前列腺癌免疫人源化小鼠模型的構(gòu)建及鑒定

郭文文，師長(zhǎng)宏，李苗苗，喬天運(yùn)，趙菊梅，張彩勤?

(1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西延安 716000；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，西安 710032)

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性癌癥之一，并且隨著我國(guó)人口老齡化趨勢(shì)不斷明顯，其發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)[1-2]。由于前列腺癌的早期發(fā)展依賴于雄激素，主要治療方法為根治性手術(shù)治療、內(nèi)分泌治療及放射治療等。然而，大多數(shù)患者經(jīng)治療產(chǎn)生一段時(shí)間反應(yīng)后會(huì)復(fù)發(fā)，發(fā)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)[3]。而目前 CRPC有效的治療方法尚不明確，迫切需要探索新的治療方法。近年來(lái)，免疫療法在前列腺癌的治療上取得了快速發(fā)展，它可通過(guò)激活宿主免疫細(xì)胞特異性攻擊前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)[4-5]。然而，傳統(tǒng)的前列腺癌細(xì)胞系移植(cell derived xenograft，CDX)模型因缺乏完整的人免疫系統(tǒng)，無(wú)法用于免疫治療研究。本研究主要目的是構(gòu)建具有人免疫系統(tǒng)的人源化腫瘤小鼠模型，期望能夠用于腫瘤免疫藥物的研發(fā)及臨床前評(píng)估。

NOD-PrkdcscidIl2rgtm1/Vst(NPG)小鼠是一種先天性T、B與NK細(xì)胞三重免疫缺陷動(dòng)物。與國(guó)外的NSG或 NOG一樣，均為 NOD-Prkdcscid Il2rgnull小鼠，是目前國(guó)際公認(rèn)的免疫缺陷程度最高的小鼠模型，同時(shí)也是最好的人源細(xì)胞移植的受體。將人外周血中分離的PBMC移植入NPG小鼠體內(nèi)，可以重建以成熟T淋巴細(xì)胞為主的人免疫系統(tǒng)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步移植人腫瘤細(xì)胞而構(gòu)建的模型，即為人源化腫瘤模型。其模擬人體的生理、病理變化，可以給腫瘤提供與人體更相似的生長(zhǎng)微環(huán)境。同時(shí)，腫瘤基質(zhì)包含了人源免疫細(xì)胞成分，在闡明發(fā)病機(jī)制及腫瘤靶向治療與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移機(jī)制等研究方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值，尤其在研究腫瘤免疫治療方面，是更理想的腫瘤模型[6-8]。但外周血中PBMC在NPG小鼠體內(nèi)免疫重建時(shí)相及動(dòng)態(tài)過(guò)程有待進(jìn)一步研究。因此，本研究采用密度梯度離心法從新鮮人外周血中分離出PBMC，通過(guò)尾靜脈注射NPG小鼠，建立人源化小鼠模型；并植入前列腺癌細(xì)胞系 22Rv1細(xì)胞，構(gòu)建 Hu-CDX模型，探討NPG小鼠移植入人PBMC后免疫重建的水平及腫瘤生長(zhǎng)情況，以期為腫瘤免疫治療藥物的評(píng)估提供理想的臨床前動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12只4～5周齡SPF級(jí)雄性NPG小鼠，體重22～25 g，購(gòu)買于北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2019-0002】。飼養(yǎng)于中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境【SYXK(陜)2019-001】。環(huán)境溫度20～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，12 h光照/12 h黑暗。飼料及飲水均經(jīng)無(wú)菌處理，小鼠自由攝食和飲水。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得了空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.16013)。

1.1.2 細(xì)胞系

人前列腺癌細(xì)胞22Rv1細(xì)胞購(gòu)買于ATCC，該細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基(10%胎牛血清 +1%青鏈霉素)置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑與儀器

2份新鮮外周血供體取自空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院輸血科，并獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批注(KY20193035)；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基和0.25%胰酶購(gòu)自美國(guó) Gibco公司；人 Ficoll-PaqueTMPREMIUM 1.084 sterile solution試劑購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare；小鼠淋巴細(xì)胞分離液試劑購(gòu)自天津市灝洋生物科技有限公司；抗人流式檢測(cè)抗體：PE-CD3e抗體，F(xiàn)ITC-CD45抗體為美國(guó) BD Biosciences產(chǎn)品；IHC試劑盒購(gòu)買于康為世紀(jì)有限公司；抗人CD45、CD4和CD8抗體購(gòu)于英國(guó)abcam公司。FC500(Beckman Coulter)和 Flow Jo軟件用于流式細(xì)胞采集與數(shù)據(jù)分析。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組

