糖尿病相關(guān)hsa-miR-223-3p 靶基因預(yù)測及生物信息學(xué)分析

余夢娜，楊 標(biāo)，仰禮真

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200011；2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 200011

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一種以高血糖為特征的常見代謝性疾病。據(jù)統(tǒng)計2015 年全球DM 患者已超過4.15 億，預(yù)計2030 年將達(dá)5.52 億[1]。DM 的發(fā)生過程受多種因素的影響，包括DM 病程、肥胖、遺傳等。若未能得到及時控制，患者將出現(xiàn)糖尿病性視網(wǎng)膜病變、腎病、心血管系統(tǒng)疾病等并發(fā)癥[2-3]。因此，探究DM 的發(fā)生機(jī)制、優(yōu)化其治療策略對控制DM 病情進(jìn)展十分必要。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種高度保守的非編碼小RNA，其可通過識別、特異性結(jié)合信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3'非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）， 調(diào) 控mRNA 翻 譯。 研 究[4]顯 示，miRNA 參與了多種生物學(xué)過程的調(diào)控，包括細(xì)胞分化、增殖、凋亡，血管生成以及細(xì)胞周期等。有研究[5-6]發(fā)現(xiàn)hsa-miR-223 在DM 患者中的表達(dá)水平顯著低于健康人群，尤其是外周單個核細(xì)胞中，繼而推測hsa-miR-223 可能是DM 發(fā)生與發(fā)展過程中的潛在生物學(xué)靶標(biāo)。本文擬通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測DM 相關(guān)hsa-miR-223-3p 的靶基因，并尋找與DM 有關(guān)的生物標(biāo)志物，以期為臨床診療中分子生物學(xué)靶點的選擇提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 靶基因集獲取

以“（miR-223-3p） AND human disease”為 檢 索 詞，使 用PubMed（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/） 數(shù)據(jù)庫對已發(fā)表的hsa-miR-223-3p 相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行檢索，并發(fā)現(xiàn)該miRNA 在多種疾病中發(fā)揮作用，故將其作為研究對象。本研究將hsa-miR-223-3p 提交至starBase（version 2.0；http://starbase.sysu. edu.cn/）靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫的miRNA-mRNA 這一導(dǎo)航欄中進(jìn)行預(yù)測，篩選條件為：Program ≥2、CLIP-Data ≥0、low stringency。去除重復(fù)mRNA 之后，得到hsa-miR-223-3p 的靶基因集。

1.2 功能富集分析和信號通路分析

為研究hsa-miR-223-3p 及其靶基因潛在的生物功能及信號通路，將已獲得的靶基因上傳至DAVID（database for annotation，visualization and integrated discovery）（https://david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫行基因本體數(shù)據(jù)庫（Gene Ontology，GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome，KEGG）通路分析。同時，使用Reactome（https://www.reactome.org/）數(shù)據(jù)庫對靶基因進(jìn)行通路研究。隨后，用R 語言的GOplot包對靶基因功能結(jié)果進(jìn)行可視化繪圖。其中，GO 功能分析包括生物學(xué)過程 （biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞組成成分（cell component，CC）。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和模型的選擇

為鑒別中樞基因并篩選模型，將靶基因集上傳至STRING（version 10.5；http://www.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行在線分析，建立蛋白-蛋白相互作用（protein- protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)[7]，并通過Cytoscape 軟件（version 3.5.1；www.cytoscape.org）及Cytohubba 插件對PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行繪制。Cytohubba 插件共包含11 種分析參數(shù)，本研究以連接度（Degree）作為參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，對PPI 網(wǎng)絡(luò)中的區(qū)域進(jìn)行連接度分析，篩選排名前30 位的中樞基因。同時，使用MCODE 插件篩選評分排名前3 位的子模塊，實現(xiàn)聚類結(jié)果的可視化。隨后，通過DAVID 數(shù)據(jù)庫對模塊中的中樞基因進(jìn)行KEGG 通路分析，檢驗其通路富集情況。

