STAT3 對免疫缺陷鼠過繼轉移CD8+ T 細胞的調節(jié)作用

曾群雄 ，鄧 軍 ，沈 南

1. 上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院，上海市風濕病學研究所，上海200127；2. 上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院中澳個體化自身免疫病 研究中心，上海200127

CD8+T 細胞是適應性免疫的重要組成部分，作為免疫監(jiān)控細胞在清除病原微生物和腫瘤細胞中發(fā)揮重要的作用[1]。Na?ve CD8+T 細胞在胸腺發(fā)育成熟后，遷移到外周淋巴器官或組織，經(jīng)MHC 提呈抗原肽結合T 細胞受體（T cell receptor，TCR）、共刺激分子（CD28:CD80/CD86）和細胞因子激活并促進分化為CD8+效應T 細胞（effector T cell，Teff）[2]。活化的CD8+T 細胞又稱為細胞毒性細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL），通過分泌腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）和干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）等細胞因子，表達細胞死亡受體配體（Fas ligand，F(xiàn)asL）和CD107a 等表面分子，釋放穿孔素、顆粒酶B（granzyme B，GraB）等細胞毒性分子殺傷腫瘤細胞或被病毒感染的靶細胞[1,3]。

嵌合抗原受體T 細胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）和T 細胞受體工程化T 細胞（T-cell receptor engineered T cell，TCR-T） 是 過 繼 性T 細 胞 療 法（adoptive T-cell therapy，ACT）兩大最新的免疫細胞技術，受到廣泛的關注和研究[4]。白介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-7 和IL-15 等細胞因子用于體外培養(yǎng)或擴增CD8+T 細胞。然而細胞因子介導的信號通路是如何調節(jié)CD8+T 細胞的存活、增殖和維持其效應和免疫記憶功能，目前仍然不清楚。信號轉導和轉錄活化因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）對CD4+T 細胞起著重要的調節(jié)作用，最近研究發(fā)現(xiàn)抑制程序性死亡蛋白1（programmed death-1，PD-1） -STAT3-脂肪酸氧化（fatty acid oxidation，F(xiàn)AO）軸可調節(jié)CD8+T 細胞對乳腺腫瘤的殺傷?；罨腟TAT3 促使CD8+T 效應細胞的FAO 限制CD8+T 細胞對肥胖相關乳腺腫瘤的殺傷功能，從而促進腫瘤的進展。此外，CD8+T 細胞中的PD-1 信號可激活STAT3 以增加FAO，抑制CD8+T 效應細胞的糖酵解和功能[5]。抑制IL-6/JAK/STAT3 信號轉導能夠下調PD1、程序性死亡蛋白配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）的表達[6-7]，增強CD8+T 細胞抗腫瘤的作用。然而STAT3 是如何內(nèi)源性地調控CD8+T 細胞的存活、活化、增殖及功能目前尚未被完全闡述。

免疫缺陷Rag1-/-小鼠可以用來評估Na?ve CD4+T 細胞在體內(nèi)的存活、遷移、增殖及功能[8-9]。本實驗研究使用C57/B6-CD45.2 背景CD8+T 細胞中條件性敲除Stat3 小鼠和C57/B6-CD45.1 野生型小鼠的脾臟細胞，流式分選出Na?ve CD8+T 細胞后，經(jīng)羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE）標記，然后按照相同數(shù)量混合過繼轉移到Rag1-/-小鼠。通過流式分析追蹤CD8+T 細胞在體內(nèi)的遷移并檢測其免疫表征，評估STAT3 對于CD8+T 細胞的存活、增殖、活化和功能的重要內(nèi)在調控作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象、主要試劑及儀器

1.1.1 實驗動物 研究使用的CD45.1 野生型（wild type，WT）小鼠購自上海南方模式生物科技股份公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2017-0010；Rag1-/-小鼠（B6.129S7-Rag1tm1Mom/J，編號002216）、CD8-Cre 轉基因小 鼠[C57BL/6- Tg（CD8a-cre）1Itan/J，編號008766]和Stat3loxp/loxp小 鼠（B6.129S1-Stat3tm1Xyfu/J，編 號016923）為C57BL/6背景，均購自美國JAX 實驗室。為了研究Stat3 信號對CD8+T 細胞中的內(nèi)在調控作用，我們通過CD8-Cre 轉基因小鼠和Stat3loxp/loxp小鼠構建得到C57BL/6-CD45.2-CD8（ΔStat3）小鼠。同品系交配繁殖，C57/B6-Rag1-/-小鼠5 只作為受體小鼠，5 只C57/B6-CD45.1 WT 小鼠和5 只C57/B6-CD45.2-CD8（ΔStat3）小鼠作為供體，體質量21 ～22 g，均為雄性，周齡為8 ～10 周。所有實驗小鼠飼養(yǎng)在上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院實驗動物屏障設施內(nèi)，實驗動物使用許可證號SYXK（滬）2016-0009，小鼠飼以60Co 輻照殺菌飼料，自由進食。飼養(yǎng)條件：溫度22 ～24 ℃，空氣相對濕度40%～60%，光照周期為12 h/12 h。本研究的動物飼養(yǎng)條件符合相應實驗動物等級標準，所有動物相關操作均按照上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟實驗動物倫理委員會的規(guī)定執(zhí)行。

