我國(guó)天然纖維植物纖維素合酶基因研究進(jìn)展

黃欣智，姜雅軒，孫向前，付澤元，徐啟江

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150036)

21世紀(jì)以來，隨著以煤炭和石油為主的不可再生能源的不斷消耗，人類逐漸將目光投向可再生能源。纖維素作為可再生能源的一種，年產(chǎn)高達(dá)幾億噸甚至更多，越來越受到學(xué)術(shù)界的關(guān)注。纖維素由吡喃式D-葡萄糖為單體組成，由β-1，4-糖苷鍵連接，約有2 500個(gè)葡萄糖殘基。在植物體內(nèi)，纖維素的存在形式是微纖維。一般來說，微纖絲是從36個(gè)β-1，4-葡萄糖苷鏈結(jié)晶的，它們貫穿每個(gè)細(xì)胞。微纖絲通過半纖絲連接，形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可以幫助植物支撐和承受機(jī)械壓力[1]。纖維素也是植物細(xì)胞壁的最主要成分，從內(nèi)向外植物的細(xì)胞壁可以分為三部分，即次生壁(secondary cell wall，SCW)、初生壁(primary cell wall，PCW)和胞間層(intercellular layer)。次生壁是細(xì)胞成熟停止生長(zhǎng)之后合成的，細(xì)胞壁是木質(zhì)化的，堅(jiān)硬的，剛性的，機(jī)械性強(qiáng)的，對(duì)植物細(xì)胞具有很強(qiáng)的保護(hù)作用；初生壁是細(xì)胞生長(zhǎng)期合成的細(xì)胞壁，其特點(diǎn)是質(zhì)地柔軟，具有可塑性。半纖維素、果膠和木質(zhì)素是除纖維素外的植物細(xì)胞壁的組成成分。

植物的纖維是一種絮狀物，由植物的纖維素和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成，主要在植物體內(nèi)起支撐、連接、包裹和充填的作用。天然植物纖維是指直接從植物中獲得的紡織纖維，植物來源可能是天然存在或人工培育。天然植物纖維是紡織工業(yè)的重要材料來源，目前，幾乎所有的天然纖維都來自棉花和各種麻類作物。在我國(guó)，棉麻作物的種植歷史悠久，研究其纖維的合成對(duì)于提高棉麻纖維質(zhì)量、培育新品種具有重要的意義。綜述了近年來對(duì)纖維素合酶的研究特別是對(duì)天然植物纖維的CesA研究取得的進(jìn)展。

1 高等植物的纖維素合酶

高等植物纖維素合酶是由一種玫瑰狀或蓮花狀的纖維素合酶復(fù)合體(Cellulosesynthasecomplex，CSC)合成的，這種酶定位在細(xì)胞膜之上，含有六個(gè)大亞基，每個(gè)亞基含有至少3種纖維素合成酶(Cellulosesynthase，CesA)蛋白，形成一個(gè)36單體復(fù)合體[2]，有人用復(fù)合的復(fù)合物(complex complex)來形容它。CSC中含有大量蛋白質(zhì)，包括CesA蛋白，CSL(類纖維素合酶)蛋白，UDPG(UDP-葡萄糖)形成相關(guān)的蛋白，纖維素內(nèi)切酶(KORRIGAN)，細(xì)胞骨架蛋白(微管蛋白和肌動(dòng)蛋白)等[3]，其中CesA蛋白作為重要組成部分，是復(fù)合物的催化亞基[4]。纖維素合成酶最初是從人類的細(xì)菌中鑒定出來的[5-6]。1995年，Saxena和Brown在醋酸桿菌(Acetobacterxylinum)中鑒定出了細(xì)菌的纖維素合酶[7]，他將細(xì)菌纖維素合成酶作為鑒定植物的纖維素合成酶的工具。后來，人們從許多植物中鑒定出CesA，包括擬南芥[8]、棉花[9]、玉米[10-11]等。研究表明：即使在同一植株的不同位置，不同的CesA基因也有不同的表達(dá)，因?yàn)?個(gè)CesA蛋白可以組裝成1個(gè)亞基，3個(gè)CesA蛋白之間可以不同，也可以相同。以擬南芥為例，人們?cè)跀M南芥中共鑒定出10種CesA基因，發(fā)現(xiàn)AtCesA1、AtCesA2、AtCesA4、AtCesA5、AtCesA6、AtCesA9和細(xì)胞初生壁表達(dá)有關(guān)，AtCesA4、AtCesA8、AtCesA9與擬南芥細(xì)胞壁次生壁的合成密切關(guān)聯(lián)，而AtCesA10表達(dá)具有強(qiáng)烈的組織特異性，只在角果后期和種子形成初期強(qiáng)烈表達(dá)[12]。

