù)期（4～12 h）、平穩(wěn)期（12～48 h），未出現(xiàn)衰亡期。經(jīng)過對細(xì)菌生長對數(shù)期的計算可知舊金山乳桿菌Ls-1001 的繁殖代數(shù)（n）為0.36，生長速率常數(shù)（R）為0.045，代時（G）為22.42 min。通過測定舊金山乳桿菌的生長量和生長曲線，可了解細(xì)菌的生長規(guī)律，對于今后的科研以及改善傳統(tǒng)發(fā)酵面制品的生產(chǎn)工藝具有重要的指導(dǎo)意義。

表2 舊金山乳桿菌Ls-1001 生長量的測定Table 2 Determination of the growth of L.sanfranciscensis Ls-1001

圖5 舊金山乳桿菌Ls-1001 的生長曲線Fig.5 Growth curve of L.sanfranciscensis Ls-1001

2.5 舊金山乳桿菌pH 值及產(chǎn)酸速率曲線的測定

由圖6可知，舊金山乳桿菌Ls-1001 在生長過程中pH 值呈逐漸下降趨勢，在前15 h 下降較快，原因可能是菌數(shù)增加，舊金山乳桿菌的生長處于對數(shù)期，產(chǎn)酸較多；之后pH 值基本保持不變，pH 最終為4.09±0.01。由圖7可知，舊金山乳桿菌Ls-1001 在生長過程中產(chǎn)酸量不斷上升，15 h 之前總酸度上升速率快，之后產(chǎn)酸量緩慢增加最終趨于平穩(wěn)，最終產(chǎn)酸量為（0.70±0.01）g/L。舊金山乳桿菌在生長過程中產(chǎn)生的一系列酸如乙酸、乳酸等都導(dǎo)致了pH 值的下降，據(jù)Corsetti 等[32]報道舊金山乳桿菌產(chǎn)生的混合酸中的己酸是具有最高抗霉菌活性的有機(jī)酸。此外，Moroni 等[33]提到由舊金山乳桿菌 （L.sanfranciscensis）CB1 產(chǎn)生的由己酸、乙酸、甲酸、丙酸、丁酸和正戊酸組成的混合物在抑制面包中的鐮刀菌、青霉菌、曲霉菌和念珠菌生長中起關(guān)鍵作用。因此，由于舊金山乳桿菌具有產(chǎn)酸性能，故其在發(fā)酵面制品中的添加能防止或減少面制品微生物的腐敗，進(jìn)而提高面制品的保質(zhì)期。

2.6 舊金山乳桿菌的生化鑒定

舊金山乳桿菌的生化鑒定結(jié)果如表3所示，在上述12 種生化鑒定中麥芽糖發(fā)酵管為陽性，表明舊金山乳桿菌可利用麥芽糖，與文獻(xiàn)報道舊金山乳桿菌以麥芽糖為碳源相一致[34]；蔗糖發(fā)酵管既有陽性也有陰性結(jié)果出現(xiàn)，原因是不同舊金山乳桿菌菌株之間具有差異性，對蔗糖的利用程度不一致；其余10 種發(fā)酵管均為陰性，表明舊金山乳桿菌過氧化氫酶為陰性，在生長代謝過程中不能利用七葉苷、纖維二糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、棉子糖、菊糖、乳糖、1%馬尿酸鈉等物質(zhì)。

2.7 舊金山乳桿菌的抑菌活性

由表4和圖8可知，舊金山乳桿菌Ls-1001對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠球菌均有抑制作用，抑菌效果為金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞白色念珠球菌。生理鹽水（對照組）對3 株指示菌的生長無抑制作用。

圖6 pH 值曲線Fig.6 The curve of pH

圖7 產(chǎn)酸速率曲線Fig.7 Acid production rate curve

表3 舊金山乳桿菌的生化特性Table 3 Biochemical characteristics of L.sanfranciscensis

表4 舊金山乳桿菌Ls-1001 抑菌試驗結(jié)果Table 4 Results of antibacterial experiment of L.sanfranciscensis Ls-1001