1.1.2 主要試劑和儀器 Ficoll 淋巴細胞分離液購自美國GE 公司，40 μm 和100 μm 孔徑細胞篩網(wǎng)購自美國BD 公司，Centrifuge 5801 R 離心機購自德國Eppendorf 公司，流式細胞分選儀（Aria Ⅲ）和流式細胞分析儀（Fortessa X-20）購自美國BD 公司，佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）、離子霉素（ionomycin，Ion）、莫能霉素（monensin）購于美國Sigma 公司，RPMI-1640 培養(yǎng)基購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司，蛋白轉運抑制劑BFA、Zombie Aqua ?細胞活性染料試劑盒購自Biolegend公司，流式抗體購自美國Biolegend、BD 和Invitrogen 公司（表1），細胞因子染色試劑盒Cytofix/Cytoperm ?細胞固定/通透液試劑盒購自美國BD 公司。

表1 小鼠流式抗體Tab 1 Mouse antibodies for flow cytometry

Continued Tab

1.2 主要方法

1.2.1 供體細胞的準備 選擇8 ～10 周雄性CD45.1 WT小鼠和CD8（ΔStat3）小鼠，處死后分離脾臟，用濾網(wǎng)研磨過濾去除細胞團塊。經(jīng)紅細胞裂解液處理后，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌和細胞計數(shù)后，用培養(yǎng)基重懸細胞。染色細胞死活染料和流式熒光抗體，然后上機進行流式分選。使用Aria Ⅲ流式細胞分選儀分選 出（PI-B220-CD3+CD8+CD44-CD62L+）Na?ve CD8+T 細胞。源于B6-CD45.1 小鼠和B6-CD45.2-CD8（ΔStat3）小鼠的Na?ve CD8+T 細胞經(jīng)過分選收集和細胞計數(shù)后按照數(shù)量1:1 混合，使用1 μg/mL CFSE 在37℃染色。2×106個 Na?ve CD8+T 細胞經(jīng)尾靜脈注射轉移到Rag1-/-小鼠 體內(nèi)。

1.2.2 細胞收集 過繼轉移10 d 后處死Rag1-/-小鼠，分離并收集小鼠的脾臟、腹股溝淋巴結和腸系膜淋巴結，研磨后使用100 μm 濾網(wǎng)過濾去除細胞團塊，制備成單細胞懸液，用RPMI-1640 完全培養(yǎng)基重懸并行細胞計數(shù)。

1.2.3 流式細胞術 收集細胞后，用RPMI-1640 完全培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2條件下，加入50 ng/mL PMA、1 μg/mL Ion 和1 μg/mL 莫能霉素刺激4 h。收集細胞進行封閉后，染色表面抗體和細胞活力染料，固定破膜后，染色胞內(nèi)細胞因子抗體，用染色緩沖液清洗隨后進行流式細胞術檢測。

1.3 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

流式原始數(shù)據(jù)使用FlowJo 10.5 軟件，所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism（GraphPad Version 8.2）軟件進行分析和統(tǒng)計。數(shù)據(jù)連續(xù)變量若符合正態(tài)分布以±s 表示，若不符合正態(tài)分布以M（Q1，Q3）表示。對于連續(xù)型變量首先進行正態(tài)性檢驗，如果各組均滿足正態(tài)性且2 組間方差齊，采用獨立樣本t 檢驗進行組間比較；若以上條件不滿足，則采用非參數(shù)Mann-Whitney U 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Na?ve CD8+ T 細胞的分選和收集

技術流程主要包括細胞分離、流式分選、CFSE 細胞標記、過繼轉移及后續(xù)檢測。CD45.1 小鼠和CD8（ΔStat3）小鼠的CD8+T 細胞流式分選策略（圖1）。分選得到的Na?ve CD8+T 細胞經(jīng)流式分析儀確認細胞純度后（純度＞95%）進行細胞計數(shù)，用CFSE 標記后，將2×106個 細胞/200 μL 體系經(jīng)尾靜脈過繼轉移到Rag1-/-小鼠。

