miR-328在運動改善高血壓大鼠胸主動脈L型鈣通道表達中的作用

邱方，周楊，張嚴焱，金城，劉曉東，吳迎，2，呂媛媛，石麗君，2?

(1.北京體育大學運動生理教研室，北京 100084；2.北京體育大學運動與體質健康教育部重點實驗室，北京 100084；3.北京體育大學中國運動與健康研究院，北京 100084)

據(jù)世界衛(wèi)生組織最新的衛(wèi)生統(tǒng)計數(shù)據(jù)，高血壓是一個主要的公共衛(wèi)生問題，影響到25歲及以上40%的成年人，其發(fā)病率和死亡率很高。長期高血壓時，全身動脈系統(tǒng)受血管內高壓力的影響會產(chǎn)生病變，導致血管結構和功能的改變。在高血壓病理過程中，大動脈長期承受高應力的影響，導致血管順應性下降，是心血管功能異常的主要原因。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)是構成血管壁結構和功能的主要成分，L型電壓門控鈣通道(voltage-gated L-type Ca2+channel，LTCC)是存在于VSMC膜上的一種主要鈣通道，控制外鈣內流，是VSMC收縮的結構基礎，在調節(jié)血管張力和血壓中起重要作用[1]。LTCC由成孔 α1C和輔助 β、α2δ和γ亞基組成，它們共同調節(jié)通道功能[2]。其中α1C亞基是LTCC的門控裝置和Ca2+的滲透孔道，作為支架蛋白，β亞基可以定位和整合細胞內信號以影響LTCC門控特性。研究證實，VSMC中LTCC的上調是高血壓的一個標志性特征，且細胞膜中LTCC蛋白表達量與體內血壓水平呈正相關[3]，但其潛在的機制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，與正常血壓大鼠(Wistar Kyoto，WKY)相比，自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously hypertensive rat，SHR)腸系膜動脈LTCC轉錄水平略高，但其蛋白水平高3.4倍[4]。在豬肺動脈高壓模型中，肺動脈LTCC蛋白表達顯著升高，但轉錄水平?jīng)]有變化[5]。因此，轉錄后調控可能在LTCC表達中發(fā)揮更重要的作用。

MicroRNA(miRNA，miR)是一種短的非編碼RNA片段，通過靶向mRNA在轉錄后調控基因和蛋白質的表達[6]。miRNAs的失調可能導致疾病的發(fā)展，因參與多種細胞功能，例如增殖、遷移和凋亡。多篇綜述報道m(xù)iRNA在高血壓的病理生理過程中發(fā)揮重要作用[6-7]。近期研究發(fā)現(xiàn)miRNA可能是LTCC轉錄后水平的一種調控機制，miR-1、miR-145和miR-328直接靶向或調節(jié)VSMC中LTCC的功能[8-9]。在血管和心肌細胞中檢測發(fā)現(xiàn)，miR-328對LTCC α1C亞基基因(CACNA1C) 和 β1亞基基因(CACNB1)有靶向作用，該研究發(fā)現(xiàn)miR-328可以抑制缺氧性肺動脈高壓LTCC的表達，miR-328的過表達可以降低右心室收縮壓和肺動脈壁厚度[10-11]。

長期規(guī)律運動是預防和控制高血壓推薦的非藥物療法。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，有氧運動可逆轉高血壓血管平滑肌LTCC結構和功能重構，改善血管功能，調控血壓水平[12-14]，但運動調控血管平滑肌離子通道功能的潛在機制仍不清楚。規(guī)律有氧運動作為一種環(huán)境表觀遺傳調制器，可通過DNA甲基化、組蛋白修飾和miRNA等表觀遺傳修飾，調控心血管相關基因表達，進而改善心血管結構和功能[15-16]。miRNA作為表觀調控的重要組成部分在心血管系統(tǒng)中高度表達，參與調節(jié)VSMC離子通道功能[11]。規(guī)律有氧運動作為一種良性刺激，在逆轉高血壓LTCC重構過程中，miR-328是否參與其中，目前尚不清楚。因此，本研究通過建立有氧運動模型，觀察有氧運動對正常血壓大鼠和高血壓大鼠胸主動脈中LTCC亞基和miR-328的表達影響，并探討miR-328在其中的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級12周齡雄性正常血壓大鼠WKY和自發(fā)性高血壓大鼠SHR各24只，WKY體重約270 g、SHR體重約245 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK(京)2016-0006】，飼養(yǎng)于北京體育大學動物實驗室【SYXK(京)2016-0033】。大鼠自由飲水進食，溫度 22～24℃，相對濕度 40%～60%，所有實驗方案獲得北京體育大學運動科學實驗室倫理委員會批準(IACUC 2017003A)。

