反復(fù)凍融對葡萄酒中酚類物質(zhì)的影響

趙 旭，趙培汝，張欣珂，何 非*

（1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 葡萄與葡萄酒研究中心 北京100083 2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部葡萄酒加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100083）

葡萄酒作為人類最古老的酒精飲料之一[1]，因獨(dú)特的口感與廣泛的保健功能而深受世界各地消費(fèi)者的喜愛。近年來，全球葡萄酒消費(fèi)量逐步上升，特別是中國葡萄酒消費(fèi)市場的增長尤為迅速。2015年我國葡萄酒消費(fèi)量已超過16 億L，高居世界第5 位。

“法國悖論”的產(chǎn)生以及白藜蘆醇的發(fā)現(xiàn)[2]使世人認(rèn)識(shí)到葡萄酒的健康功能，并展開了深入的研究[3-5]。與其它酒精飲料不同，葡萄酒中含有極為豐富的酚類物質(zhì)[6-7]，根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為類黃酮類物質(zhì)和非類黃酮類物質(zhì)[8]。前者主要包括花色苷、黃烷醇和黃酮醇類物質(zhì)，后者主要包括酚酸、酚醛和芪類物質(zhì)。它們主要來源于釀造葡萄酒的葡萄果實(shí)與陳釀過程中使用的橡木桶，在釀造過程中不斷地融入葡萄酒中[9]，成為葡萄酒健康功能最重要的組成部分。大量研究報(bào)道，適度飲用葡萄酒對人體健康有益[10]，不僅可以預(yù)防心血管疾病[11]，還具有抗氧化[12]、抗輻射、抗突變以及抗菌[13]等功效。除此之外，酚類物質(zhì)也決定葡萄酒的感官特性。其中，花色苷是葡萄酒中關(guān)鍵的呈色物質(zhì)[14]；黃烷醇類物質(zhì)具有苦味和收斂感（澀感）[15]；黃酮醇類物質(zhì)除了可以為葡萄酒貢獻(xiàn)黃色色調(diào)和苦味，也可以通過輔色效應(yīng)改善紅葡萄酒的顏色[16]；酚醛和酚酸等物質(zhì)不僅能夠改善葡萄酒的風(fēng)味，也可以作為輔色素保護(hù)紅葡萄酒的顏色[17]。

絕大部分葡萄酒的冰點(diǎn)在-4～-8 ℃之間，并隨酒精度的升高而下降[18]。由于運(yùn)輸條件的限制，恒溫設(shè)施尚未普及，在冬季或寒冷地區(qū)運(yùn)輸葡萄酒時(shí)，瓶裝酒可能會(huì)因長時(shí)間暴露于低于冰點(diǎn)的溫度而結(jié)冰，嚴(yán)重時(shí)會(huì)爆塞。在長途運(yùn)輸過程中，葡萄酒還可能會(huì)經(jīng)歷反復(fù)的凍融，極大地破壞葡萄酒的感官品質(zhì)，也會(huì)造成營養(yǎng)價(jià)值的損失，故分析葡萄酒中的酚類物質(zhì)對于研究和生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)葡萄酒都具有十分重要的意義。然而，目前在檢測葡萄酒時(shí)，對采集的大量樣品往往不能即時(shí)檢測，通常會(huì)用冷凍的方式保存一段時(shí)間，待各方面條件準(zhǔn)備充分時(shí)解凍后檢測。在某些特殊情況下，同一葡萄酒樣品還可能會(huì)經(jīng)多次的反復(fù)凍融。反復(fù)的凍融循環(huán)不同于一般的冷凍儲(chǔ)存，在多次融化過程中溫度的突然升高可能會(huì)引發(fā)一系列的化學(xué)反應(yīng)。Chacónrodríguez[19]研究發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)存過程中溫度的波動(dòng)會(huì)對葡萄酒的感官品質(zhì)、貨架期以及營養(yǎng)價(jià)值等產(chǎn)生明顯的負(fù)面作用。