圖1 小鼠Na?ve CD8+ T 細胞的流式分選Fig 1 Fluorescence activated cell sorting of Na?ve CD8+ T cell from B6-CD45.1-WT mice and B6-CD45.2-CD8 (ΔStat3) mice

2.2 流式檢測過繼轉移Rag1-/-小鼠CD8+ T 細胞

過繼轉移10 d 后檢測CD8+T 細胞在脾臟（spleen，SP）、腹股溝淋巴結（popliteal lymph nodes，pLNs）和腸系膜淋巴結（mesenteric lymph nodes，mLNs）中的分布、占比及其免疫表征的變化。流式細胞術結果顯示轉移后Rag1-/-小鼠體內(nèi)的SP、pLNs、mLNs 中均檢測到CD8+T 細胞，CD8+T 細胞占CD45+免疫細胞的百分比分別為37.7%、50.1%和36.1%（圖2）。

圖2 Rag1-/-小鼠體內(nèi)脾臟和淋巴結中的CD8+ T 細胞流式細胞術檢測Fig 2 Fluorescence activated cell detection of CD8+ T cells in spleen and lymph nodes of Rag1-/- mice

2.3 Stat3 敲除后對Na?ve CD8+ T 細胞增殖和活化的影響

T 細胞過繼轉移到免疫缺陷的小鼠體內(nèi)，其活化和增殖的過程稱為淋巴細胞減少誘導的增殖（lymphopenia induced proliferation，LIP），這一過程取決于T 細胞受體接受的抗原刺激信號種類和共刺激信號的強度。為排除小鼠個體差異的影響，CD45.1+WT CD8+T 細胞和CD45.2-ΔStat3 CD8+T 細胞按照1:1 比例混合輸注至同窩Rag1-/-小鼠體內(nèi)。如圖3 所示，在脾臟和淋巴結的CD8+T 細胞中，WT CD45.1+CD8+T 細胞較CD45.2-ΔStat3 CD8+T 細胞（n=5）的組成比例和細胞數(shù)量更高。在SP 和pLNs 中，WT CD8+T 細胞的細胞陽性率約為ΔStat3 CD8+T 細胞的 2 倍，統(tǒng)計學差異顯著（均P=0.008）。此外在mLNs 內(nèi)中ΔStat3 CD8+T 細胞活化的細胞數(shù)量較WT CD8+T 細胞呈減少趨勢。

通過CFSE 標記CD8+T 細胞在體內(nèi)增殖情況，并定義CD44 表達陽性為激活的細胞，對CD8+T 細胞的活化情況進行檢測。結果發(fā)現(xiàn)在SP 和LNs 中均檢測到大量增 殖 的CD45.1+CD8+T 細 胞 和CD45.1-ΔStat3 CD8+T 細胞。而SP 和mLNs 中，WT CD8+T 細胞的激活CD8+T 細胞數(shù)量較ΔStat3 CD8+T 細胞增加（P=0.222，P=0.311）。ΔStat3 CD8+T 細胞在pLNs 中細胞活化的比例和細胞數(shù)量均比WT CD8+T 細胞顯著降低和減少（均P=0.008）。說明STAT3 對CD8+T 細胞在體內(nèi)增殖和活化十分重要。

圖3 CD8+ T 細胞增殖和活化的流式細胞術檢測Fig 3 Fluorescence activated cell detection of CD8+ T cells proliferation and activation

2.4 Stat3 敲除對CD8+ T 細胞炎癥因子產(chǎn)生的影響

圖3 結果表明ΔStat3 CD8+T 細胞增殖和活化受到影響，我們進一步分析Stat3 敲除對CD8+T 細胞炎癥細胞因子產(chǎn)生的影響。細胞因子TNF-α 和IFN-γ 主要由增殖的CD8+T 細胞產(chǎn)生；在pLNs 中，（ΔStat3）CD8+T 細胞產(chǎn)生TNF-α（圖4A）和IFN-γ（圖4B）比率顯著低于WT CD8+T 細胞（P=0.008，P=0.039）。在SP 中僅有數(shù)量差異，這些結果說明Stat3 敲除后CD8+T 細胞產(chǎn)生TNF-α和IFN-γ 的能力受損。

圖4 CD8+ T 細胞產(chǎn)生的TNF-α 和IFN-γ 的流式細胞術檢測Fig 4 Fluorescence activated cell detection of TNF-α and IFN-γ produced by CD8+ T cells