NPG小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為供體1重建組、供體2重建組及未重建對(duì)照組，共3組，每組4只。

1.2.2 人源化小鼠模型的建立

采用Ficoll密度梯度離心法提取人新鮮外周血中PBMC備用。重建組每只小鼠通過(guò)尾靜脈注射1×107個(gè)PBMC，未重建對(duì)照組給予等體積的生理鹽水。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)在SPF級(jí)環(huán)境，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)每組小鼠各項(xiàng)指標(biāo)的變化情況。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測(cè)小鼠外周血中人免疫細(xì)胞的重建水平

移植后第3、4、5、6周分別用斷尾法取兩個(gè)免疫重建組小鼠尾靜脈血，并分離出PBMC制成單個(gè)細(xì)胞懸液，分別標(biāo)記抗人CD3+、CD45+T細(xì)胞熒光抗體后，進(jìn)行流式細(xì)胞分析，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)小鼠外周血中人免疫細(xì)胞的重建水平。流式細(xì)胞儀所檢測(cè)數(shù)據(jù)，采用FlowJo 7.6.1軟件分析及繪圖。

1.2.4 Hu-CDX模型的建立

當(dāng)供體1和供體2重建的小鼠外周血中人免疫細(xì)胞CD45+CD3+T細(xì)胞＞25%時(shí)，標(biāo)志人源化小鼠模型構(gòu)建成功。接下來(lái)我們將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的22Rv1細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化后，最終用無(wú)菌PBS緩沖液和基質(zhì)膠Matrigel基質(zhì)膠以1∶1將1×107個(gè)22Rv1細(xì)胞重懸至200 μL，皮下接種于構(gòu)建成功的免疫人源化小鼠。

1.2.5 腫瘤生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)及免疫浸潤(rùn)分析

小鼠生物學(xué)特征觀察：每天觀察精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)力、體重、毛順滑度及腫瘤的生長(zhǎng)等情況。腫瘤細(xì)胞接種后，一周2次監(jiān)測(cè)腫瘤體積，并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。腫瘤體積計(jì)算方法：V(mm3)＝長(zhǎng)(mm)×寬2(mm2)/2。當(dāng)腫瘤長(zhǎng)至1000 mm3左右，實(shí)驗(yàn)終止時(shí)對(duì)小鼠采用吸入CO2安樂(lè)死，收集模型鼠的腫瘤組織和脾組織，固定于4%多聚甲醛溶液中，作組織切片，進(jìn)行HE染色以及免疫組化染色，在顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。采用t檢驗(yàn)法進(jìn)行組間差異性分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型

將供體1來(lái)源的人PBMC注射入重建移植組小鼠體內(nèi)，于第3、4、5、6周流式細(xì)胞術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)小鼠外周血中人CD45+CD3+T細(xì)胞比例。如圖1A顯示，注射后第3周即可檢測(cè)到人源免疫細(xì)胞CD45+CD3+T細(xì)胞＞25%，標(biāo)志著人源化小鼠模型構(gòu)建成功。隨著重建時(shí)間的延長(zhǎng)，人CD45+CD3+T細(xì)胞明顯上升，到第6周達(dá)到約77.4%～86.7%。此外，我們還用供體2來(lái)源的PBMC進(jìn)行了免疫重建，流式數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)兩組供體免疫系統(tǒng)重建水平存在差異；人源化小鼠一般在重建第6周即出現(xiàn)包括體重下降、弓背、脫毛等移植物抗宿主反應(yīng)(GVHD)(圖1B)。

圖1 NPG小鼠人源化重建后外周血中人免疫細(xì)胞的百分比Note.A.The percentage of human CD45+CD3+T cells in the peripheral blood of donor 1 reconstructed mice was monitored by flow cytometry at the 3rd，4th，5th and 6th week.B.The level of human CD45+CD3+T cells in peripheral blood of mice reconstructed by donor 1 and donor 2(n＝4).Figure 1 Percentages of human immune cells in peripheral blood of NPG mice after humanization