酚類物質(zhì)在凍融過程中的變化機(jī)制目前尚不明確。反復(fù)凍融會(huì)對葡萄酒中的酚類物質(zhì)及其品質(zhì)產(chǎn)生何種影響亟待深入研究。本研究通過不同葡萄酒樣品不同次數(shù)的反復(fù)凍融試驗(yàn)，探究其對葡萄酒中主要酚類物質(zhì)的影響，為葡萄酒的生產(chǎn)及儲(chǔ)運(yùn)提供一定的技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

本研究選用8 款市售葡萄酒，包括5 款干紅葡萄酒與3 款干白葡萄酒，葡萄酒的年份、產(chǎn)地以及葡萄品種信息如表1所示。

表1 試驗(yàn)所用葡萄酒的葡萄品種、年份以及產(chǎn)地信息Table 1 Grape varieties，vintages and growing regions information of the wines for the experiment

1.2 試驗(yàn)試劑

花色苷標(biāo)準(zhǔn)品，包括花青素-3-O-葡萄糖苷（Cyanidin-3-O-glucoside）、花翠素-3-O-葡萄糖苷（Delphinidin-3-O-glucoside）、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷（Peonidin-3-O-glucoside）、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷（Petunidin-3-O-glucoside）、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷 （Marvidin-3-O-glucoside）等；非花色苷酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，包括兒茶素（Catechin）、表兒茶素 （Epicatechin）、原兒茶酸（Protocatechuic acid）、4-羥基苯甲酸（4-Hydroxybenzoic acid）、4-羥基肉桂酸（4-Hydroxycinnamic acid）、咖啡酸 （Caffeic acid）、芥子酸（Sinapic acid）、阿魏酸（Ferulaic acid）、槲皮素（Quercetin）等均購于美國Sigama-Aidrich 公司。其它酚類物質(zhì)提取試劑及液相色譜流動(dòng)相所用試劑，如甲醇、甲酸、乙腈等均為色譜純級，采購于美國Fisher 公司。

1.3 試驗(yàn)儀器、設(shè)備

1200 系列高效液相色譜-6410 系列三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 （配有G1322A 真空脫氣機(jī)、G1312B 二元高壓梯度泵、G1367C 自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316B 柱溫箱、G1314C VWD 檢測器）、Poroshell 120 EC-C18 色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.7 μm）、安捷倫液相上樣瓶，美國安捷倫科技有限公司；一次性使用無菌注射器（1 mL），上海治宇醫(yī)療器械有限公司；一次性孔徑0.45 μm 聚醚砜微孔濾膜，天津津騰有限公司；50 mL 透明PET 分裝瓶，北京生物技術(shù)公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品的采集及編號 將8 款葡萄酒按照表1中的順序分別編號為紅1、紅2、紅3、紅4、紅5、白1、白2、白3。取45 mL 酒樣于50 mL 透明、密封的塑料瓶中，以盡量減少瓶中氧氣對酒樣的影響，并避免取樣體積過大導(dǎo)致溢出或者脹瓶。每款酒取15 份，分別編號為A，B，C，D，E，每個(gè)編號設(shè)置3 個(gè)平行。

1.4.2 凍融循環(huán)處理 取出酒樣進(jìn)行即時(shí)檢測，隨后將所有酒樣放置于-20 ℃冷柜中保存。為探究反復(fù)凍融對葡萄酒中酚類物質(zhì)的影響，每次凍融循環(huán)處理的時(shí)間間隔設(shè)置為24 h，盡量減少長時(shí)間冷凍儲(chǔ)存對酚類物質(zhì)造成的影響。全部解凍過程在室溫條件下進(jìn)行（25 ℃），具體凍融流程如圖1所示。待第5 次凍融循環(huán)完成后立即同時(shí)檢測所有酒樣，減小儀器狀態(tài)波動(dòng)對檢測結(jié)果的影響。

