加味小陷胸湯基于核因子-κB信號通路對非小細胞肺癌荷瘤小鼠的影響實驗研究

鄭 陽，宿 濛，陳 濤，王永鵬

(1.遼寧省腫瘤醫(yī)院檢驗科，遼寧 沈陽 110000；2.遼寧省腫瘤醫(yī)院消化科，遼寧 沈陽 110000；3.遼寧省腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸外科，遼寧 沈陽 110000)

非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)包括鱗狀細胞癌、腺癌以及大細胞癌，占所有肺癌的85%左右[1]，是臨床最常見的肺癌病理類型。流行病學(xué)資料顯示，全球每年有約160萬新發(fā)肺癌患者，發(fā)病標(biāo)化率約為36.09/10萬，我國屬于肺癌的高發(fā)地區(qū)，發(fā)病標(biāo)化率為36.19/10萬[2-3]，而且近年來隨著環(huán)境惡化、生活壓力增大等發(fā)病率不斷增加，造成沉重的社會負擔(dān)。相較于小細胞肺癌，NSCLC的惡性程度稍低，但是75%的患者確診時已經(jīng)處于中晚期，失去了手術(shù)治療時機，化療、放療、免疫治療、分子靶向治療等雖然能一定程度上讓患者獲益，但不良反應(yīng)明顯，臨床療效仍不理想[4]，探索新的有效的藥物是NSCLC研究的重點。目前研究發(fā)現(xiàn)[5]，中藥復(fù)方在NSCLC中有多靶點的作用，不僅能緩解癥狀、提高患者生活質(zhì)量，還在抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、延長生存期方面有一定效果，故受到越來越多的關(guān)注。本次研究即主要探討中藥復(fù)方加味小陷胸湯基于核因子-κB(NF-κB)信號通路對NSCLC荷瘤小鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 研究對象：SPF級健康C57BL/6小鼠[由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所提供，動物許可證號：SCXK(京)2014-0011]75只，均為雄性，周齡為7～8周，體重20～24 g，平均(22.05±1.13)g。所有小鼠置于恒溫21～22 ℃，恒濕55%～65%，安靜通風(fēng)的動物飼養(yǎng)室內(nèi)進行適應(yīng)性飼養(yǎng)，時間為5 d期間飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料和蒸餾水。

1.1.2 主要材料、藥品與試劑：人非小細胞肺癌A549細胞株，品牌：ATCC，購自北京中原公司。加味小陷胸湯，藥物組成：黃連、姜半夏、瓜蔞、守宮、三七、大黃、白花蛇舌草、人參、白術(shù)、薏苡仁，藥物購自北京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，上述藥物中守宮研末，人參另煎，其余藥物加水浸泡60 min，采用煎藥機后進行2次煎煮、濃縮，按比例加入守宮末、人參藥液混勻，制成生藥濃度為8、16 g/ml的加味小陷胸湯藥液，置于4 ℃冰箱保存；注射用順鉑，規(guī)格：每支10 mg，生產(chǎn)批號：20180321，齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，使用時用無菌生理鹽水配制成濃度為0.4 mg/ml的順鉑溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。流式細胞凋亡檢測試劑盒(雙染色)，購自杭州倍沃醫(yī)學(xué)科技有限公司；即用型SP免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液，購自武漢純度生物科技有限公司；組織蛋白裂解液，購自齊一生物科技(上海)有限公司；兔抗小鼠含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、核因子-κB(NF-κB)、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G(灌胃G-HRP)，購自上海恒斐生物科技有限公司；SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒，購自長沙達爾鋒生物科技有限公司；ECL發(fā)光液，購自北京欣華綠源科技有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備：5920R型離心機，德國Eppendorf公司生產(chǎn)；FACSCalibur型流式細胞儀，美國BD公司生產(chǎn)；DM500型光學(xué)顯微鏡，德國Leica公司生產(chǎn)；E-Gel Imager凝膠成像儀、Fisher Biotech型電泳儀，美國Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模及實驗方法[6]:取出非小細胞肺癌A549細胞株解凍、復(fù)蘇，接種于DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待其生長至對數(shù)生長期，采用0.25%胰蛋白酶進行消化，以1200 r/min速度離心10 min，用無菌PBS重懸細胞制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×107個/ml。將所有小鼠編號，隨機分為對照組15只和造模組60只。小鼠右側(cè)腋下消毒，造模組予以單細胞懸液0.2 ml皮下接種，對照組予以無菌生理鹽水0.2 ml皮下注射；繼續(xù)飼養(yǎng)小鼠，待皮下結(jié)節(jié)長徑生長至8 mm左右，即為成功建立非小細胞肺癌荷瘤模型，本研究中造模組所有小鼠均造模成功。