1.4 DM 相關(guān)中樞基因的篩選

為進(jìn)一步縮小hsa-miR-223-3p 靶基因的范圍并提高預(yù)測的準(zhǔn)確性，將Cytohubba 插件獲得的中樞基因集與經(jīng)KEGG 通路分析獲得的胰島素分泌通路涉及的基因集繪制Venn 圖，以篩選與DM 相關(guān)的中樞基因。

2 結(jié)果

2.1 Hsa-miR-223-3p 相關(guān)文獻(xiàn)檢索及其靶基因篩選

經(jīng)PubMed 檢索后發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-223-3p 在結(jié)腸癌[8]、腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）[9]、卵巢癌[10]、睪丸生殖細(xì)胞瘤（testicular germ cell tumor，TGCT）[11]等疾病中表達(dá)上調(diào)，在口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）[12]、骨肉瘤[13]等疾病中表達(dá)下調(diào)。此外，其還參與了肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）[14]、糖尿病腎病[15]、視網(wǎng)膜色素上皮炎性損傷[16]、脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）[17]、低氧損傷[18]、骨關(guān)節(jié)炎[19]等過程（表1）。隨后，采用starBase 靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫的7 種算法中至少2 種算法同時預(yù)測基因與hsa-miR-223-3p 靶向結(jié)合，共得到1 094 個mRNA。去除重復(fù)基因后，最終獲得870 個靶基因。

表1 Hsa-miR-223-3p 靶基因參與部分疾病的發(fā)生與發(fā)展Tab 1 Hsa-miR-223-3p target genes involved in the occurrence and development of some diseases

Continued Tab

2.2 Hsa-miR-223-3p 靶基因的GO、KEGG 和Reactome分析

GO 功能分析顯示，hsa-miR-223-3p 靶基因主要存在于胞漿和核漿中，顯著富集于蛋白質(zhì)結(jié)合、RNA 結(jié)合、連接酶活性等方面，參與RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的調(diào)節(jié)、細(xì)胞對胰島素刺激的反應(yīng)、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控等過程（圖1）。KEGG 通路分析顯示，hsa-miR-223-3p 靶基因主要參與泛素介導(dǎo)的蛋白水解、癌癥的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、減數(shù)分裂、甲狀腺激素信號傳導(dǎo)、胰島素分泌等通路（圖2）。 Reactome 通路分析顯示，hsa-miR-223-3p 靶基因主要富集在雌激素依賴型基因表達(dá)、人類免疫缺陷病毒蛋白R（Vpr）介導(dǎo)的前嵌合復(fù)合體入核、來源于無內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄本的成熟mRNA 的轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)反應(yīng)中，其中排名前10 位的通路總結(jié)如表2。

表2 Hsa-miR-223-3p 靶基因富集排名前10 位的通路Tab 2 Top 10 pathways of hsa-miR-223-3p target genes enrichment

2.3 Hsa-miR-223-3p 靶基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及模塊分析

將預(yù)測得到的靶基因數(shù)據(jù)上傳到STRING 數(shù)據(jù)庫中，獲得靶基因?qū)?yīng)的PPI 網(wǎng)絡(luò)。研究[20]顯示，2 個或2 個以上的蛋白質(zhì)會通過非共價鍵形成蛋白復(fù)合體，且蛋白質(zhì)之間的相互作用越多則該蛋白質(zhì)越重要。利用STRING構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)后，將PPI 評分＞0.9 作為閾值條件，通過Cytohubba 插件篩選出連接度排名前30 的節(jié)點。由于第30 和第31 個節(jié)點的連接度均為21，故最終納入連接度≥21 的31 個節(jié)點為中樞基因。利用MCODE 插件篩選出PPI 中評分排名前3 位的子模塊（圖3），并通過DAVID數(shù)據(jù)庫對模塊中的中樞基因進(jìn)行KEGG 通路分析，結(jié)果顯示模塊1 的靶基因主要富集于泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用，模塊2 的靶基因主要參與RNA 轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞周期，模塊3 的靶基因主要參與內(nèi)吞作用（表3）。