2.5 Stat3 敲除對CD8+ T 細胞FasL 和GraB 表達的影響

如圖5 所示，SP 中FasL 的比率在WT CD8+T 細胞與ΔStat3 CD8+T 細胞無顯著差異（P=0.999）；pLNs 中FasL 的比率在ΔStat3 CD8+T 細胞的比例和數(shù)量均顯著降低（P=0.030，P=0.008）；而在mLNs 中表達FasL 的ΔStat3 CD8+T 細胞比例顯著增加（P=0.030），但細胞數(shù)量沒有差異（P=0.421）。SP 和pLNs 中ΔStat3 CD8+T 細胞表達GraB 的細胞比例和細胞數(shù)量顯著少于WT CD8+T 細胞（均P＜0.005）。mLNs 中GraB 的CD8+T 細胞比例無統(tǒng)計差異（P=0.230），但GraB 的ΔStat3 CD8+T 細胞數(shù)量比WT CD8+T 細胞顯著減少（P=0.025）。

圖5 CD8+ T 細胞的細胞毒性效應分子流式細胞術檢測Fig 5 Fluorescence activated cell detection of cytotoxic effectors produced by CD8+ T cells

2.6 Stat3 敲除對CD8+ T 細胞中CD107a 和caspase3 的表達影響

SP、pLNs 和mLNs 中CD8+CD107a+T 細胞主要由增殖的CD8+T 細胞表達，CD107a 是CD8+T 細胞發(fā)揮功能的重要效應分子。流式檢測結果（圖6）顯示，在pLNs 和mLNs中表達CD107a 陽性率在WT CD8+T 細胞與ΔStat3 CD8+T 細胞無顯著差異（P=0.222，P=0.420），但在SP 中表達CD107a 的ΔStat3 CD8+T 細胞陽性比率和數(shù)量顯著降低（P=0.042，P=0.031）；在SP 和pLNs 中，caspase3 的ΔStat3 CD8+T 細胞比率和細胞數(shù)量降低和減少（均P＜0.05）；在mLNs中caspase3 的ΔStat3 CD8+T 和WT CD8+T 細胞表達的比率和細胞數(shù)量無顯著差異（P=0.952，P=0.309）。

圖6 CD8+ T 細胞的CD107a 和caspase3 流式細胞術檢測Fig 6 Fluorescence activated cell detection of CD107a and caspase3 produced by CD8+ T cells

3 討論

在胸腺發(fā)育成熟后，Na?ve CD8+T 細胞遷移到外周，經(jīng)MHC Ⅰ類分子提呈抗原肽結合TCR，CD28 結合CD80/86，同時細胞因子信號通路分化為效應細胞執(zhí)行免疫功能。細胞因子及其介導的信號通路對維持CD8+T 細胞的存活、增殖和效應功能具有重要作用。如在體外培養(yǎng)中，IL-2、IL-7 和IL-15 維持CD8+T 細胞的增殖和維持效應功能[10-11]，CD4+T 細胞分泌的IL-21 抑制CD8+T 細胞的耗竭。我們首次用Rag1-/-小鼠過繼轉移模型模型，證實了STAT3 在不依賴于CD4+T 細胞和B 細胞的情況下內(nèi)源性地調節(jié)CD8+T 細胞的存活和功能。我們的實驗數(shù)據(jù)證實，STAT3 促進調控CD8+T 細胞的活化、增殖、遷移、細胞因子分泌和殺傷性分子的表達。此外，過繼轉移未經(jīng)抗原刺激的CD8+T 細胞到Rag1-/-小鼠，可以用來評估細胞因子及激活STAT3 等信號通路對CD8+T 細胞功能的調節(jié)作用。腫瘤微環(huán)境中的CD8+T 細胞經(jīng)持續(xù)的抗原刺激以及因缺少CD4+T 細胞的幫助，出現(xiàn)功能耗竭，無法有效地清除腫瘤細胞?；罨腃D4+T 細胞分泌大量的IL-2 和IL-21，IL-2 被FDA 批準用于治黑色素瘤且療效顯著[12]。此外，IL-2/IL-2Rβ 信號通路對CD8+T 細胞增殖也尤為重要[12]。IL-21 可以通過激活下游STAT3 信號通路抑制CD8+T 細胞耗竭狀態(tài)，促進和維持CD8+T 細胞的效應功能，增強對腫瘤的殺傷作用[13-14]。我們的數(shù)據(jù)表明，STAT3 不影響Na?ve CD8+T 細胞在Rag1-/-小鼠體內(nèi)遷移到脾臟和引流淋巴結，也不影響CD8+T 細胞增殖（CFSE信號為低或陰性的CD8+T 細胞）（圖3），但是絕對細胞數(shù)量顯著減少，表明CD8+T 細胞存活率顯著降低，這一結果支持STAT3 對T 細胞的效應功能具有重要調控作用[15]。而Stat3 敲除后CD8+T 細胞中caspase 3 表達比WT小鼠低，這表明STAT3 可能通過其他途徑調節(jié)CD8+T 細胞的存活，如骨肉瘤中異常的STAT3/Nrf2/GPx4 信號軸可誘導鐵死亡增強腫瘤細胞對順鉑的敏感性[16]。

