槲皮苷對噪聲誘導神經(jīng)性耳聾小鼠的保護作用

王立娟，齊 亮，葉 琳，王彥珍，羅安平

(保定市第二醫(yī)院耳鼻喉科，河北 保定 071000)

急性聽力損失(hearing loss，HL)是工業(yè)國家常見的感覺障礙疾病之一，目前已影響到全球約6.8%的人口。HL在2013年和2015年被列為“殘疾”的第四大原因，僅次于腰背和頸部疼痛、抑郁障礙和鐵缺乏癥[1-2]。噪聲誘導的神經(jīng)性耳聾(noise-induced hearing loss，NIHL)是感音神經(jīng)性耳聾(sensorineural hearing loss，SNHL)的一種，是由于螺旋器毛細胞、聽神經(jīng)、聽覺傳導經(jīng)路或各級神經(jīng)元受損害所導致的聲音感受與神經(jīng)沖動傳遞障礙造成的聽力減退[3]。盡管近年來有許多與其相關的藥物研發(fā)，但至今還沒有明確的治療神經(jīng)性耳聾的方法[4]。NIHL的機制包括直接機械損傷和代謝損傷。過度的噪音會對中耳結構、圓形和橢圓形的窗膜以及皮質器官造成損害。耳蝸的外毛細胞(outer hair cells，OHC)極易受到噪聲的影響。噪聲會扭曲毛細胞的纖毛，導致機械傳導的缺陷[5-6]?，F(xiàn)有的證據(jù)[7]表明，氧化自由基的形成是SNHL的關鍵途徑，自由基可通過鄰近細胞的壞死或凋亡破壞細胞膜。以往研究[8]顯示，將C57BL/6J小鼠暴露在110 dB 聲壓級(sound pressure level，SPL)噪聲下1 h，可導致周圍淋巴中的羥基自由基增加4倍，同時導致OHC損傷。同時，有研究[9]認為HL發(fā)生與活性氧(reactive oxygen species，ROS)形成所造成的炎癥級聯(lián)反應有關，這一反應可增加細胞的自噬反應從而誘導毛細胞的死亡。

槲皮苷(Quercetin，Que)是一種廣泛存在于植物中的黃酮類單體化合物。據(jù)報道[10]，Que具有有效清除羥自由基、超氧陰離子自由基以及二苯代苦味肼基等活性氧自由基的能力，并具有一定的抗炎活性。據(jù)此，筆者推測，Que可能對神經(jīng)性耳聾具有潛在的保護作用?；诖?，本研究將觀察Que對NIHL小鼠的作用，并基于氧化應激及自噬探討其作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：40只1.5～2.0個月齡的成年雄性C57BL/6小鼠由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，并置于無特定病原體級環(huán)境飼養(yǎng)，所有小鼠自由獲得食物和水，均接受外耳、中耳及內耳的檢查以排除實驗前內耳聽力功能對實驗的影響。本研究已取得保定市第二醫(yī)院倫理委員會同意。

實驗儀器：2446J動態(tài)揚聲器(美國JBL)，REVOL聽覺腦干電位儀(丹麥Dantec)，SZ51解剖顯微鏡(日本Olympus)，LSM 780激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss)。

實驗試劑：Que(純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；曲拉通X-100(Triton X-100)和3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)抗體(美國Sigma-Aldrich)；C端結合蛋白2(C-terminal binding protein 2，CtBP2)抗體(美國BD Biosciences)；Ⅶ型肌球蛋白(myosin Ⅶ)抗體(美國Proteus Biosciences)；鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)、Alexa Fluor 568和647熒光標記二抗、4-羥基壬醛(4-hydroxynonaldehyde，4-HNE)抗體(美國Invitrogen)；微管相關蛋白輕鏈3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3B，LC3B)抗體(英國Abcam)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組