將造模成功的小鼠隨機分為模型組、加味小陷胸湯低、高濃度組和順鉑組，各15只。模型組和對照組分別予以無菌生理鹽水5 ml/kg，腹腔注射，1次/d+蒸餾水5 ml/kg，灌胃，1次/d；加味小陷胸湯低、高濃度組分別予以無菌生理鹽水5 ml/kg，腹腔注射，1次/d+8、16 mg/ml加味小陷胸湯藥液5 ml/kg，灌胃，1次/d；順鉑組予以0.4 mg/ml順鉑溶液5 ml/kg ，腹腔注射，1次/d +蒸餾水5 ml/kg，灌胃，1次/d。所有小鼠均連續(xù)給藥14 d。

1.2.2 標(biāo)本采集與處理[7]：末次給藥次日，采用游標(biāo)卡尺測量腫瘤組織長徑(X)及短徑(Y)，然后脫頸椎處死小鼠，完整取出腫瘤組織稱重，取1/3腫瘤組織(對照組正常組織)用4 %多聚甲醛固定24 h，流水沖洗，依次經(jīng)70%、80%、90%、100%、100%乙醇脫水及二甲苯透明后，用石蠟包埋，切片機切制4 μm切片，60 ℃恒溫烤片2 h后，保存于37 ℃溫箱內(nèi)；取1/3腫瘤組織(對照組正常組織)切成3 mm左右碎塊，-80 ℃凍存以備蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢測；剩余腫瘤組織(對照組正常組織)立即進行細胞凋亡檢測。

1.2.3 腫瘤體積及抑瘤率計算[8]：腫瘤體積=π×X×Y2/6；生長抑瘤率=(1-治療組平均瘤重/模型組平均瘤重)×100%。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測小鼠腫瘤組織細胞凋亡情況[9]：用眼科剪將1.2.2中剩余的腫瘤組織剪碎，加入少量生理鹽水，過300目尼龍網(wǎng)，以1000 r/min速度離心5 min，取細胞沉淀；采用無菌生理鹽水重懸細胞并將濃度調(diào)整為1×105個/ml；4 ℃條件下，取細胞懸液1 ml，以1000 r/min速度離心5 min，細胞沉淀采用預(yù)冷的PBS重懸，以1000 r/min速度離心10 min后，重復(fù)該步驟2次；按照流式細胞凋亡檢測試劑盒說明書中的步驟，采用結(jié)合緩沖液500 μl重懸細胞并避光反應(yīng)10 min，之后滴加FITC標(biāo)記的Annexin V、碘化丙啶各5 μl，4 ℃孵育30 min；采用FACSCalibur型流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.2.5 免疫組化法檢測小鼠腫瘤組織Caspase-3蛋白表達水平[9]：取1.2.2中保存的組織切片，按照免疫組化試劑盒說明書中的步驟，將切片脫蠟、水化，用3%過氧化氫處理10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶；PBS洗片后用正常山羊血清工作液室溫封閉15 min；之后用Caspase-3一抗工作液(1∶50稀釋)37 ℃孵育切片1 h；PBS洗片后，用生物素標(biāo)記的二抗工作液(1∶100稀釋)室溫孵育切片15 min；PBS洗片后，用辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液室溫孵育切片15 min；PBS洗片后，用DAB顯色液室溫顯色8 min；自來水洗片后，依次經(jīng)蘇木素染色液復(fù)染20 s、1%鹽酸酒精分化、自來水返藍，完成后中性樹膠封片。

結(jié)果判定：在顯微鏡下，Caspase-3表達陽性細胞被染成棕黃色。每張切片隨機選擇5個400倍視野拍照，并用Image-pro Plus圖像分析軟件分析Caspase-3表達的平均光密度(IOD)值。

1.2.6 Western blot法檢測小鼠腫瘤組織NF-κB、Bcl-2、Bax蛋白表達水平[10]：取1.2.2中凍存的組織(對照組等量正常組織)，冰浴研磨勻漿，用組織蛋白裂解液300 μl搖動裂解10 min；加入蛋白酶抑制劑后，4 ℃以15000 r/min速度離心20 min；取上清液與蛋白上樣液1∶1體積混勻，然后與2×上樣緩沖液混勻，100 ℃加熱5 min使蛋白變性，冷卻后準(zhǔn)備上樣；用試劑盒配制SDS-PAGE凝膠并固定在電泳裝置上；上樣，開始電泳分離蛋白，直至溴酚藍抵達分離膠底部；取下凝膠轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素(NC)膜上；用5 %脫脂奶粉室溫封閉NC膜1 h；TBST洗膜后，用NF-κB、Bcl-2、Bax、內(nèi)參β-actin(1∶500稀釋)一抗工作液，室溫震蕩孵育1 h；TBST洗膜后，用HRP標(biāo)記山羊抗兔灌胃G二抗(1∶1000稀釋)，室溫孵育1.5 h；TBST洗膜后，暗室內(nèi)用ECL發(fā)光液使蛋白條帶發(fā)光，X光膠片曝光、顯影、定影后，晾干。

