貽貝蒸煮液酶解工藝的優(yōu)化

陶美潔，孟 粉，董 燁，毛海萍，秦求思，戴志遠，2*

（1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室 杭州310012）

貽貝（Mytilus edulis）在北方俗稱為“海虹”，南方稱“青口”、“淡菜”。貽貝產(chǎn)量高，生長力強，是我國主要養(yǎng)殖貝類，其產(chǎn)量占全世界產(chǎn)量的一半以上，目前以冷凍或干制為主要加工手段。在貽貝加工的過程中，每生產(chǎn)1 t 產(chǎn)品，就會產(chǎn)生約1.5 t的蒸煮液[1]。這些蒸煮液含有大量的營養(yǎng)成分，如果直接排入水體不僅會污染環(huán)境，還會造成資源的浪費[2]。利用貽貝加工過程的蒸煮液，研制出天然貽貝調(diào)味品，不僅解決了資源的浪費問題，還解決了環(huán)境污染問題，增加了貝類加工制品的附加值，產(chǎn)生了良好的社會和經(jīng)濟效益。

水產(chǎn)品動物蛋白酶解工藝的研究有很多[3-9]，羅偉等[3]以水解度和苦味評分為指標優(yōu)化酶解貽貝蒸煮汁液的條件。桑亞新等[4]以回收率和水解度為指標，優(yōu)化酶解扇貝裙邊的條件。王斌等[5]以DPPH 清除率為指標，優(yōu)化酶解赤魟魚的條件。本文以水解度為指標，從風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、復(fù)合蛋白酶4 種酶中篩選最適合酶解貽貝蒸煮液的蛋白酶；以酶解時間、溫度、pH 值、加酶量做單因素試驗，以水解度和風味為指標，采用正交試驗優(yōu)化酶解條件，為后續(xù)研究貽貝蒸煮液調(diào)味品提供理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料 樣品：浙江省嵊泗縣華利水產(chǎn)有限公司提供，由新鮮貽貝的蒸煮液經(jīng)加熱24 h 濃縮而成；F861436 風味蛋白酶，上海麥克林生化科技有限公司；SF-001 復(fù)合蛋白酶，西安拉維亞生物科技有限公司；PB180218 胰蛋白酶，普諾賽生命科技有限公司；6384245 木瓜蛋白酶，鹽城潤雨生物科技有限公司；中性甲醛（分析純級）、氫氧化鈉（分析純級）、硫酸鉀（分析純級）、硫酸銅（分析純級），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；鹽酸（分析純級），太倉美達試劑有限公司；濃硫酸（分析純級），西隴化工股份有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 HY-6 型水浴振蕩器，太倉市實驗設(shè)備廠；FE28 pH 計、AL204 型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MYP11-2 磁力攪拌器，常州國華電器有限公司；Gradient 型Milli-Q 超純水機，美國Millipore 公司；B-324 凱氏定氮儀，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；50 μm / 30 μm DVB/CAR/PDMS 涂層萃取頭，美國Supelco 公司；J-HH-2A 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，邦西儀器科技（上海）有限公司；Trace GC Ultra 氣相色譜-DSQ II 質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Theremo Fisher Scientific 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶解液的處理 取濃縮好的貽貝蒸煮液100 mL 加熱到蛋白酶最適溫度后，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)pH 值至最適范圍 （風味蛋白酶最適pH 6.5，復(fù)合蛋白酶最適pH 7.0，木瓜蛋白酶最適pH 6.0，胰蛋白酶最適pH 7.5）。將稱量好的蛋白酶加入酶解罐酶解一定時間后，在沸水浴中滅酶6 min，冷卻至室溫，于4 000 r/min 離心10 min，所得上清液即為酶解液。

1.2.2 酶解液水解度的測定 采用甲醛電位滴定法[10-12]測定酶解液中氨基酸態(tài)氮含量。參考GB5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》[13]的方法測定酶解液中總氮含量。水解度（%）=離心液中氨基酸態(tài)氮含量/離心液中總氮含量×100。

1.2.3 蛋白酶種類的篩選 4 種蛋白酶的酶解最適溫度、pH 值、酶解時間、加酶量如表1所示，分別在其最適酶解條件下酶解，以水解度為指標，篩選出貽貝蒸煮液酶解的最適蛋白酶種類。

表1 酶制劑的水解條件Table 1 Hydrolysis conditions of enzyme preparation

1.3 單因素試驗設(shè)計

1.3.1 加酶量對酶解液水解度的影響 加酶量控制為0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，0.9%，固定水解溫度50 ℃，酶解時間3 h，pH 7.0，測定加酶量對酶解液水解度的影響。