圖1 酒樣凍融循環(huán)處理流程圖Fig.1 The flow diagram of freeze-thaw cycle of wine samples

1.4.3 酚類物質(zhì)的檢測

1）花色苷的檢測：樣品測定前經(jīng)0.45 μm 聚醚砜濾膜過濾，進(jìn)樣量5 μL。洗脫采用的流動(dòng)相為0.1%的甲酸水溶液作為A 相，含0.1%甲酸的甲醇乙腈溶液（體積比1∶1）作為B 相。洗脫程序?yàn)?0%～100%的B 相持續(xù)10 min，后運(yùn)行程序5 min。流動(dòng)相流速為0.4 mL/min。柱溫箱溫度控制在55 ℃。質(zhì)譜采用ESI 離子源，正離子模式，噴霧電壓為4 kV，離子源溫度為150 ℃，干燥氣溫度為350 ℃，流量為12 L/h，霧化器壓力為35 psi。檢測器設(shè)置為多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）。花色苷的定性依據(jù)為本實(shí)驗(yàn)室所建立的花色苷母離子譜庫和經(jīng)過碰撞誘導(dǎo)裂解（CID）產(chǎn)生的碎片離子譜庫。

2）非花色苷酚類物質(zhì)的檢測：試驗(yàn)所采用的液相系統(tǒng)和質(zhì)譜系統(tǒng)與花色苷的檢測相同。洗脫程序?yàn)?0%～100%的B 相持續(xù)25 min，后運(yùn)行程序5 min，離子源采用負(fù)離子模式，其余參數(shù)均與花色苷的檢測相同。各酚類物質(zhì)的定性依據(jù)為本實(shí)驗(yàn)室所建立的非花色苷酚類物質(zhì)母離子譜庫和經(jīng)過碰撞誘導(dǎo)裂解（CID）產(chǎn)生的子離子譜庫。

1.5 數(shù)據(jù)處理

檢測結(jié)果在安捷倫軟件Mass Hunter 上分析，采用外標(biāo)法定量，各花色苷及其衍生物含量均以含有相同花色素基元的3-O-葡萄糖苷單體標(biāo)準(zhǔn)品的含量計(jì)算，各非花色苷酚的含量均以相應(yīng)的非花色苷酚標(biāo)準(zhǔn)品的含量計(jì)算，各酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均在0.9996～0.9998 之間，表明各酚類物質(zhì)在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系較好。

應(yīng)用SPSS 20.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）軟件進(jìn)行LSD 分析和鄧肯法多重比較，比較每款酒中的酚類物質(zhì)在不同凍融次數(shù)條件下的差異，所有顯著性分析均基于P＜0.05 顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 反復(fù)凍融對葡萄酒中花色苷的影響

通過本課題組建立的葡萄酒中常見花色苷母離子譜庫和經(jīng)過碰撞誘導(dǎo)裂解（CID）產(chǎn)生的碎片離子譜庫[20]，共靶標(biāo)性地檢測出花色苷類成分15種。其中，3-O-單葡萄糖苷類花色苷5 種，6-O-乙?；苌?-O-單葡萄糖苷類花色苷5 種，6-O-香豆?；苌?-O-單葡萄糖苷類花色苷5種，不同花色苷液相色譜與質(zhì)譜信息如表2所示。

表2 花色苷液相色譜及質(zhì)譜信息Table 2 Chromatographic and mass spectral data of anthocyanins