1.1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉、去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)和硝苯地平(Nifedipine)均購買于sigma公司，Rabbit polyclonalanti-α1C(Alomone Laboratories，Israel)，Anti-β1(Sigma，USA)，GAPDH(Santa Cruz Biotechnology，USA)，Rabbit Polyclonal to α-SM-actin(Abcam，UK)，BCA 試劑盒(Pierce，USA)，miRcute miRNA提取分離試劑盒(Tiangen，China)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific，USA)，Alexa Fluor488 goat anti-rabbit IgG antibody(Life Technologies，USA)，Lipofectamine RNAiMAX試劑(Invitrogen，USA)，DMEM 培養(yǎng)基、HBSS緩沖液、胎牛血清、雙抗Penicillin/streptomycin均購買于Gibco公司。

實驗儀器包括智能無創(chuàng)血壓儀(BP-2010A，Softron Biotechnology，中國)，PowerLab 系統(tǒng)(PL3504，AD Instruments，Australia)，離體微血管環(huán)張力測定系統(tǒng)(620 M，Danish Myo Technology，Denmark)，PCR 儀(ABI，USA)，熒光定量 PCR 儀(ABI，USA)，Chemi DOC XRS+ 成像系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)，CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo，USA)，倒置生物顯微鏡(IX71-F22PH，Olympus，Japan)，Leica SP8 TCS激光共聚焦系統(tǒng)(Leica，Germany)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組和有氧運動模型建立

WKY和SHR隨機分為安靜對照組(WKY-C，SHR-C)和有氧運動組(WKY-EX，SHR-EX)，每組各12只。運動組大鼠先進行1周的適應訓練，之后進行12周中等強度的跑臺運動，坡度0°，每周5 d，每天 1 h，速度為 20 m/min，相當于 55% ～ 65%V·O2max。WKY-C和SHR-C作為對照組不做運動干預。

1.2.2 大鼠尾動脈無創(chuàng)血壓監(jiān)測

大鼠清醒、安靜時的血壓和心率(heart rate，HR)采用鼠尾動脈智能無創(chuàng)血壓儀(BP-2010A)測量。

1.2.3 大鼠心血管反應測定

各組大鼠于12周有氧運動后，各選取6只，進行股動靜脈置管術測定大鼠心血管反應。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，分別于股動脈和股靜脈的近心端(2根線)和遠心端(1根線)穿線，用動脈夾夾住血管近心端，于遠心端結扎部位前剪一小口，將導管沿著血管行走方向插入管腔，之后固定導管，注射50 IU/mL的肝素鈉0.5 mL左右進行封管。術后24 h大鼠恢復良好，在清醒安靜狀態(tài)下測試，通過PowerLab系統(tǒng)連接股動脈插管外側頭，記錄大鼠基礎血壓。之后在大鼠股靜脈分別注射去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE，18 μg/kg)和LTCC阻斷劑硝苯地平(Nifedipine，1 mg/kg)，觀察大鼠血壓變化，每種藥物的注射間隔時間在5 h以上，以保證血壓恢復正常水平。

1.2.4 HE染色

取大鼠胸主動脈，剝離周邊組織后進行固定，經(jīng)梯度乙醇二甲苯脫水后溶于石蠟，切片脫蠟后用蘇木素和伊紅染色，乙醇二甲苯處理后封片并拍攝，用Image J軟件進行測量。每個樣本組織切片隨機5個視野，每個視野測量3次并取平均值，將5個視野的平均值作為胸主動脈壁厚。

1.2.5 免疫蛋白印跡

大鼠胸主動脈低溫下與裂解液混勻，離心后取上清液測定蛋白濃度。用SDS-PAGE電泳分離等量蛋白質(約50 μg)并轉至 PVDF膜上，用5%BSA封閉。 加入一抗 Rabbit polyclonal anti-α1C(1∶200)，Anti-β1(1 ∶200)和 GAPDH(1 ∶500)4℃孵育過夜。第2天加入二抗室溫孵育1 h，滴加ECL發(fā)光液到PVDF膜上，放入Chemi DOC XRS+成像系統(tǒng)顯影。