圖1 Hsa-miR-223-3p 靶基因的GO 功能分析Fig 1 GO function analysis of hsa-miR-223-3p target genes

圖2 Hsa-miR-223-3p 靶基因的KEGG 通路分析Fig 2 KEGG pathway analysis of hsa-miR-223-3p target genes

表3 排名前3 位的子模塊中中樞基因的KEGG 通路分析Tab 3 KEGG pathway analysis of hub genes in top 3 modules

2.4 DM 相關(guān)中樞基因的獲取

將Cytohubba 插件獲得的31 個中樞基因集和KEGG分析獲得的胰島素分泌通路中的基因集數(shù)據(jù)制作Venn 圖，得到兩者交集的靶基因為PRKACB（圖4）。因此，我們預(yù)測在DM 發(fā)病過程中，PRKACB 可能作為hsa-miR-223-3p 的靶基因?qū)σ葝u素分泌通路發(fā)揮調(diào)控作用。

3 討論

DM 分子機(jī)制的識別對靶向診斷和治療十分重要。近年來有文獻(xiàn)報道顯示，miR-124a 和miR-96 可以調(diào)節(jié)胰島素分泌細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)[21]；miR-133a 能誘導(dǎo)DM 患者發(fā)生心肌肥大[22]；miR-223 和miR-23a 在妊娠期DM 中可上調(diào)表達(dá)，并被認(rèn)為是早期妊娠期DM 診斷的分子標(biāo)志物[23]。上述結(jié)果表明，miRNA 不僅可作為疾病診斷、預(yù)后的分子指標(biāo)，還可在臨床疾病靶向基因治療中發(fā)揮作用。既往研究顯示hsa-miR-223-3p 與多種疾病密切相關(guān)，因此我們猜測其可能參與了DM 的發(fā)病過程。

本研究通過starBase 靶基因預(yù)測庫建立了一個包含870 個hsa-miR-223-3p 靶基因的數(shù)據(jù)集。這些靶基因主要存在于胞漿和核漿中，在RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的調(diào)節(jié)、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、細(xì)胞對胰島素的應(yīng)答等生物過程中發(fā)揮作用，同時還主要參與泛素介導(dǎo)的蛋白水解、減數(shù)分裂、甲狀腺激素信號傳導(dǎo)、胰島素分泌等通路。利用Cytohubba 插件篩選出連接度排名前31 的中樞基因，依次 為POLR2H、VHL、GAN、FBXW2、KLHL3、WSB1、FBXW7、KBTBD6、ASB6、ATG7、WWP1、FBXL14、CBLB、UBE2A、SIAH1、CDC23、CDC27、RNF213、HERC4、RNF4、UBR1、TRIM37、RNF220、RNF34、RNF217、UBE2W、SH3RF1、RANBP2、PRKACB、PAFAH1B1、NUP160。目前，已有學(xué)者探索了其中部分中樞基因與血糖及DM 間的聯(lián)系。例如有研究[24]發(fā)現(xiàn)，VHL 是維持第一時相胰島素分泌以及血糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)因子之一。β 細(xì)胞中VHL 的缺失會激活缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxiainducible factor，HIF），并使葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌能力受損，從而導(dǎo)致葡萄糖耐受不良[25]。FBXW7 可直接與胎球蛋白A 結(jié)合，誘導(dǎo)其泛素化和蛋白酶體降解，從而升高血糖，增加DM 的發(fā)生風(fēng)險[26]。ASB6 作為胰島素受體信號復(fù)合體中的一分子，主要表達(dá)于脂肪細(xì)胞，其可通過使含PH 和SH2 結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（adapter protein with a pleckstrin homology and SH2 domain，APS）及其復(fù)合物泛素化，使APS 失去傳導(dǎo)胰島素信號的作用[27]。在DM 患者中，其ATG7 的表達(dá)水平較低使得由ATG7 介導(dǎo)的細(xì)胞自噬作用對胰島素的反應(yīng)性下降，從而導(dǎo)致血糖維持較高的狀態(tài)[28]。WWP1 可能通過與腺苷酸活化蛋白激酶亞型2 （AMP-activated，α 2 catalytic subunit，AMPKa2） 的 相互作用下調(diào)其表達(dá)，參與胰島素抵抗，導(dǎo)致血糖升高[29]。CBLB 通過影響T 細(xì)胞激活途徑參與1 型DM 等自身免疫疾病[30]。DM 中高密度脂蛋白可通過上調(diào)參與HIF 穩(wěn)定性的SIAH1 等關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，修復(fù)DM 中受損的血管新生能力[31]。然而在31 個中樞基因中，仍有許多靶基因與DM 的關(guān)系未被探索。如，F(xiàn)BWXW2 被證實能降解β-連環(huán)素，降低細(xì)胞遷移能力，且肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力的提高均與FBWXW2 表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)[32]，但尚未有文獻(xiàn)研究FBXW2 在DM 中的作用。