（續(xù)表2）

由于白葡萄酒中不含花色苷或花色苷含量極少，幾乎檢測不到，在此忽略不計(jì)，僅討論紅葡萄酒中的花色苷含量隨凍融循環(huán)過程的變化。

葡萄酒中花色苷的穩(wěn)定性受多種因素的影響，如光照、氧氣、溫度、酶（多酚氧化酶、過氧化物酶等）、pH 值、酒精度、輔色作用等。光照、氧氣、較高的溫度[21-22]、pH 值[23]與酒精度[24-26]均會(huì)加速花色苷的降解，對葡萄酒顏色的保持產(chǎn)生消極影響；多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）在有氧條件下催化單酚形成鄰苯二酚，鄰苯二酚氧化形成相應(yīng)的鄰醌或醌[27]，盡管花色苷不能直接作為PPO 的底物，但是其它多酚（如兒茶素、綠原酸、咖啡酰酒石酸等）被酶促氧化后形成的醌極易與花色苷結(jié)合，進(jìn)而使其氧化降解或者發(fā)生聚合反應(yīng)[28-29]，造成單體花色苷含量減少；而輔色作用能夠有效保護(hù)烊鹽離子，對花色苷的穩(wěn)定起到十分重要的保護(hù)作用[30-32]。Avizcuri 等[33]發(fā)現(xiàn)葡萄酒中總酚含量越高，花色苷的降解速率越慢，這可能是由于包含其它酚類物質(zhì)的總酚作為整體所表現(xiàn)出的抗氧化性對花色苷起到了一定的保護(hù)作用。

由表3可以發(fā)現(xiàn)，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，干紅葡萄酒中總花色苷的含量大體呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢（P＜0.05），推測在此過程中可能形成各種促氧化成分如自由基等使花色苷分子氧化降解[34]。經(jīng)過5 次凍融循環(huán)之后，樣品中花色苷含量與未經(jīng)凍融組相比差異十分明顯，平均下降比例接近17%。Kirca 等[35]發(fā)現(xiàn)，在較低的儲(chǔ)存溫度下，花色苷仍然會(huì)以較低的速率發(fā)生降解反應(yīng)，而在瓶中充入惰性氣體可以進(jìn)一步減緩其降解速率，這可能是由于在凍融過程中，酒中的多酚氧化酶與瓶中殘留的氧氣共同作用從而促使花色苷降解，尤其是酒樣在解凍時(shí)溫度升高，可能激活了殘存酶的催化反應(yīng)。此外，花色苷含量下降的原因也可能是與酒中其它酚類物質(zhì)（如黃烷-3-醇、原花色素、酚酸等）或者小分子成分（如乙醛、丙酮酸等）發(fā)生了聚合反應(yīng)[36-38]，導(dǎo)致單體花色苷含量下降。

此外，凍融循環(huán)處理對不同結(jié)構(gòu)花色苷的影響程度不同，體現(xiàn)在不同種類花色苷在凍融循環(huán)過程中的降解率存在差異。在所有紅葡萄酒樣品中，?；ㄉ盏慕到饴示陀谖歹；幕ㄉ?，這是由于酰化基團(tuán)與花色苷的吡喃環(huán)在空間中相互堆疊，可對花色苷分子起到保護(hù)作用，提高了其對水分子親核攻擊的抵抗性，從而使花色苷分子更加穩(wěn)定[39-40]。

Johnson 等[41]以美洲接骨木果汁為研究對象，連續(xù)進(jìn)行4 次凍融循環(huán)處理，每次間隔時(shí)間為1 d，與本試驗(yàn)的處理過程類似，結(jié)果卻沒有發(fā)現(xiàn)總花色苷含量有明顯的變化，可能與試驗(yàn)對象和檢測方法的差異有關(guān)。首先，美洲接骨木果實(shí)中花色苷的組成與葡萄存在極大的區(qū)別，果汁體系也與葡萄酒相差較大；在花色苷的檢測方法上，Mitch采用pH 值示差法，而本文應(yīng)用的是更為準(zhǔn)確、直觀的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，相較于pH 值示差法能夠更加真實(shí)地反映花色苷的含量。除此之外，樣品暴露于室溫時(shí)的融化時(shí)間不同可能也會(huì)對花色苷含量造成影響。

表3 總花色苷含量在凍融過程中的變化（mg/L）Table 3 Changes in the content of total anthocyanins after freeze-thaw actions （mg/L）

表4 未酰化花色苷與?；ㄉ赵趦鋈谶^程中的平均降解率Table 4 Average degradation rate of non-acylated and acylated anthocyanins in the freeze-thaw actions