1.2.6 Real time PCR

LTCC α1C和β1亞基 mRNA測定，取胸主動脈的總RNA進行常規(guī)的Real time PCR。miR-328測定采用miRcute miRNA提取分離試劑盒提取胸主動脈的 miRNA；采用 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，以U6為內參基因，使用miR-328含特異莖環(huán)結構的引物[9]進行反轉錄反應；cDNA擴增采用Power SYBR Green PCR Master Mix進行反應。 LTCC α1C亞基(CACNA1C) 和 LTCC β1亞基(CACNB1)以GAPDH為內參照，miR-328以 U6為內參照。所有PCR反應均重復進行，采用2-△△Ct法進行評估，分析目的基因的相對表達。擴增引物由上海吉瑪公司合成，序列如下(表1)：

表1 RT-PCR引物序列Table 1 RT-PCR primers sequences

1.2.7 VSMC原代與傳代培養(yǎng)

取12周齡健康雄性WKY，麻醉后，無菌條件下取出大鼠胸主動脈，浸于HBSS溶液中，剝離干凈動脈周圍的脂肪組織，并將動脈內血液排除，呈白色；在膠原酶培養(yǎng)皿中，37℃孵育大鼠動脈約45 min，剝離動脈外膜，并去除內皮；轉移至彈性蛋白酶培養(yǎng)皿中，把動脈剪成細小碎片(1 mm×1 mm)，37℃孵育30～35 min，用巴氏吸管進行反復吹打使組織碎片消失；1800 rpm離心10 min，丟棄上清液，將原代VSMC用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，放入37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。當培養(yǎng)皿中VSMC密度達80%～90%時，加入胰酶進行消化并傳代；VSMC傳至5～7代且細胞密度達60%～80%時進行轉染。使用平滑肌特異性肌動蛋白α-actin鑒定VSMC，純度要達90%～95%方可進行后續(xù)轉染實驗。

1.2.8 VSMC免疫熒光染色

吸走培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，VSMC于4%的多聚甲醛固定30 min；用0.2%Triton X-100對細胞進行膜穿孔孵育15 min，PBS清洗3次；用5%BSA孵育60 min，封閉非特異性結合抗體部位；滴加一抗Rabbit Polyclonal to α-SM-actin(1∶200)，4℃過夜孵育，PBS清洗3次；滴加二抗Alexa Fluor488 goat anti-rabbit IgG antibody(1∶1000)，對細胞孵育 60 min，PBS 漂洗后滴加封片劑以蓋玻片封片。在24 h后激光共聚焦成像系統(tǒng)進行信號捕捉與成像。

1.2.9 脂質體轉染

取生長狀態(tài)良好的VSMC，將細胞隨機分為三組miR-328 mimic組、miR-328 inhibitor組和空脂質體 negative control(NC)組，采用 Lipofectamine RNAiMAX試劑將各miR-328干擾序列轉染進VSMC(表 2)。 于轉染后 24、48、72、96 h 收集 VSMC進行蛋白指標檢測，于轉染后12、24、48、72 h收集VSMC進行mRNA定量。

表2 各組miRNA干擾序列Table 2 miRNA interference sequence

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 有氧運動對高血壓大鼠體重、血壓和心率的影響

各組大鼠于運動干預前(12周齡)和12周有氧運動干預后(24周齡)采用尾動脈無創(chuàng)血壓儀測量大鼠血壓和心率。運動前SHR-C組體重顯著低于WKY-C組(P＜0.05)，而 SHR-C組的收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒張壓 (diastolic blood pressure，DBP)和HR顯著高于WKY-C組(P＜0.01)。WKY-EX組和 SHR-EX組體重、SBP、DBP和HR與各自對照組相比均無顯著差異(圖1)。

12周有氧運動后，WKY-EX組和SHR-EX組體重均顯著低于各自對照組(P＜0.05)，SHR-C組體重仍顯著低于WKY-C組(P＜0.05)。WKY-EX組SBP顯著低于WKY-C組(P＜0.05)；SHR-C組SBP、DBP和HR顯著性高于WKY-C組，而SHR-EX組SBP、DBP和HR顯著低于SHR-C組(P＜0.01)(圖1)。

2.2 有氧運動對各組大鼠胸主動脈形態(tài)學的影響

HE染色觀察各組大鼠胸主動脈壁厚變化(圖2)。WKY-C組和WKY-EX組大鼠胸主動脈壁厚無明顯差異，與WKY-C組相比，SHR-C組胸主動脈管壁明顯增厚(P＜0.01)；SHR-EX組胸主動脈壁厚顯著小于SHR-C組(P＜0.05)。