圖8 舊金山乳桿菌Ls-1001 抑菌試驗結(jié)果Fig.8 Results of antibacterial experiment of L.sanfranciscensis Ls-1001

2.8 舊金山乳桿菌的藥敏譜

通過舊金山乳桿菌Ls-1001 藥敏性試驗研究表明，在測試的30 種抗生素中，各個抗生素對舊金山乳桿菌的影響有所不同，抑菌結(jié)果如表5所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中氨基糖苷類（慶大霉素、卡那霉素、新霉素、丁胺卡那）、喹諾酮類（諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星）、糖肽類（萬古霉素）、硝基呋喃類（呋喃唑酮）這4 類抗生素均無抑菌圈出現(xiàn)，表明這4 類抗生素對舊金山乳桿菌的生長無抑制作用；而頭孢類（頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢氨芐、頭孢唑林、頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢他啶）、大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素、麥迪霉素）、林可酰胺類（克林霉素）、青霉素類（青霉素、苯唑西林、氨芐西林、羧芐西林、哌拉西林）、四環(huán)素類（四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素）、脂肽類（多黏菌素B）、磺胺類（復(fù)方新諾明）、酰胺醇類（氯霉素）這8 類抗生素均產(chǎn)生了大小不一的抑菌圈，表明這8 類抗生素能在不同程度上抑制舊金山乳桿菌的生長。由于舊金山乳桿菌是一種有益菌，其不僅對面團(tuán)流變學(xué)特性及產(chǎn)品質(zhì)地特性發(fā)揮著積極的作用，且乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一些具有生物活性的成分如胞外多糖，不僅廣泛應(yīng)用于各種食品的增稠、穩(wěn)定、乳化、膠凝及保濕等，還具有保護(hù)菌體、抗腫瘤、促進(jìn)免疫系統(tǒng)等作用[35]。因此，若舊金山乳桿菌應(yīng)用于生產(chǎn)生活中，應(yīng)考慮其與抗生素之間的相互作用及臨床反應(yīng)。乳酸菌菌株的耐藥性評價是目前國際上益生乳酸菌安全性評價的首要內(nèi)容[22]。通過研究舊金山乳桿菌對抗生素的敏感性，不僅完善了舊金山乳桿菌的基本性質(zhì)，建立了相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，也為今后菌株的開發(fā)應(yīng)用提供了支持。

表5 舊金山乳桿菌Ls-1001 藥敏譜Table 5 L.sanfranciscensis Ls-1001 susceptibility spectrum

3 結(jié)論

本文對實驗室保藏的分離自傳統(tǒng)酸面團(tuán)中一株高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌SXU-1001 菌株進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明該乳酸菌為舊金山乳桿菌，是傳統(tǒng)發(fā)酵酸面團(tuán)中的優(yōu)勢菌種，本菌種為革蘭氏陽性，過氧化氫酶為陰性，細(xì)菌形態(tài)呈桿狀且微彎曲。經(jīng)過傅里葉變換紅外光譜分析，舊金山乳桿菌吸收峰主要集中在3 300～2 900 cm-1和1 650 ～850 cm-12 個區(qū)域之間，表明該細(xì)菌的細(xì)胞成分包括脂肪酸、蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)。此外，舊金山乳桿菌的生物量為（24±1）g/L，繁殖代數(shù)為0.36，生長速率常數(shù)為0.045，代時為22.42 min，在生長過程中具有產(chǎn)酸現(xiàn)象的發(fā)生，其中pH 值最低為4.09±0.01，總酸度最高為（0.70±0.01）g/L，能利用麥芽糖，不同菌株對蔗糖的利用程度具有差異性。對3 種致病菌的抑菌效果為金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞白色念珠球菌，且在測試的30 種抗生素中對舊金山乳桿菌的影響各有不同。通過對舊金山乳桿菌基本特性的研究，為后續(xù)研究提供了參考依據(jù)，也為傳統(tǒng)面食發(fā)酵劑中乳酸菌資源開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。