小鼠按照隨機對照表法隨機分成4組：對照組(Con組)、噪聲暴露組(Noise組)、低劑量Que治療組(L-Que組)、高劑量Que治療組(H-Que組)，每組10只。除Con組外，其余3組小鼠置于懸掛有動態(tài)揚聲器的籠子內，并暴露于105 dB SPL的8 kHz純音噪聲中，每天持續(xù)6 h，連續(xù)7 d；其中L-Que組和H-Que組小鼠在每天噪聲暴露前30 min分別給予腹腔注射50 mg·kg-1·d-1和100 mg·kg-1·d-1的Que生理鹽水溶液，持續(xù)7 d；Noise組小鼠在同時間段給予腹腔注射等體積生理鹽水。Con組小鼠除不進行噪聲刺激外，其他步驟同Noise組。從首次給予噪聲后第7 d，將長度為1.5 mm的針形電極插入小鼠頭皮兩側耳廓后面的眼間背中線(無倒置)，并使用點擊音和全頻程刺激，分別在8、16、24和32 kHz頻率記錄小鼠聽覺腦干反應(auditory brainstem response，ABR)閾值[11]。根據(jù)何景春等[12]的研究，當Noise組小鼠的ABR測試觀察到小鼠聽覺反應閾上升≥10 dB時，即表明神經(jīng)性耳聾模型造模成功。

1.2.2 耳蝸組織的收集

各組小鼠完成聽力測試后，用5%水合氯醛完全麻醉，斷頭并取下顳骨放入0.1 M的PBS溶液中，解剖顯微鏡下打開聽泡，去除鐙骨，挑破圓窗膜及卵圓窗膜，蝸尖打孔，并從蝸尖灌注4%多聚甲醛。取出耳蝸并放入4%多聚甲醛液內4℃過夜。將收集的耳蝸用0.1 M的PBS沖洗，再用1M的稀鹽酸脫鈣5 h，然后用0.1 M的PBS再次沖洗后，在解剖顯微鏡依次從蝸尖至蝸底分離出全耳蝸基底膜。

1.2.3 免疫熒光染色及激光共聚焦觀察耳蝸組織

耳蝸基底膜切成5個片段，用含Triton X-100的封閉溶液室溫懸浮1 h后，耳蝸各片段分別用myosin Ⅶ、CtBP2、Phalloidin、3-NT、4-HNE和LC3B抗體(均1:200)室溫孵育2 h，0.1 M的PBS沖洗3次，然后室溫孵育Alexa Fluor 568、647熒光標記的二抗(1:200)1 h，0.1 M的PBS再次沖洗3次后，用激光共聚焦顯微鏡在與ABR測試頻率相對應的位置對免疫熒光染色的耳蝸進行成像，每組任取5張隨機圖像，并利用Image J統(tǒng)計3-NT、4-HNE和LC3B的相對表達量。利用Image J軟件對myosin Ⅶ染色顯示耳蝸結構進行頻率定位，生成了耳蝸位置-頻率圖。用高分辨率油成像物鏡在1024×1024光柵(135 μm2)中收集Z型疊層，用Zen Blue軟件根據(jù)每個頻率沿75 μm的長度耳蝸的CtBP2染色細胞核數(shù)對內毛細胞(inner outer hair cells，IHC)和OHC進行計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組小鼠ABR閾值的比較

在點擊音刺激下的ABR檢測結果顯示，Con組、Noise組、L-Que組和H-Que組的ABR閾值分別為(20.12±2.03)、(69.31±4.32)、(48.34±7.32)和(37.61±5.42)dB SPL，Noise組較Con組的ABR閾值顯著升高(P<0.001)，L-Que組和H-Que組較Noise組的ABR閾值顯著降低(均P<0.01)。見圖1A。全頻程ABR檢測結果顯示，Noise組在8、16、24和32 kHz頻率均較Con組的ABR閾值顯著升高(均P<0.001)，L-Que組和H-Que組在8、16、24和32 kHz頻率均較Noise組的ABR閾值顯著降低(均P<0.05)。見圖1B。