圖1 有氧運動對WKY和SHR體重、血壓和心率的影響(n＝12)Note.Compared with group WKY-C，?P ＜ 0.05，??P ＜ 0.01.Compared with groupSHR-C，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01.(The same in the next figures)Figure 1 Effects of aerobic exercise on body weight， blood pressure and heart rate of WKY and SHR(n＝12)

圖2 有氧運動對各組大鼠胸主動脈壁厚的影響(n＝6)Note.A.Histological structure of the thoracic aorta(HE staining， ×400.Bar＝50 μm).B.Statistical histogram of thoracic aortic wall thickness.Figure 2 Effects of aerobic exercise on the thickness of thoracic aortic aorta of rats(n＝6)

2.3 有氧運動對各組大鼠心血管反應的影響

各組大鼠于12周有氧運動后，采用股動靜脈置管術監(jiān)測大鼠的心血管反應。在體股靜脈注射NE(18 μg/kg)后，四組大鼠血壓均顯著增加；與WKYC組相比，SHR-C組注射NE后平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)升高幅度(△MAP)顯著增加(P＜0.05)；與SHR-C組相比，SHR-EX組注射NE后△MAP顯著下降(P＜0.05)(圖3A、3C)。

股靜脈注射Nifedipine(1 mg/kg)后，四組大鼠血壓明顯下降；SHR-C組大鼠MAP下降幅度最明顯，且顯著高于WKY-C組的下降幅度(P＜0.05)；與SHR-C組相比，SHR-EX組大鼠MAP降低幅度明顯減少(P＜0.05)；WKY-C組與 WKY-EX組 MAP降低幅度無明顯差異(圖3B、3D)。

圖3 有氧運動對各組大鼠心血管反應的影響(n＝6)Figure 3 Effects of aerobic exercise on cardiovascular response of rats(n＝6)

2.4 有氧運動對高血壓大鼠胸主動脈LTCC α1C和β1亞基mRNA和蛋白表達的影響

qPCR檢測各組胸主動脈中LTCC α1C和β1亞基與相應的GAPDH的mRNA相對表達值(圖4A、4B)。 SHR-C組LTCC α1C和β1的mRNA的表達量明顯高于WKY-C組(P＜0.01)。經(jīng)12周有氧運動后，WKY-EX 組和 SHR-EX 組的 LTCC α1C和 β1的mRNA表達量都呈現(xiàn)下降趨勢，但與各自對照組相比較，SHR-EX的表達量顯著性下調(P＜0.01)，而WKY-EX組表達量無顯著性差異。

Western Blot檢測各組胸主動脈LTCC α1C和β1亞基與相應的GAPDH的蛋白相對表達值(圖4B、4D)。與 WKY-C組相比，SHR-C組胸主動脈中LTCC α1C和β1表達顯著上調(P＜ 0.01)。 與 SHRC組相比，SHR-EX組的LTCC α1C蛋白表達呈顯著性下調(P＜0.05)，LTCC β1蛋白表達呈非常顯著性下調(P＜0.01)。WKY-EX組中α1C蛋白表達相比于WKY-C組也有所下降，但表達不明顯。

2.5 有氧運動促進高血壓大鼠胸主動脈中miR-328表達增加

運動對各組胸主動脈中miR-328與相應的U6相對表達值(圖5)。與WKY-C相比，SHR-C組中miR-328的表達呈現(xiàn)顯著性降低(P＜0.01)。通過12周有氧運動后，與各自對照組相比，SHR-EX組中miR-328表達明顯升高(P＜0.05)，WKY-EX組無顯著性差異(圖5)。

圖4 各組大鼠胸主動脈LTCC α1C和β1亞基mRNA和蛋白表達(n＝6)Figure 4 The mRNA and protein expression of LTCC α1Cand β1 subunits in thoracic aorta from four groups(n ＝ 6)

圖5 各組大鼠胸主動脈miR-328表達(n＝6)Figure 5 Expression of miR-328 normalized to U6 in rat thoracic aorta(n＝6)