1.3.2 酶解時間對酶解液水解度的影響 酶解時間控制為1，2，3，4，5 h，固定水解溫度50 ℃，pH 7.0，酶的添加量0.5%，測定酶解時間對酶解液水解度的影響。

1.3.3 pH 值對酶解液水解度的影響 pH 值控制在6，6.5，7，7.5，8，固定水解溫度50 ℃，酶的添加量0.5%，酶解時間3 h，測定pH 值對酶解液水解度的影響。

1.3.4 溫度對酶解液水解度的影響 溫度控制在40，45，50，55，60 ℃，固定酶的添加量0.5%，酶解時間3 h，pH 7.0，測定溫度對酶解液水解度的影響。

1.4 響應(yīng)面設(shè)計

參考風味蛋白酶的單因素試驗結(jié)果，采用響應(yīng)面方法在4 因素3 水平上對溫度、pH 值、酶解時間、加酶量進行優(yōu)化，根據(jù)中心組合設(shè)計原理進行設(shè)計，分析因素及水平設(shè)計見表2。

表2 響應(yīng)面法分析因素及水平Table 2 Response surface methodology analysis factors and levels

1.5 氣相色譜條件

色譜柱：TR-35MS，30 m×0.25 mm，0.25 μm；載氣：He；載氣流速：0.8 mL/min；分流方式：不分流；升溫程序：40 ℃保持2 min，以4 ℃/min 使溫度上升至92 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 使溫度上升至200 ℃，再以6 ℃/min 使溫度上升至240 ℃，保持6 min。

1.6 質(zhì)譜條件

電子電離（Electron ionization，EI）離子源，電子能量70 eV，離子源溫度250 ℃，傳輸桿溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z 33～450。掃描方式為全掃描，調(diào)諧文件為標準調(diào)諧。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的選擇

以水解度為指標，比較風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶4 種蛋白酶對貽貝蒸煮液酶解的效果。由表3可知，風味蛋白酶相較于其它蛋白酶水解度最高，因此選用風味蛋白酶作為后續(xù)酶解酶。

2.2 加酶量的選擇

從圖1可看出，隨著蛋白酶含量的增加，水解度呈上升趨勢，到加酶量為0.5%的時候，水解度趨于穩(wěn)定，這是由于酶濃度逐漸為底物所飽和，而且加入過多的蛋白酶會造成其自水解，會對底物產(chǎn)生一定的影響[14]，綜合考慮，酶的添加量選擇在0.3%～0.7%較為合適。

表3 不同蛋白酶對貽貝蒸煮液的影響Table 3 Effects of different proteases on mussel cooking liquor

2.3 酶解時間的選擇

從圖2可以看出，隨著酶解時間的增長，水解度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在酶解3 h 的時候達到最大值。因此，酶解時間選擇在2～4 h 較為合適。

2.4 pH 值的選擇

從圖3可以看出，pH 值為7 的時候，水解度最高。pH 值高于或低于7，水解度都會有所降低，這是因為每一種酶都有其最適pH 值，只有在合適的環(huán)境下，酶及底物蛋白質(zhì)的解離基團才處于易于結(jié)合并轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的解離狀態(tài)，否則酶的活性就會受到抑制，甚至失活。因此在酶解過程中，pH 值選擇6.5～7.5 較為合適。

2.5 酶解溫度的選擇

從圖4可以看出，溫度在40～50 ℃范圍內(nèi)，水解度一直處于上升狀態(tài)，這是因為在酶解溫度低于酶的最適溫度前，溫度對水解度的影響處于主導(dǎo)地位。隨著溫度的升高，分子運動劇烈，酶與底物的接觸機會增加，反應(yīng)速率加快，水解度升高。溫度為50 ℃時，水解度達到最高；50～55 ℃時，水解度趨于穩(wěn)定；但高于55 ℃時，水解度明顯下降，這是因為酶是一種活性蛋白質(zhì)，當溫度過高時，其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致其活性降低，反應(yīng)速率降低。因此，綜上分析酶解溫度選擇45～55 ℃較為適宜。

圖1 加酶量對水解度的影響Fig.1 Effects of enzyme amount on hydrolysis degree

圖2 酶解時間對水解度的影響Fig.2 Effects of enzymatic hydrolysis time on hydrolysis degree

圖3 pH 值對水解度的影響Fig.3 Effect of pH on hydrolysis degree

圖4 酶解溫度對水解度的影響Fig.4 Effect of temperature on enzymatic hydrolysis degree

2.6 響應(yīng)面試驗及方差分析

試驗設(shè)計及結(jié)果見表4，利用Design Expert 8.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，對各因素回歸擬合之后，得到回歸方程為：Y=+13.86+0.13X1-0.17X2+0.088X3+0.20X4+0.11X1X2-0.027X1X3+0.045X1X4+7.500×10-3X2X3-0.11X2X4-0.030X3X4-0.22X12-0.30X22-0.22X32-0.18X42。