通過對(duì)小麥的研究，人們發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)論：小麥的CesA1、CesA2、CesA4、CesA5、CesA6、CesA9和細(xì)胞初生壁表達(dá)有關(guān)，而CesA4、CesA8、CesA9參與次生壁表達(dá)[13]。CesA基因的突變會(huì)導(dǎo)致植物纖維素合成受阻。研究表明，水稻bc6突變體(OSCesA9基因半顯性突變體，在該基因的高度保守區(qū)發(fā)生錯(cuò)義突變)植株中，莖稈的纖維素含量減少了38%[14]。CesA基因的長(zhǎng)度大多介于3.5～5.5 Kb，一般有9～13個(gè)內(nèi)含子，內(nèi)含子的多少和基因的結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。CesA基因編約1 000個(gè)氨基酸的肽鏈，一般介于988～1 088。它們之間的一致性為 53%～98%[15]。1995年，Delmer為纖維素合成酶基因的命名制訂了規(guī)則：纖維素合成酶(cellulosesynthase)由Ces表示，種屬名置于其在前面，基因后面的“A(B)”表明它編碼細(xì)菌催化亞基的同源體，此后這種規(guī)則在命名此類基因是得到了沿用[16]。例如：AtCesA表示擬南芥纖維素合成酶(idopsisthalianacellulosesynthase)。目前的植物纖維素生物合成模型分為三部分：其一，在蔗糖合酶作用下，UDP-葡萄糖提供底物；其二，由不同的CesA組成的CesA蛋白組裝形成玫瑰狀的CSC復(fù)合物，該復(fù)合體聚合葡萄糖單體形成鏈，同時(shí)UDP釋放后被回收，并返回至蔗糖合酶繼續(xù)作為纖維素合成的底物；其三，纖維素酶KORRIGAN (Kor)對(duì)有缺陷的葡聚糖鏈進(jìn)行切割，催化其轉(zhuǎn)換為纖維素微纖絲[17]。

2 纖維素微纖絲合成其他有關(guān)蛋白

除了CesA蛋白之外，還存在一類類纖維素合成酶蛋白(cellulosesynthase-like,Csl)，也是糖基轉(zhuǎn)移酶家族的一員，在 β-1，4- 甘露糖苷和 β-1，4- 葡萄糖苷鍵以及葡甘聚糖骨架合成過程中起著重要作用。Csl家族包括CslA/B/C/D/E/F/G/H/J 亞家族[18-19]。研究表明：花粉管發(fā)育需要CSLD1和CSDL4，CSLD2，這是正常根毛形成所需的。當(dāng)CsLD出現(xiàn)突變，會(huì)對(duì)花粉管壁纖維素的沉積產(chǎn)生嚴(yán)重的影響[20-21]。