2.6 miR-328 靶向調控 LTCC α1C和 β1亞基mRNA和蛋白表達

2.6.1 VSMC鑒定

如圖6所示，大鼠VSMC原代提取、培養(yǎng)并傳代，用平滑肌特異性肌動蛋白α-actin免疫熒光染色進行鑒定，通過激光共聚焦顯微鏡拍攝發(fā)現(xiàn)，VSMC骨架蛋白α-actin清晰可見，細胞質內存在大量紅色的細絲，表明培養(yǎng)的細胞為VSMC。

2.6.2 miR-328對LTCC α1C亞基mRNA和蛋白表達量的影響

離體轉染 12、24、48、72 h 后檢測 VCSMs內LTCC α1C亞基 mRNA 表達，qPCR 結果如圖 7A，與相同時間段的NC組相比，α1CmRNA表達在瞬時轉染miR-328 mimic組24 h出現(xiàn)下降趨勢(P＞0.05)，48 h表達呈顯著性降低(P＜0.01)；轉染miR-328 inhibitor組的α1CmRNA表達量在24 h(P＜0.01)和48 h(P＜0.05)呈顯著性上調。

離體轉染24、48、72、96 h 后檢測 VCSMs內 LTCC α1C亞基蛋白表達，Western Blot結果如圖 7B、7C，與同時間段NC組相比，轉染miR-328 mimic組的α1C蛋白表達量在48 h(P＜0.05)和72 h(P＜0.01)蛋白表達量顯著降低，而miR-328 inhibitor組中α1C的蛋白表達量在48 h(P＜0.01)和72 h(P＜0.05)顯著上調。由此可見，miR-328對體外培養(yǎng)的 VSMC的LTCC α1C亞基有明顯的抑制作用。

圖6 平滑肌特異性肌動蛋白α-actin免疫熒光標記的VSMC代表圖Figure 6 Representative immunofluorescence images of VSMC stained with α-SM-actin

2.6.3 miR-328對LTCC β1亞基mRNA和蛋白表達量的影響

離體轉染 12、24、48、72 h 后檢測 VCSMs內LTCC β1亞基mRNA表達，qPCR結果顯示如圖7D，與相同時間段NC組相比，轉染miR-328 mimic組的β1mRNA表達在24 h顯著下調(P＜0.05)，而轉染miR-328 inhibitor組的β1mRNA的表達量在24 h(P＜ 0.05)、48 h(P＜ 0.01)和72 h(P＜ 0.05)呈顯著性上調。

離體轉染 24、48、72、96 h 后檢測 VCSMs內LTCC β1亞基蛋白表達，Western Blot結果如圖7B、7E，與同時間段NC組相比，轉染miR-328 mimic組的β1蛋白表達在48 h(P＜ 0.01)和72 h(P＜0.05)呈顯著性下調，而轉染miR-328 inhibitor組中 β1的蛋白表達 48 h(P＜0.01)和 72 h(P＜0.05)呈顯著性上調。由此可見，miR-328對體外培養(yǎng)的 VSMC的 LTCC β1亞基有明顯的抑制作用。

3 討論

本文研究了12周規(guī)律有氧運動對SHR胸主動脈LTCC表達的影響，并探討了miR-328在其中的靶向作用。結果表明，與WKY-C組相比，SHR-C胸主動脈miR-328表達下調，LTCC α1C和β1亞基的表達上調；12周有氧運動后可增加SHR胸主動脈miR-328表達，靶向抑制 LTCC α1C和 β1亞基的表達，從而有效降低SHR血壓。

胸主動脈作為人體最大的彈性血管，在維持整個心動周期中動脈血壓的相對穩(wěn)定起重要作用。因此，我們選取胸主動脈作為研究對象。研究表明，高血壓的發(fā)生、發(fā)展與血管結構和功能變化密切相關，主要表現(xiàn)為血管內皮細胞功能障礙，血管平滑肌細胞增生，血管壁增厚，管腔狹窄，血管順應性下降，導致血壓增加[17]。有氧運動可有效降低高血壓大鼠的血壓和心率作用涉及多種機制[18]。如長期運動導致心臟和動脈結構及功能發(fā)生適應性變化，心交感神經(jīng)減弱，迷走張力增高，主動脈及大動脈血管順應性變大，外周血管阻力減弱，內皮功能改善等，從而降低心率和血壓[19]。本研究SHR-C組胸主動脈的管壁厚度明顯高于 WKY-C組，而SHR-EX組胸主動脈壁厚明顯低于SHR-C組，說明12周有氧運動可以明顯改善高血壓大鼠血管壁厚的現(xiàn)象。