由表5可知，模型P＜0.0001，說明響應(yīng)面回歸模型極顯著；失擬項P=0.4624＞0.05 不顯著，說明該回歸方程能較好的擬合真實的響應(yīng)面。從X1，X2，X3，X44 個因素對水解度的影響來看，因素X1，X2，X3，X4，X12，X22，X32，X42對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），X1X2，X2X3，X2X4，X3X4對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。通過比較方程一次項系數(shù)絕對值大小，可以判斷因素影響的主次性[15]，本試驗影響因素大小排序為X3＞X4＞X2＞X1。

分別將模型中的4 個因素兩兩固定，其中2個固定在0 水平，得到另外2 個因素交互作用對水解度Y 的子模型，圖5～10 為4 個因素兩兩交互對水解度影響的響應(yīng)面圖。

表4 風味蛋白酶酶解貽貝蒸煮液響應(yīng)面優(yōu)化試驗方案及結(jié)果Table 4 Optimization of the response surface of the flavored protease digestion of the mussel cooking liquor and its results

表5 水解度回歸模型方差分析表Table 5 Analysis of variance on degree of hydrolysis regression model

（續(xù)表5）

圖5 酶解溫度和pH 值交互作用的響應(yīng)面Fig.5 Response surface of enzymatic hydrolysis temperature and pH interaction

圖6 溫度和酶解時間交互作用的響應(yīng)面Fig.6 Response surface of temperature and enzymatic hydrolysis time interaction

圖7 酶解溫度和加酶量交互作用的響應(yīng)面Fig.7 Response surface of enzymatic hydrolysis temperature and enzyme addition amount interaction

圖8 pH 值和酶解時間交互作用的響應(yīng)面Fig.8 Response surface of pH and enzymatic hydrolysis time interaction

圖9 pH 值和加酶量交互作用的響應(yīng)面Fig.9 Response surface of pH and enzyme addition amount interaction

經(jīng)響應(yīng)面分析得到4 個影響因素的最佳組合為酶解溫度51.08 ℃，pH 6.87，酶解時間3.26 h，加酶量0.63%，預(yù)測的水解度為13.9805%。為了檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準確性，在溫度51 ℃，pH 6.9，酶解時間3.3 h，加酶量0.63%的酶解條件下進行試驗，測得水解度為14.01%，與預(yù)測值基本接近，表明預(yù)測值和真實值具有一定的擬合性，進一步驗證了模型的可行性。

圖10 酶解時間和加酶量交互作用的響應(yīng)面Fig.10 Response surface of time and enzyme addition amount interaction

2.7 風味成分分析

2.7.1 從響應(yīng)面試驗中挑選8 組不同水解度的樣品并選取最佳試驗條件為第9 組樣品進行風味分析。

表6 風味分析所用樣品列表Table 6 Sample list of flavor analysis

2.7.2 酶解后貽貝蒸煮液氣質(zhì)色譜圖及成分含量從表7中可以看出：樣品1 中檢測到47 種風味成分；樣品2 中檢測到43 種風味成分；樣品3 中檢測到45 種風味成分；樣品4 中檢測到42 種風味成分；樣品5 中檢測到48 種風味成分；樣品6中檢測到40 種風味成分；樣品7 中檢測到46 種風味成分；樣品8 中檢測到45 種風味成分；樣品9 中檢測到44 種風味成分。其中2-甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪、2-甲基-5-異丙基吡嗪、2-乙基-3，6-二甲基吡嗪、2，3-二乙基-5-甲基吡嗪、3，5-二甲基-2-丙基吡嗪、2-乙基-3，5，6-三甲基吡嗪、2，5-二甲基-3-（2-甲基丁基）吡嗪、2，5-二甲基-3-（3-甲基丁基）吡嗪、2-丁基-3，5-二甲基吡嗪、三甲胺、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、苯甲醛、糠醇、十三醇、2-壬酮、2，4-二叔丁基苯酚、乙酸甲酰酯、甲基環(huán)戊烯羧酸酯、甲氧基苯肟、2-乙?；量?，7-二甲基-1H-吲唑等24 種香氣成分在9 種樣品中都可以檢測到。