采用E-Gel Imager凝膠成像儀掃描并采集蛋白條帶圖像，利用Image-pro Plus圖像分析軟件分析各蛋白條帶灰度值，并計算NF-κB、Bcl-2、Bax相對β-actin的表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)均統(tǒng)一整理，采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件包分析，符合正態(tài)性的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠腫瘤體積、瘤重和生長抑制率比較 與模型組比較，加味小陷胸湯低、高濃度組及順鉑組小鼠腫瘤體積、瘤重較低，且加味小陷胸湯低濃度組高于加味小陷胸湯高濃度組和順鉑組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。腫瘤生長抑制率比較顯示，加味小陷胸湯低濃度組低于加味小陷胸湯高濃度組和順鉑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1 。

表1 各組小鼠腫瘤體積、瘤重和生長抑制率比較

2.2 各組小鼠腫瘤組織細胞凋亡率比較 與模型組比較，加味小陷胸湯低、高濃度組及順鉑組腫瘤組織細胞凋亡率較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與加味小陷胸湯低濃度組比較，加味小陷胸湯高濃度組和順鉑組，細胞凋亡率低于加味小陷胸湯低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2(圖1)。

表2 各組小鼠腫瘤組織細胞凋亡率比較(%)

A:模型組；B:加味小陷胸湯低濃度組；C:加味小陷胸湯高濃度組；D:順鉑組

2.3 各組小鼠腫瘤組織Caspase-3蛋白表達水平比較 免疫組化染色結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組小鼠腫瘤組織Caspase-3蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，加味小陷胸湯低、高濃度組及順鉑組小鼠腫瘤組織Caspase-3蛋白表達水平較高，且加味小陷胸湯低濃度組低于加味小陷胸湯高濃度組和順鉑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 見表3(圖2)。

表3 各組小鼠腫瘤組織Caspase-3蛋白表達水平比較(IOD)

A:對照組；B:模型組；C:加味小陷胸湯低濃度組；D:加味小陷胸湯高濃度組；E：順鉑組

2.4 各組小鼠腫瘤組織NF-κB、Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較 與對照組比較，模型組小鼠腫瘤組織NF-κB、Bcl-2蛋白表達水平升高，Bax蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，加味小陷胸湯低、高濃度組及順鉑組小鼠腫瘤組織NF-κB、Bcl-2蛋白表達水平較低，且加味小陷胸湯低濃度組高于加味小陷胸湯高濃度組和順鉑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，加味小陷胸湯低、高濃度組及順鉑組小鼠腫瘤組織Bax蛋白表達水平較高，且加味小陷胸湯低濃度組低于加味小陷胸湯高濃度組和順鉑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4(圖3)。

表4 各組小鼠腫瘤組織NF-κB、Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較

A:對照組;B:模型組;C:加味小陷胸湯低濃度組；D:加味小陷胸湯高濃度組；E:順鉑組

3 討 論

非小細胞肺癌已經(jīng)成為威脅人類生命的常見主要疾病之一，近年來隨著化療藥物、腫瘤基因、分子生物學(xué)等方面研究的不斷發(fā)展，臨床治療NSCLC的水平也在不斷提高，也促使人們將治療觀念由標(biāo)準(zhǔn)化治療轉(zhuǎn)向個體化、個性化治療[11]。中醫(yī)從整體觀念出發(fā)，講究辨證論治，曲萌等[12]研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥可以通過免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤細胞增殖并促進凋亡、抑制血管形成、抑制細胞轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥等機制發(fā)揮抗肺癌的作用。可見，中醫(yī)藥治療肺癌具有多環(huán)節(jié)、多靶點、多途徑調(diào)控的優(yōu)點，值得深入研究。

在中醫(yī)理論中，NSCLC屬于“肺壅”“肺積”“肺巖”“息賁”等范疇，其病位在肺，為虛實夾雜之證，素體正氣不足，邪毒侵肺，氣血陰陽紊亂，臟腑功能失調(diào)，熱毒、痰、瘀內(nèi)生，結(jié)于胸中，發(fā)為本病[13]，治療上應(yīng)祛邪、扶正并重。在本次研究中，我們采用加味小陷胸湯對NSCLC荷瘤小鼠模型進行治療，小陷胸湯出自張仲景的《傷寒論·辨太陽病脈癥并治》，屬于經(jīng)典的祛痰劑，常用于治療痰熱互結(jié)之結(jié)胸證，本次藥物在其基礎(chǔ)上加味而成，方中黃連大苦大寒，可清熱燥濕、瀉火解毒，大黃苦寒，能瀉熱毒、破積滯、行瘀血，白花蛇舌草苦淡寒，有清熱解毒、消痛散結(jié)之效，三藥均可清熱解毒逐瘀；姜半夏辛溫，能降逆化痰散結(jié)，瓜蔞甘寒，可清熱滌痰，寬胸散結(jié)，二者善祛痰散結(jié)；守宮咸寒有小毒，能止咳平喘、解毒通絡(luò)散結(jié)；三七可活血通脈、散瘀止痛；人參、白術(shù)、薏苡仁則功在健脾益氣、扶正補虛；諸藥合用，既可扶助正氣，又可奏清熱毒、祛痰濁、破瘀結(jié)之效。