但目前其他炎癥因子對CD8+T 細胞功能的調節(jié)作用仍有待進一步探討。STAT3 信號對Th17 細胞[9]和Tfh 細胞[17]分化及功能都非常重要，然而對CD8+T 細胞的調控作用仍有待進一步研究。Ostanin 等[18]報道了CD4+T 細胞轉移到重度免疫缺陷小鼠體內(nèi)可引起小鼠自發(fā)性結腸炎，Reis 等[9]等通過使用此模型證明STAT3 信號下游的瘦素受體敲除后影響了Th17 亞群的分化和功能。

本研究提示STAT3 對于促進CD8+T 細胞的增殖、活化以及效應分子的表達十分重要。Stat3 敲除后CD8+T 細胞增殖和活化的水平降低，這一結果支持STAT3 對T 細胞的效應功能具有重要調控作用[15]。本研究表明STAT3 信號缺失可抑制CD8+T 細胞產(chǎn)生TNF-α 和IFN-γ 的能力并降低了效應分子FasL、GraB 和CD107a 的表達。Kujawski等[13]、Siegel 等[15]和Mirlekar 等[19]的實驗數(shù)據(jù)顯示STAT3調節(jié)CD8+T 細胞的增殖、存活、細胞毒基因表達和記憶功能對病毒感染作出反應，表明 STAT3 可能是增強 CD8+T 細胞抗腫瘤反應的治療靶點；此外STAT3 通過RoRγt抑制轉錄因子T-bet 和Eomes 的功能從而抑制CD8+T 細胞細胞毒相關效應分子的表達[20]，STAT3 對CD8 效應T 細胞的功能具有十分關鍵的作用。這些結果與在腫瘤和慢性感染研究中提到的研究結論有所不同，可能由多種原因導致：①諸多報道中使用的腫瘤和慢性感染模型中CD8+T 細胞接受的抗原刺激的強度和所處的免疫環(huán)境不完全相同。②T 細胞過繼轉移后發(fā)生LIP 依賴于受體小鼠體內(nèi)的腸道微生物抗原[21]，而腸道共生微生物的組成復雜、具有多樣性，這些因素均可能對CD8+T 細胞的免疫表型有所影響。③STAT3 調控的代謝對CD8+T 細胞效應功能至關重要。研究表明激活的CD8+T 效應細胞經(jīng)歷從產(chǎn)生大量活性氧的糖酵解轉換為脂肪酸氧化的代謝重編程為T 細胞發(fā)揮效應功能提供能量，同時CD8+T 細胞功能和免疫表征也發(fā)生重塑[5,22]；而STAT3 對CD8+T 細胞的這一代謝過程的轉換至關重要，可以直接調控T 細胞的糖脂代謝[23]，Stat3 敲除后CD8+T 細胞整體活化的水平降低和效應功能減弱對糖酵解供能的依賴減少，進而細胞因子分泌和殺傷性分子的表達降低可能更不易凋亡。因此，免疫微環(huán)境的改變可能也影響了STAT3 對CD8+T 細胞的調節(jié) 作用。

綜上所述，CD8+T 細胞的共同過繼轉移是評估細胞因子及下游信號通路內(nèi)在調控CD8+T 細胞的理想模型。我們的實驗數(shù)據(jù)證實STAT3 能內(nèi)在正向調控CD8+T 細胞的活化、增殖及遷移。實驗設計排除了受體小鼠年齡、性別和腸道菌群和其他免疫細胞（CD4+T 細胞和B 細胞）等不同因素可能對結果產(chǎn)生的干擾，具有一定的可靠性。此外，過繼轉移未經(jīng)抗原刺激的CD8+T 細胞到Rag1-/-小鼠來觀察CD8+T 細胞免疫表征的方法，可以用來評估細胞因子及信號通路對CD8+T 細胞功能的內(nèi)在調節(jié)作用，對于篩選維持CD8+T 細胞存活、效應功能的細胞因子并優(yōu)化腫瘤免疫治療方案（anti-PD-1 或CAR-T）具有重要的潛在價值和意義。

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