貽貝蒸煮液酶解后吡嗪類化合物的含量大大增加，高于其它種類化合物，成為主要化合物，這是因為熱加工過程中發(fā)生的美拉德反應(yīng)和熱解反應(yīng)以及酶解反應(yīng)，均可以產(chǎn)生吡嗪類化合物。從表7中可以看出，2，5-二甲基吡嗪和2-乙基-3，6-二甲基吡嗪在9 種樣品中的含量均超過10。其中2，5-二甲基吡嗪均超過20，是各樣品中含量最高的揮發(fā)性成分，其閾值較低，含有炒花生香氣和巧克力、奶油氣味等香氣，符合人們的嗅覺嗜好，因此是酶解反應(yīng)增香貢獻最大的物質(zhì)[16-18]。樣品9 中吡嗪類化合物含量最高，其次為樣品4，含量最低的是樣品6。

圖11 樣品1 的氣質(zhì)色譜圖Fig.11 Gas chromatogram of sample 1

圖12 樣品2 的氣質(zhì)色譜圖Fig.12 Gas chromatogram of sample 2

圖13 樣品3 的氣質(zhì)色譜圖Fig.13 Gas chromatogram of sample 3

圖14 樣品4 的氣質(zhì)色譜圖Fig.14 Gas chromatogram of sample 4

圖15 樣品5 的氣質(zhì)色譜圖Fig.15 Gas chromatogram of sample 5

圖16 樣品6 的氣質(zhì)色譜圖Fig.16 Gas chromatogram of sample 6

醛類物質(zhì)的閾值很低，盡管含量不高，但也對貽貝蒸煮液的風味產(chǎn)生了很大的影響[17]。然而，不同類型的醛類表現(xiàn)出不同的氣味，2-甲基丁醛和苯甲醛產(chǎn)生蠟香、香草等香氣，3-甲基丁醛具有類似植物的清香特征。在所有樣品中，樣品9 醛類化合物的含量最高，其次為樣品1，這2 種樣品醛類化合物的含量遙遙領(lǐng)先其它樣品。碳氫類化合物的閾值很高，對酶解液的整體風味貢獻不大。

圖17 樣品7 的氣質(zhì)色譜圖Fig.17 Gas chromatogram of sample 7

圖18 樣品8 的氣質(zhì)色譜圖Fig.18 Gas chromatogram of the sample 8

圖19 樣品9 的氣質(zhì)色譜圖Fig.19 Gas chromatogram of the sample 9

呋喃、吡咯、噻唑等雜環(huán)類物質(zhì)閾值極低，對酶解液風味有較大的貢獻[19]。呋喃類物質(zhì)是一種非常典型的風味物質(zhì)，具有很強的肉香味，它主要是由糖分解和美拉德反應(yīng)生成，主要貢獻豆香、甜香、焦糖香等氣味[20]。這幾種化合物在樣品9 中都含有，雖然含量很少但是閾值低，因此對蒸煮液的風味也有一定的貢獻。

醇類化合物大部分是由脂質(zhì)氧化分解形成的。在檢測出來的醇類化合物中，糠醇的含量最高，其閾值很低為0.4，具有甜香、發(fā)酵香氣等風味成分[21]，對貽貝蒸煮液的風味有一定的貢獻，經(jīng)常作為食品添加劑的原料，是一種增香劑。飽和脂肪醇的閾值都很高，含量不高時對酶解液的風味無影響，但不飽和脂肪醇的閾值很低，對酶解液的風味有很大貢獻[22-23]。在所有樣品中，樣品5 的醇類化合物含量最高，其次為樣品9。

從風味方面來看，樣品9 檢測出來的峰數(shù)量最多，對貽貝蒸煮液風味起重要作用的醛類化合物和吡嗪類化合物含量相較其它樣品更高；從水解度方面來看，9 號樣品的水解度也高于其它樣品，因此認為樣品9 是最佳樣品。

表7 9 種樣品揮發(fā)性成分含量Table 7 Volatile component content of nine kinds of sample

3 結(jié)論

以貽貝蒸煮液為原料，比較風味蛋白酶、胰蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶4 種酶水解貽貝蒸煮液的能力，篩選出風味蛋白酶為最適蛋白酶。在單因素試驗的基礎(chǔ)上確定酶解各因素的最適范圍，以水解度為指標，采用響應(yīng)面分析法確定酶解的最佳條件為：加酶量0.63%，溫度51 ℃，酶解時間3.26 h，pH 6.87。根據(jù)正交試驗方法從響應(yīng)面分析設(shè)計的樣品中挑選了8 組不同水解度并且具有代表性的試驗樣品與酶解最佳條件的樣品進行風味分析。由于樣品9 中對風味起決定性作用的醛類和吡嗪類化合物的含量均位于第一，而且其測出的峰個數(shù)和風味成分含量都是最高的，因此確定樣品9 為最佳樣品。