3 我國(guó)麻類作物CesA的研究進(jìn)展

2006年，田志堅(jiān)[22]利用擬南芥纖維素合成酶AtCesA7保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，后續(xù)用RACE法克隆該基因，首次從苧麻中分離得到一個(gè)3276 bp的片段，利用BLAST在線分析軟件對(duì)片段進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該片段和已知的擬南芥、玉米、馬鈴薯等植物CesA有很高的同源性，但是缺少5’端的部分序列，說明他成功克隆到了缺少5’部分序列的BnCesA基因，并因?yàn)樵摶蚝蛿M南芥AtCesA1同源程度較高，故命名為BnCesA1。同時(shí)，利用RT-PCR技術(shù)對(duì)苧麻的不同部位進(jìn)行半定量檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該基因在莖葉芽根4個(gè)部位都有表達(dá)，含量大小依次減小。在次生生長(zhǎng)的莖和初生生長(zhǎng)的芽中的表達(dá)表明，該基因在PSW,RSW中都表達(dá)，從而證實(shí)該基因表達(dá)不具有特異性。田志堅(jiān)，易容[22-24]等人構(gòu)建了BnCesA1反義表達(dá)載體，并將其用于煙草轉(zhuǎn)化。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移到BnCesA1的煙草和正常煙草相比，有明顯間隙出現(xiàn)在葉柄橫截面基本組織細(xì)胞間，細(xì)胞之間連接變得松散，細(xì)胞膨大。因此推測(cè)出是導(dǎo)入BnCesA1反義表達(dá)載體的煙草細(xì)胞壁合成受到抑制，導(dǎo)致纖維素含量出現(xiàn)下滑。之后，蔣杰[25]、劉昱翔[26]等人陸續(xù)克隆了BnCesA1、BnCesA2、BnCesA3、BnCesA4、BnCesA5、BnCesA6、BnCesA7(部分)。分析這些基因長(zhǎng)度為3 120～3 270 bp，具有CesA蛋白的特征結(jié)構(gòu)域，在進(jìn)化上類似于玉米、棉花、擬南芥CesA結(jié)構(gòu)。采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qrt-PCR)技術(shù)對(duì)4個(gè)不同苧麻品種的4個(gè)BnCesA2、BnCesA3、BnCesA4、BnCesA5基因進(jìn)行木質(zhì)部和韌皮部表達(dá)分析，結(jié)果表明：這4個(gè)基因在木質(zhì)部和韌皮部的表達(dá)不存在特異性和規(guī)律性。在整個(gè)BnCesA2、BnCesA4中，4個(gè)品種的表達(dá)含量明顯高于BnCesA3、BnCesA5，這在一定程度上表明前者在苧麻纖維素合成過程中可能具有更重要的作用。

亞麻是自花授粉植物，基因組和植株都較小。目前，亞麻是研究纖維素合酶的較理想模型。高原[27-28]成功克隆到了6個(gè)LusiCesA片段(LusiCesA1、LusiCesA2、LusiCesA3、LusiCesA4、LusiCesA5、LusiCesA6)和5個(gè)LusiCSLD基因片段(LusiCSLD1、LusiCSLD2、LusiCSLD3、LusiCSLD4、LusiCSLD5)。通過BLAST分析發(fā)現(xiàn)，這些基因和楊樹、擬南芥、玉米等植物的相似性在80%以上。吳建忠[29]在已報(bào)道部分序列文獻(xiàn)[30]的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)特異性的引物，高保真PCR，最后測(cè)序后得到了亞麻L(zhǎng)usiCesA1基因的全長(zhǎng)序列，該基因序列長(zhǎng)3 225 bp，利用交錯(cuò)延伸PCR技術(shù)驗(yàn)證了這一結(jié)果，確定片段為L(zhǎng)usiCesA1全長(zhǎng)。于瑩等[31]克隆了亞麻纖維素合成酶LusiCesA8，在對(duì)其進(jìn)行序列分析后，開放讀碼框全長(zhǎng)2 967 bp，共編碼988個(gè)氨基酸。通過BLAST比較，該基因與麻風(fēng)樹、胡楊等植物的CesA8同源性較高，并通過qRT-PCR技術(shù)對(duì)兩種不同的亞麻CesA8進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果表明，兩種物種之間的基因表達(dá)模式具有很高的一致性?；虻谋磉_(dá)在幼苗期(BBCH19)到快速生長(zhǎng)期(BBCH32)由較低狀態(tài)升至頂峰，過渡到現(xiàn)蕾期時(shí)該基因的表達(dá)量又出現(xiàn)下降，至花期(BBCH65)恢復(fù)，并又一次到達(dá)了峰值。出現(xiàn)蒴果之后表達(dá)含量開始下降，但隨蒴果數(shù)量增加，該基因表達(dá)量逐漸增加。吳建忠[32]利用基因敲除獲得亞麻L(zhǎng)usiCesA1 缺失突變體，成功構(gòu)建了SSH抑制消減文庫(kù)，通過抑制差減雜交，構(gòu)建了亞麻纖維素合酶CesA1基因的cDNA文庫(kù)，之后進(jìn)行逆向斑點(diǎn)雜交驗(yàn)證陽(yáng)性克隆，發(fā)現(xiàn)了有122個(gè)基因表達(dá)存在差異，其中27個(gè)未知，95個(gè)則是已知基因的同源克隆。推測(cè)發(fā)覺這些基因中可能對(duì)該基因上調(diào)表達(dá)的基因功能克隆以三類為主：影響代謝途徑、改變蛋白質(zhì)命運(yùn)、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成，共計(jì)約占30%。袁紅梅等人[33]利用Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)的亞麻基因組共鑒定了 45 個(gè)亞麻CesA/Csls家族基因成員，它們分屬于兩類，7 組，在 scaffolds 上分布，基因結(jié)構(gòu)和蛋白基序在組間具有多樣性，在組內(nèi)具有保守性。在不同發(fā)育階段，各種不同的基因存在著一定的時(shí)空特異性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CesA/Csls中的一些基因可以對(duì)于激素 BR、Brz 及NaCl 脅迫產(chǎn)生一定響應(yīng)。江海霞[34]等人研究了亞麻快速生長(zhǎng)期莖纖維CesA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)快速生長(zhǎng)期亞麻莖韌皮纖維細(xì)胞壁沒有次生加厚過程。在亞麻細(xì)胞壁伸長(zhǎng)過程中，有LusiCESA1、LusiCESA3、LusiCESA9和LusiCESA10基因的參與。