PRKACB 屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，是cAMP 依賴性蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）的催化亞基之一[33]。PKA 可通過與cAMP 的相互作用調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)，參與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和分化等細(xì)胞反應(yīng)。目前，已有文獻(xiàn)就PRKACB 與miRNAs 之間的相互作用進(jìn)行報道。在急性髓性白血病中，miR-496 的表達(dá)被抑制，而其靶基因PRKACB 的表達(dá)增加，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡[34]；在肝癌中，miR-302-3p 通過抑制PRKACB 蛋白的表達(dá)，抑制類固醇受體輔助活化因子（steroid receptor coactivator，Src）和CREB（環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白）的磷酸化水平，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[35]；在阿爾茨海默病中，miR-200-3p 通過靶向PRKACB 抑制tau 蛋白的過磷酸化，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[33]；miR-200c 可直接作用于靶基因PRKACB，通過抑制cofilin 蛋白的磷酸化達(dá)到抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的效果[36]。同時，PRKACB 還可通過其他方式參與到人類疾病中，如在肝外膽管癌中發(fā)現(xiàn)PRKACB 可與成纖維細(xì)胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor 2，F(xiàn)GFR2）發(fā)生基因融合[37]。但有關(guān)PRKACB 與DM 之間的關(guān)系，仍尚未見報道。根據(jù)本研究獲得的Venn 圖，我們預(yù)測在DM 的發(fā)病過程中，hsa-miRNA-223-3p 的靶基因PRKACB 可能通過胰島素分泌通路發(fā)揮作用，未來其或可成為干預(yù)DM 病程發(fā)展的一個新靶點。由于本研究僅為初步預(yù)測，尚缺乏臨床標(biāo)本和細(xì)胞實驗的驗證，就hsa-miR-223-3p 對靶基因的調(diào)控作用還需更深入的研究加以證實。

綜上，本研究通過生物信息學(xué)方法對hsa-miR-223-3p進(jìn)行靶基因預(yù)測、GO 功能分析、KEGG 及Reactome 通路分析，結(jié)果顯示hsa-miR-223-3p 可能通過調(diào)控多個靶基因參與信號通路的調(diào)節(jié)，在機(jī)體的多種生理與病理過程中發(fā)揮重要作用；同時，我們初步預(yù)測hsa-miR-223-3p 可能通過PRKACB 調(diào)控胰島素分泌，對其進(jìn)一步深入研究可為我們后續(xù)探索DM 發(fā)病機(jī)制及治療新靶點提供理論指導(dǎo)，還可為今后DM 的機(jī)制研究與治療提供更多新的思路。

參·考·文·獻(xiàn)

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