現(xiàn)代藥理研究顯示[13-15]，黃連、大黃、白花蛇舌草及其相應(yīng)的活性成分黃連素、大黃素、白花蛇舌草黃酮苷等，均有較好的抗腫瘤作用。小陷胸湯能夠在體外有效阻滯肺癌A549及H1299細胞生長、增殖并降低其轉(zhuǎn)移能力，同時在體內(nèi)抑制肺癌小鼠異體移植模型腫瘤生長。本研究中小鼠經(jīng)相應(yīng)藥物處理后，與模型組比較，加味小陷胸湯低、高濃度組及順鉑組小鼠腫瘤體積、瘤重較低，腫瘤生長抑制率較高，且加味小陷胸湯高濃度組和順鉑組改變較為明顯，表明加味小陷胸湯能有效抑制人NSCLC細胞荷瘤小鼠腫瘤組織的生長，發(fā)揮較好的抗腫瘤作用，而且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，藥物濃度越高，作用效果越明顯。

細胞凋亡為細胞主動死亡的一種形式，對于維持機體細胞數(shù)量的恒定有重要的意義，而腫瘤發(fā)生的根本原因就是細胞凋亡與增殖之間的平衡被打破，導(dǎo)致腫瘤細胞無限增殖，所以促進腫瘤細胞凋亡是抗腫瘤的重要方向[16]。本次流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與模型組比較，各給藥組腫瘤組織細胞凋亡率較高，且加味小陷胸湯低濃度組低于加味小陷胸湯高濃度組和順鉑組，提示加味小陷胸湯能明顯促進NSCLC腫瘤細胞凋亡，而關(guān)于其作用的具體機制，此次我們從NF-κB信號通路方面進行了探討。NF-κB與腫瘤發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，具有明顯的抑制細胞凋亡的功能。NF-κB抗凋亡的作用主要通過調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)，Bcl-2家族即為其下游常見的凋亡相關(guān)基因。Bax是Bcl-2家族中的促凋亡蛋白，可與線粒體膜上的受體結(jié)合，通過刺激細胞色素C釋放來誘發(fā)細胞凋亡；Bcl-2則屬于抗凋亡蛋白，能夠結(jié)合Bax從而阻止其促凋亡作用[17]。NF-κB活化后可以上調(diào)Bcl-2表達，下調(diào)Bax表達，從而抑制細胞凋亡，有研究認(rèn)為[18]，NF-κB在人類肺癌組織和細胞中，NF-κB通常呈異常的不受控制的激活狀態(tài)，而抑制NF-κB活化可能成為NSCLC治療的新靶點。

能夠在炎癥和損傷的誘導(dǎo)下釋放，既促進膠原合成，又抑制肺間質(zhì)細胞外基質(zhì)降解，抑制TGF-β1有助于阻止肺纖維化[15]。HMGB1屬于晚期炎癥因子和損傷相關(guān)模式分子，在炎癥損傷發(fā)生后，其被壞死細胞或單核巨噬細胞釋放，之后與TLR2結(jié)合使之激活；TLR2為促炎癥信號級聯(lián)傳導(dǎo)上游的重要分子，在纖維化疾病中活化后，能夠促進炎癥細胞因子形成，加重血管內(nèi)皮細胞細胞通透性，使炎癥反應(yīng)擴大。有研究顯示，TLR2可以作為纖維化疾病的早期治療靶點[17]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，加味小陷胸湯低、高濃度組及順鉑組小鼠肺組織HMGB1、TLR2蛋白表達水平較低，且加味小陷胸湯低濃度組>順鉑組>加味小陷胸湯高濃度組，表明高濃度加味小陷胸湯能明顯降低肺組織HMGB1、TLR2蛋白表達水平，抑制HMGB1/TLR2信號通路活性，這可能是加味小陷胸湯抑制肺纖維化發(fā)展的作用機制之一。

綜上所述，加味小陷胸湯能劑量依賴性抑制NSCLC荷瘤小鼠腫瘤生長，促進腫瘤細胞凋亡，其作用可能與抑制NF-κB信號通路，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達有關(guān)。