2.2 前列腺癌Hu-CDX模型的構(gòu)建與評(píng)估

人源化小鼠模型于第3周重建成功后，進(jìn)一步將人前列腺癌細(xì)胞22Rv1皮下移植入小鼠右側(cè)腋下，并以正常的NPG小鼠為對(duì)照組。定期測(cè)量腫瘤的生長(zhǎng)情況。結(jié)果如圖2顯示，兩組小鼠中均有腫瘤生長(zhǎng)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)腫瘤體積增大，且22Rv1細(xì)胞系在人源化小鼠中生長(zhǎng)速度緩慢，與正常的NPG小鼠相比有顯著差別(P＜0.05)。待腫瘤生長(zhǎng)到1000 mm3左右后，對(duì)小鼠進(jìn)行安樂(lè)死處理，進(jìn)一步固定腫瘤組織，免疫組化染色后進(jìn)行單位面積陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量分析，觀察到人免疫重建組中每只CDX模型鼠的腫瘤組織中均有CD45+細(xì)胞及CD4+、CD8+T細(xì)胞的明顯浸潤(rùn)，HE染色發(fā)現(xiàn)免疫人源化與非人源化小鼠腫瘤細(xì)胞的組織細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有顯著性改變(見(jiàn)圖3A、3B)。綜上，重建的人免疫系統(tǒng)可能具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。

2.3 人源化小鼠免疫器官中人免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況

為了進(jìn)一步研究人免疫系統(tǒng)重建后小鼠脾內(nèi)人源免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，我們利用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)了免疫重建6周后小鼠脾內(nèi)人CD4+和CD8+T細(xì)胞表達(dá)情況。結(jié)果顯示，人CD4+、CD8+T細(xì)胞在重建小鼠脾組織中大量表達(dá)(T細(xì)胞膜著染棕黃色)；對(duì)照組小鼠脾中未見(jiàn)人源細(xì)胞表達(dá)(圖 4A、4B)。

圖2 Hu-NPG與NPG小鼠接種22Rv1細(xì)胞后腫瘤的生長(zhǎng)曲線(n＝4)Note.Compared with control group，?P ＜0.05.Figure 2 Growth curve of tumor in humanized mice after inoculated with 22Rv1 cells(n＝4)

圖3 Hu-NPG與NPG腫瘤組織中人免疫細(xì)胞的表達(dá)及HE染色Note.A.Expression of human CD45，CD4 and CD8 in tumor tissue and tumor infiltrating lymphocytes of Hu-NPG and NPG mice.B.Semi-quantitative analysis of human CD4 and CD8 immunohistochemical staining in tumor tissue.Compared with NPG， ???P＜ 0.001， n＝4.(The same in the next figures)Figure 3 Expression and HE staining of human immune cells in tumor tissues of Hu-NPG and NPG

圖4 Hu-NPG與NPG小鼠脾組織中人CD4、CD8免疫組化染色與半定量分析Note.A.Expression of human CD4 and CD8 in spleen tissue of Hu-NPG and NPG mice.B.Semi-quantitative analysis of human CD4 and CD8 mmunohistochemical staining in spleen tissue.Figure 4 Immunohistochemical staining and semi-quantitative analysis of human CD4 and CD8 in spleen tissue of Hu-NPG and NPG mice

3 討論

腫瘤免疫治療通過(guò)激活機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)或阻斷腫瘤免疫逃逸，以控制和殺傷腫瘤。自2014年 9月，F(xiàn)DA首次批準(zhǔn) PD-1抑制劑(pembrolizumab)作為惡性黑色素瘤的一線治療以來(lái)，免疫治療已成為多種癌癥的一線治療方案，也為中晚期前列腺癌患者帶來(lái)了曙光。以往的前列腺癌臨床前研究模型是將前列腺癌細(xì)胞系或臨床患者標(biāo)本移植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)，然而這種模型由于缺乏人的免疫系統(tǒng)，無(wú)法模擬人類腫瘤與免疫微環(huán)境之間的相互作用，因而無(wú)法進(jìn)行免疫檢查點(diǎn)抑制劑等腫瘤免疫治療研究。