4 棉花纖維素合酶CesA研究進(jìn)展

1996年，pear從陸地棉中鑒定出了兩個(gè)CesA基因，這是人類首次從高等植物中鑒定出的纖維素合酶基因[35]。王如意克隆了GhCesA6和GhCesA7，發(fā)現(xiàn)GhCesA6在棉纖維整個(gè)發(fā)育時(shí)期表達(dá)量都很高，說明該基因在棉纖維初生壁的合成中起重要作用，GhCesA7在次生壁中大量表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)GhCesAs的表達(dá)含量會(huì)在對(duì)提取的棉細(xì)胞膜蛋白加入纖維素酶后出現(xiàn)提升，加速纖維素的體外合成[36]。范建克隆了GhCesA5、GhCesA8、GhCesA10，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和抗體制備。他在對(duì)CesA復(fù)合體鑒定過程中發(fā)現(xiàn)，除了有已經(jīng)報(bào)道過的CesA家族、SuSy家族及細(xì)胞骨架蛋白(actin等)，還有纖維素內(nèi)切酶，但目前并沒有證據(jù)證明該酶是CesA復(fù)合體的一部分，這可能為解析纖維素合酶的功能提出了一個(gè)新的方向[37]。通過Western bloting發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)棉纖維的發(fā)育時(shí)期，GhCesA5和GhCesA10都有很高的表達(dá)量，是典型的初生壁纖維素合酶基因；GhCesA8在初生細(xì)胞壁形成時(shí)期不表達(dá)，但是進(jìn)入次生細(xì)胞壁合成時(shí)期，表達(dá)含量突然急劇增加，說明它是次生細(xì)胞壁合成基因[38]。李先良在次生生長(zhǎng)旺盛的棉纖維細(xì)胞中鑒定出了兩種CesA：初生細(xì)胞壁合成的和次生細(xì)胞壁合成的CesA，這種結(jié)果和擬南芥研究中發(fā)現(xiàn)的一致，推測(cè)出CesA可能形成兩種不同類型復(fù)合體，初生壁合成復(fù)合體和次生壁合成復(fù)合體。CesA及復(fù)合體在初生壁和次生壁中的不同可能是導(dǎo)致棉花初生次生纖維聚合度不同的原因[39-40]。