2.2 反復(fù)凍融對葡萄酒中非花色苷酚類物質(zhì)的影響

通過本課題組建立的葡萄酒中常見非花色苷酚類物質(zhì)母離子譜庫和經(jīng)過碰撞誘導(dǎo)裂解（CID）產(chǎn)生的碎片離子譜庫，共靶標(biāo)性地檢測出非花色苷類成分35 種，不同非花色苷酚類物質(zhì)液相色譜與質(zhì)譜信息如表5所示。

由表6可知，反復(fù)凍融處理對不同類型葡萄酒中非花色苷酚類物質(zhì)總量的影響有所不同。由于生產(chǎn)工藝的差異導(dǎo)致白葡萄酒中的非花色苷酚類物質(zhì)含量低于紅葡萄酒，且在5 次凍融循環(huán)過程中沒有發(fā)生顯著性變化（P＞0.05）；對于紅葡萄酒而言，非花色苷酚類物質(zhì)總量在凍融處理過程中反而出現(xiàn)了增加的現(xiàn)象，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這是由紅葡萄酒中表兒茶素、兒茶素和沒食子酸的含量上升同時(shí)其它非花色苷酚類物質(zhì)含量基本保持不變所致。推測紅葡萄酒中表兒茶素與兒茶素的增加與原花色素（縮合單寧）的裂解有關(guān)，并且因?yàn)闄z測到的二聚體原花色素B1，B2，C1 的含量基本保持不變，所以發(fā)生裂解的可能是聚合度更高的大分子原花色素，而沒食子酸的增加可能與沒食子單寧的水解有關(guān)。由于缺少浸漬過程或者浸漬程度很低決定了白葡萄酒中原花色素與沒食子單寧的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于紅葡萄酒，因此在凍融過程中白葡萄酒中的兒茶素、表兒茶素和沒食子酸含量幾乎沒有發(fā)生變化，即由前體聚合物降解形成的該類單體酚物質(zhì)的量微乎其微，所以非花色苷酚類物質(zhì)總量也基本保持不變。Zafrilla 等[42]對20 ℃、避光保存的葡萄酒進(jìn)行了為期7 個(gè)月的跟蹤監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)葡萄酒中的非花色苷酚總量沒有發(fā)生顯著變化。Oancea 等[43]發(fā)現(xiàn)在冷凍儲(chǔ)存的過程中，非花色苷酚的降解速率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于花色苷，這可能是由于非花色苷酚的穩(wěn)定性高于花色苷造成的。本文的結(jié)果與前人研究相似，在反復(fù)凍融過程中，除單寧類物質(zhì)可能發(fā)生降解產(chǎn)生某些單體酚之外，其它非花色苷酚類物質(zhì)幾乎不受影響。

表5 非花色苷酚類物質(zhì)液相色譜與質(zhì)譜信息Table 5 Chromatographic and mass spectral data of non-anthocyanin phenolic compounds

表6 非花色苷酚類物質(zhì)總量在凍融過程中的變化（mg/L）Table 6 Changes in the contents of non-anthocyanin phenolic compounds in freeze-thaw actions （mg/L）

3 結(jié)論

本文研究了葡萄酒中的酚類物質(zhì)在反復(fù)凍融過程中的變化。結(jié)果表明，花色苷類成分的含量在反復(fù)凍融過程中顯著減少，經(jīng)過5 次凍融循環(huán)之后，花色苷總量相較凍融之前平均下降比例達(dá)到17%。此外，由于酰基化花色苷的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，其降解率低于未?；幕ㄉ铡３承﹩螌庮愇镔|(zhì)可能發(fā)生降解產(chǎn)生單體酚之外，其它非花色苷酚類物質(zhì)幾乎不受凍融的影響。本試驗(yàn)結(jié)果說明反復(fù)凍融處理會(huì)對葡萄酒中的酚類物質(zhì)（主要是花色苷及單寧）造成一定的影響，導(dǎo)致葡萄酒感官品質(zhì)與營養(yǎng)價(jià)值降低。因此，在葡萄酒的生產(chǎn)、消費(fèi)以及科學(xué)研究過程中，應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融，從而保證葡萄酒的品質(zhì)和研究結(jié)果的可靠性。