2.2 各組小鼠耳蝸毛細胞損傷的比較

如圖2A顯示，Con組耳蝸的頂回(8 kHz)、中回(22.4 kHz)和底回(45 kHz)片段的OHC和IHC結構完整且排列整齊；Noise組頂回和中回片段的IHC結構完整且排列整齊，底回片段的IHC有所縮短，頂回片段的OHC排列疏松，中回和底回片段的OHC明顯減少甚至底回片段的OHC喪失；L-Que組和H-Que組頂回、中回片段的IHC結構完整且排列整齊和底回片段的IHC結構有所改善，頂回片段的OHC排列趨向整齊，中回和底回片段的OHC數(shù)量的減少的程度較輕，且H-Que組減少幅度更小。計數(shù)結果顯示，Con組、Noise組、L-Que組和H-Que組IHC數(shù)量無明顯變化(圖2B)；與Con組比較，Noise組在對應于頻率>22.4 kHz的耳蝸的位置處的OHC密度顯著降低(P<0.001)；與Noise組比較，L-Que組和H-Que組對應于頻率>22.4 kHz的耳蝸的位置處的OHC密度顯著增加(均P<0.05)(圖2C)。

2.3 各組外毛細胞3-NT和4-HNE表達水平的比較

免疫熒光結果顯示，與Con組比較，Noise組OHC中3-NT和4-HNE的表達水平均顯著增加(P<0.001)；與Noise組比較，L-Que組和H-Que組OHC中3-NT和4-HNE的表達水平均顯著降低(均P<0.01)，且H-Que組更低(P<0.001)。見圖3。

2.4 各組耳蝸外毛細胞LC3B表達水平的比較

免疫熒光結果顯示，與Con組比較，Noise組OHC中LC3B的表達水平顯著增加(P<0.001)；與Noise組比較，L-Que組和H-Que組OHC中LC3B的表達水平顯著降低(均P<0.01)，且H-Que組更低(P<0.001)。見圖4。

3 討論

近年來，由于NIHL發(fā)病率的增高卻缺乏行之有效的治療方法，使其成為廣受關注的公共衛(wèi)生難題。因此，積極尋找潛在的抗NIHL的藥物具有重大的意義。

NIHL的主要病變部位在耳蝸毛細胞。正常情況下根據(jù)聲音刺激放大基底膜的運動，OHC比IHC更容易受到噪聲傷害，故OHC死亡是該疾病的基礎病理學改變[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在NIHL小鼠中，耳蝸OHC呈現(xiàn)數(shù)量的減少，IHC改變不明顯，表明噪聲可誘導OHC的死亡；而Que可改善噪聲引起的OHC丟失，提示Que可能對NIHL小鼠具有保護作用。以往的研究證據(jù)[14-15]表明，NIHL的早期損傷為患者耳蝸機械損傷引發(fā)其局部組織發(fā)生代謝異常所致，且氧化應激、自噬反映是其發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。噪聲暴露后耳蝸組織會產(chǎn)生過多的活性氧自由基，升高過氧化物的含量，造成不良的氧化應激反應[16-17]。若生成的過氧化物不能及時清除，則會損傷耳蝸組織，造成聽覺的損害。過氧化物3-NT和脂質過氧化物4-HNE的含量常用來衡量機體氧化應激水平[18]。本研究結果顯示，Que可降低噪聲暴露導致的3-NT和4-HNE，提示Que可能通過減輕氧化應激水平來改善噪聲誘導的耳蝸損傷。自噬是通過形成自噬體，包裹胞漿中受損的蛋白質及亞細胞器成分，并與溶酶體融合形成自噬體，進而降解的代謝過程[19]。LC3B是細胞自噬活化過程中的關鍵分子，可有效反映細胞的自噬情況[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，Que可降低噪聲暴露導致的自噬標志物LC3B表達，提示Que可減輕由噪聲誘導的小鼠耳蝸OHC的細胞自噬。已有的研究證據(jù)[21-22]表明，氧化應激可誘導自噬性死亡的產(chǎn)生，而在本研究觀察到Que可同時改善NIHL模型小鼠的氧化應激水平和自噬水平，且經(jīng)Que處理后OHC細胞死亡數(shù)量更少，由此提示Que可能通過減輕耳蝸OHC的氧化應激和自噬作用來發(fā)揮抗NIHL的作用。

綜上，本研究顯示，Que對NIHL小鼠具有保護作用，其保護作用可能是通過減輕耳蝸OHC的氧化應激和自噬作用來實現(xiàn)的，提示Que可能是潛在的抗NIHL藥物。