5 展望

細(xì)胞壁是植物細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)，在植物結(jié)構(gòu)組成中起著重要作用。細(xì)胞中也存在著一種次生增厚的現(xiàn)象，如厚壁細(xì)胞、纖維細(xì)胞、管狀導(dǎo)管等。細(xì)胞壁的主要成分是纖維素，次生加厚的主要物質(zhì)是木質(zhì)素，為次生加厚的細(xì)胞提供了保護(hù)和抵抗損傷及病原體的能力。植物纖維素合成機(jī)制一直是研究人員關(guān)注的問題。纖維素的合成調(diào)節(jié)涉及多個(gè)方面，包括CesA蛋白的表達(dá)、調(diào)控、修飾和分泌，胞質(zhì)中CSC復(fù)合體的裝配，纖維素的合成與沉積[33]。在棉花和麻類植物中，人類能利用的最重要的是其天然纖維。對(duì)這些植物的纖維素的研究可以幫助人類提高其纖維質(zhì)量，從而進(jìn)一步培育出纖維性能更好、纖維產(chǎn)量更高的優(yōu)良品種。20多年來，纖維素合成酶的研究取得了很大進(jìn)展，然而對(duì)于天然纖維植物的纖維素合成酶的研究才剛剛開始，許多基因尚未得到深入研究，特別是類纖維素合成酶CSL蛋白，目前其功能和分子生物學(xué)機(jī)制還不是很清楚，有待進(jìn)一步研究。

對(duì)于麻類作物的纖維素合酶研究，不僅可以通過對(duì)纖維素合酶基因進(jìn)行研究，還可以從分子生物學(xué)的手段入手，通過CRISPER、RNAi、miRNA、轉(zhuǎn)錄組等分子生物學(xué)手段進(jìn)行研究。例如：在亞麻莖的激光顯微解剖采集樣本，發(fā)現(xiàn)了在韌皮部纖維侵入性伸長(zhǎng)過程中表達(dá)差異的miRNA及其靶基因，如miR396s。該基因家族和它們的靶點(diǎn)(如生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子)與更晚發(fā)育的纖維和不同細(xì)胞類型的纖維相比，miR396家族的幾個(gè)成員在侵入性纖維伸長(zhǎng)過程中出現(xiàn)了下調(diào)，這表明miR396家族的表達(dá)具有組織特異性和階段特異性，說明miR396、AGO7和miR390等復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)可能在侵入性延伸過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，這種現(xiàn)象可能和植物的激素調(diào)節(jié)有關(guān)，如miR160，就和生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)有關(guān)[41]。還有研究表明，在亞麻中發(fā)現(xiàn)了大量的保守植物miRNA，其可能在亞麻的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用，這就給亞麻纖維的生長(zhǎng)研究提供了新的思路[42]。

研究表明，磷酸化或s-酰化等翻譯后修飾調(diào)控纖維素的合成，且一些蛋白因子參與了纖維素合成的調(diào)控，如金屬硫蛋白[43]，在其他植物中已經(jīng)證明了金屬硫蛋白在其中的作用。富含纖維素的植物細(xì)胞類型金屬硫蛋白(metallothionein)通過向GhCESA蛋白的鋅結(jié)合域提供鋅離子，參與了CESA復(fù)合物的形成調(diào)控[44]，這同樣為這些種子纖維植物的纖維素合酶研究提供了另一個(gè)思路：這些蛋白因子是如何和怎樣和其纖維素合酶作用，從而達(dá)到調(diào)控表達(dá)效果。

以亞麻為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究其14個(gè)CesA基因的在不同部位和不同生長(zhǎng)時(shí)期的差異表達(dá)情況取得了一定的進(jìn)展，待找出差異表達(dá)基因之后，就可以運(yùn)用基因敲除等手段，解析不同CesA基因在亞麻中的表達(dá)情況和作用，為培育出含有更優(yōu)質(zhì)纖維的亞麻提供理論基礎(chǔ)。