圖7 VSMC轉染miR-328 mimic或inhibitor后LTCC α1C和β1亞基mRNA和蛋白表達(n＝6)Figure 7 The mRNA and protein expression of LTCC α1Cand β1subunits after transfection with miR-328 mimic or inhibitor in VSMC(n ＝ 6)

LTCC是VSMC上的一種Ca2+通道，有兩個主要亞基 α1C和 β1，α1C主要控制細胞外的鈣離子內流，β1則負責α1C生理功能的激活，二者共同作用參與LTCC功能的多樣性[20]。研究證明，血管LTCC亞單位組成是動脈張力和血壓水平的決定因素[21]。LTCC表達和功能異常會導致肌源性張力和血壓的異常變化，VSMC中LTCC上調是高血壓的一個特異性標志[22]。為了研究LTCC功能在血壓調控中的作用，我們通過在體靜脈注射NE和Nifedipine(LTCC特異性阻斷劑)，結果發(fā)現(xiàn)運動可明顯降低高血壓大鼠對NE的升壓反應和Nifedipine的降壓反應。說明高血壓大鼠LTCC功能顯著上調，而有氧運動后可顯著降低LTCC在調控血壓中的功能亢奮。高血壓血管平滑肌LTCC表達的增多被認為是其功能上調的原因。高血壓模型VSMC膜上LTCC表達增加，胞外 Ca2+內流增加，從而引起血管收縮[23]。本研究Western Blot和qPCR檢測結果亦表明，高血壓大鼠胸主動脈中 LTCC α1C和 β1亞基mRNA和蛋白表達顯著高于正常血壓大鼠，而經(jīng)12周有氧運動后高血壓大鼠的 LTCC α1C和 β1亞基mRNA和蛋白表達明顯降低。運動后LTCC表達降低可導致LTCC功能下調，這可能是導致血管功能改善的因素之一。

表觀遺傳學是指在沒有改變基因序列的情況下發(fā)生的基因表達的變化，表觀遺傳修飾主要包括DNA甲基化、組蛋白質修飾和非編碼miRNA[24]。已證實miRNA在高血壓血管重構中具有重要作用，可調控VSMC的增殖、分化、凋亡和表型轉換，為心血管疾病提供新的治療靶點[25]。miRNA作為重要的表觀調控機制之一，很多研究表明，規(guī)律運動可以通過表觀遺傳調控改善高血壓[26-27]。有氧運動可使SHR主動脈中miR-27a和miR-155上調，miR-143下調，改善腎素-血管緊張素系統(tǒng)平衡，進而減弱胸主動脈重構和血壓[28]。Liao等[29]發(fā)現(xiàn)在運動干預過程中，miR-145上調可能參與了高血壓動脈VSMC從去分化表型向收縮表型的轉變，從而改善血壓。在本研究中，SHR-C組胸主動脈miR-328的表達顯著低于WKY-C組，而SHR-EX組胸主動脈miR-328表達顯著高于SHR-C組。說明miR-328的表達與LTCC α1C和β1亞基mRNA和蛋白表達呈高度負相關，有氧運動可誘導高血壓大鼠胸主動脈miR-328升高，靶向抑制LTCC亞基表達從而降低血壓。研究發(fā)現(xiàn)肺動脈高壓時，miR-328可以抑制LTCC α1C亞基的表達，減弱肺動脈重塑[11]。Lu等[10]在小鼠心肌細胞培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，敲除miR-328導致α1C和β1蛋白表達的增高。為了進一步驗證miR-328對胸主動脈VSMC LTCC α1C和 β1亞基表達的負調控作用。我們進行了胸主動脈VSMC體外培養(yǎng)，脂質體轉染 miR-328 mimic，miR-328 inhibitor使之過表達或沉默，也證實miR-328可靶向抑制LTCC α1C及β1亞基mRNA和蛋白表達。

有氧運動可通過調節(jié)miRNA的水平，調控心血管相關基因及蛋白表達，進而起到保護心血管作用。本研究通過股動靜脈置管術、HE染色、qPCR、Western Blot、細胞培養(yǎng)和轉染等技術，從心血管反應、動脈形態(tài)結構、LTCC及miR-328表達，證明了規(guī)律有氧運動可有效降低SHR血壓，調控miR-328在轉錄后靶向抑制LTCC α1C和β1亞基的表達，提示miR-328可能是運動改善高血壓胸主動脈LTCC重構的機制之一，為運動促進心血管健康提供了理論依據(jù)。