通過(guò)在免疫缺陷小鼠體內(nèi)植入人造血干細(xì)胞或功能性的淋巴細(xì)胞，使其具有人的免疫功能，這樣的小鼠模型稱為免疫系統(tǒng)人源化模型。在此模型上移植腫瘤可模擬人體腫瘤與免疫系統(tǒng)之間的相互作用，因而在腫瘤免疫治療藥物(如新型免疫檢查點(diǎn)抑制劑、疫苗等)的研發(fā)與臨床前藥物評(píng)估方面具有重要的應(yīng)用前景[9]。依據(jù)人免疫系統(tǒng)重建方法的不同，可將免疫人源化小鼠模型分為3類：(1)Hu-BLT(humanized-bone marrow，liver，thymus)小鼠模型，是人源免疫系統(tǒng)重建最為完善的小鼠模型，但其供體為人胚胎肝和胸腺，來(lái)源比較受限[10]；(2)Hu-HSCs(humanized-hematopoietic stem cells)小鼠模型，是將人CD34+HSC移植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)，雖然這種方法可使多系造血細(xì)胞發(fā)育，但構(gòu)建模型較慢[6，11]；(3)Hu-PBL(humanized-peripheral blood mononuclear cells)小鼠模型，是將完全分化成熟的人PBMC移植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)[6，12-13]，可產(chǎn)生效應(yīng)性和記憶性T細(xì)胞。本研究中采用了第3種方法，不僅由于其構(gòu)建方法快速簡(jiǎn)便，而且這種方式可以使T細(xì)胞移植效率高且穩(wěn)定，更加準(zhǔn)確的反應(yīng)健康供體的免疫記憶狀態(tài)。更為重要的是，以往很多研究中小鼠重建人免疫系統(tǒng)模型之前都要經(jīng)過(guò)預(yù)處理，如未重建前進(jìn)行化療藥環(huán)磷酰胺或亞致死性劑量的60Co γ射線輻照處理[14-15]，尾靜脈注射抗NK細(xì)胞活性制劑[16]、IFN-γ[17]等以提高重建的比例，但仍存在較高的重建失敗率。而本研究中應(yīng)用的T、B、NK重度聯(lián)合免疫缺陷的NPG小鼠，在針對(duì)Hu-PBMC重建方面可以不進(jìn)行輻照處理，直接用于對(duì)多個(gè)供體來(lái)源的PBMC進(jìn)行篩選。

本研究結(jié)果顯示，人源化小鼠外周血及免疫器官中均監(jiān)測(cè)到高水平的人源細(xì)胞的表達(dá)。供體1重建第三周外周血中即可監(jiān)測(cè)到人CD45+CD3+T細(xì)胞 ＞25%，第六周即可達(dá)到77.4%～86.7%，并且重建小鼠脾中有高水平的人CD4、CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)，表明人源化小鼠模型構(gòu)建成功。此外，流式數(shù)據(jù)顯示，不同供體來(lái)源的PBMC在小鼠體內(nèi)免疫重建效果存在差異，這可能與供體的個(gè)體差異有關(guān)。人前列腺癌細(xì)胞系22Rv1中PD-L1、AR和PSA均高表達(dá)，是研究激素非依賴性前列腺癌免疫治療理想的的細(xì)胞系，因此我們選擇22Rv1細(xì)胞系皮下移植入人源化小鼠體內(nèi)，成功構(gòu)建了人源化荷瘤小鼠模型。我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞移植前后人源化小鼠外周血液及脾中人CD45+CD3+T細(xì)胞維持恒定狀態(tài)，且腫瘤組織中也有較高水平人CD4+、CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)。值得指出的是，本研究發(fā)現(xiàn)人前列腺癌細(xì)胞22Rv1細(xì)胞系在人源化小鼠中較非人源化小鼠中腫瘤生長(zhǎng)速度緩慢，提示，重建的人免疫系統(tǒng)可能具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。

由于臨床上前列腺癌是低免疫浸潤(rùn)的“冷”腫瘤，靶向免疫檢查點(diǎn)的治療方法在臨床上的治療效果差強(qiáng)人意。目前，研究者尋求通過(guò)聯(lián)合化療以提高前列腺癌的免疫浸潤(rùn)及免疫原性，使前列腺癌轉(zhuǎn)化為對(duì)免疫治療敏感的“熱”腫瘤[18]，因此該模型不僅能夠應(yīng)用于免疫新藥的療效評(píng)估，還能作為免疫治療聯(lián)合化療的臨床前動(dòng)物模型，這顯然是人源化小鼠模型更具意義的應(yīng)用方向。相關(guān)研究報(bào)道，Hu-PBL模型由于GVHD出現(xiàn)較早，研究窗口期為3～6周，主要用于短期免疫治療藥物的評(píng)價(jià)，不適用于長(zhǎng)期的腫瘤免疫機(jī)制研究[13]。因此，課題組后續(xù)將構(gòu)建Hu-HSCs模型，以進(jìn)行上述聯(lián)合治療的研究及開(kāi)發(fā)新型免疫檢查點(diǎn)抑制劑和抗腫瘤免疫機(jī)制的研究，以期為臨床實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。