激光散斑成像技術(shù)監(jiān)測抑郁癥樣小鼠腦血流動力學(xué)改變的初步研究

姚恩生，唐燕，王偉

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，新疆 石河子 832008；2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院老年病科，新疆 石河子 832008；3 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 武漢 430030)

抑郁癥是精神疾病中最普遍的表現(xiàn)形式之一，也是最主要導(dǎo)致殘疾的精神疾病。目前，由于人口老齡化，空巢老人增多，社會隔離或者獨(dú)居已成為老年人抑郁發(fā)病的獨(dú)立危險因素[1]，但其發(fā)病機(jī)制不清。抑郁癥其核心癥狀主要表現(xiàn)為持續(xù)的情緒低落、動力低下和快感缺乏，或伴有睡眠障礙、軀體癥狀及認(rèn)知功能損害等臨床特征的一類心境障礙疾病。

在臨床工作中，抑郁癥和偏頭痛可能是共患病。抑郁癥患者伴有偏頭痛比例是非抑郁癥患者的2.5～3倍，并且以有先兆的偏頭痛最為多見；在頭痛患者中，抑郁癥的比例是非頭痛組的2.2～4倍，其中有先兆的偏頭痛組的抑郁癥患者比例最高，部分抗抑郁藥物可以很好的預(yù)防和治療先兆偏頭痛的發(fā)作[2]。這些提示抑郁癥和偏頭痛可能存在相同的病因和發(fā)病機(jī)制。皮層擴(kuò)散性抑制(Cortical spreading depression，CSD)很可能是偏頭痛的一個發(fā)病機(jī)制，尤其是偏頭痛先兆發(fā)生發(fā)展中的一個重要機(jī)制。星型膠質(zhì)細(xì)胞可通過其終足上的AQP調(diào)節(jié)CSD。抑郁癥患者大腦皮層供血下降，并伴隨前額葉皮質(zhì)、海馬和杏仁核星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目下降，這些病理改變可能與CSD相關(guān)[3]。我們猜想，CSD誘發(fā)的血流動力學(xué)改變參與了抑郁發(fā)病。

在本研究中，我們構(gòu)建社會隔離(Social isolation，SI)抑郁癥小鼠模型，模擬獨(dú)居的現(xiàn)象，檢測小鼠動物認(rèn)知功能及抑郁狀態(tài)，通過激光散斑襯比成像方法監(jiān)測SI小鼠腦皮層血流動力學(xué)在CSD誘導(dǎo)下的改變及對其機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物建模

32只3周齡斷乳的雄性C57BL/6小鼠，體重為10～11 g；所有實(shí)驗(yàn)動物均購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心，獲得了華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的批準(zhǔn)。按照隨機(jī)化的原則分組，16只C57BL/6小鼠單獨(dú)飼養(yǎng)6周，16只同齡對照組4只為1籠群居飼養(yǎng)6周。動物飼養(yǎng)條件：溫度控制在22±3 ℃，濕度在50～60%的清潔級動物房中，保持12 h晝夜交替周期。

1.2 糖水偏好實(shí)驗(yàn)

給造模后的小鼠給予兩個相同水瓶，分別含1%蔗糖和飲用水，使小鼠適應(yīng)雙瓶飼養(yǎng)3 d。在此過程中，兩個瓶子位置每天隨機(jī)互換，防止實(shí)驗(yàn)鼠對飲水位置偏好。在進(jìn)行糖水偏好實(shí)驗(yàn)前，禁水15 h。實(shí)驗(yàn)時，記錄小鼠在4 h內(nèi)飲用1%蔗糖水和飲用水的飲水量。通過計算小鼠對蔗糖偏愛程度%=糖水消耗量/(糖水消耗量+飲用水消耗量)×100%，分析小鼠是否出現(xiàn)快感缺失。

1.3 曠場實(shí)驗(yàn)

將小鼠放置在50 cm×50 cm×50 cm的場地中自由運(yùn)動，用攝像頭在曠場正上方攝像記錄小鼠在5 min內(nèi)的活動，并分析小鼠5 min運(yùn)動的距離。

1.4 懸尾實(shí)驗(yàn)

將小鼠尾部用膠布固定在離地近10 cm的橫桿并懸掛5分鐘。觀察并記錄小鼠第一次停止掙扎的潛伏期及及保持不動狀態(tài)的時間。

1.5 激光散斑襯比成像監(jiān)測小鼠皮層擴(kuò)散性抑制的血流動力學(xué)改變

小鼠稱重，10%水合氯醛0.005 mL·g-1腹腔注射麻醉；取小鼠俯臥位，小鼠體溫通過負(fù)反饋加熱墊將體溫控制在37±0.5 ℃；常規(guī)備皮，消毒，充分暴露前囟及右側(cè)頂骨；使用牙科鉆(0.5 mm)開顱窗將右側(cè)頂骨去除，保留完整硬腦膜；在顱窗前約5 mm處鉆一小孔用于針刺。將小鼠放置在激光散斑襯比成像系統(tǒng)下，使用650 nm紅色激光照射觀察區(qū)域，將Value值在800～1 000之間，曝光時間40 ms，幀間隔時間1 000 ms，保存時間為10 min；在記錄1 min時，在右側(cè)刺激窗給予垂直的、相同深度的(5 mm)針刺刺激，觀察腦血流變化。

1.6 免疫熒光染色

小鼠用上述方法麻醉后，經(jīng)心臟灌流后取出腦組織。腦組織用4%多聚甲醛固定24 h。采用震蕩切片將腦組織冠狀切片(30 μm)。腦片用PBS漂洗5 min 3次。清洗后采用1%triton-PBS破膜液室溫孵育15 min；隨后用1%胎牛血清蛋白-PBS封閉液封閉2 h。去除封閉液，加入一抗4 ℃冰箱孵育過夜(或>16 h)。本實(shí)驗(yàn)所需一抗分別為mouse anti-GFAP (1∶200;Millipore,USA)，rabbit anti-Iba1 (1∶200;ab178846;Abcam,USA)。PBS清洗一抗5 min3次后，加二抗室溫避光孵育1 h；本實(shí)驗(yàn)所需二抗為donkey anti-mouse IgG (Alexa488;1∶500;Abcam,USA)，donkey anti-rabbit IgG (Alexa594;1∶500;Abcam,USA)。二抗清洗后滴加DAPI，室溫避光孵育5 min；清洗后50%-PBS甘油封片，于激光共聚焦下成像。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 社會隔離誘導(dǎo)小鼠抑郁樣行為

在社會隔離誘導(dǎo)的慢性抑郁癥模型行為學(xué)檢測中我們發(fā)現(xiàn)：糖水偏好試驗(yàn)結(jié)果顯示，社會隔離誘導(dǎo)的抑郁癥模型組小鼠蔗糖消耗量百分比明顯少于正常組小鼠蔗糖消耗量百分比(圖1A)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。曠場試驗(yàn)結(jié)果顯示，社會隔離誘導(dǎo)的抑郁癥模型組小鼠與正常組小鼠相比較，運(yùn)動距離明顯距離長(圖1B)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

懸尾試驗(yàn)結(jié)果顯示，社會隔離誘導(dǎo)的抑郁癥模型組小鼠不動時間較正常組小鼠明顯增多(圖1C)，且出現(xiàn)靜止的潛伏期較正常組小鼠明顯縮短(圖1D)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

N=8每組，**P<0.01,***P<0.001 versus control。

2.2 激光散斑襯比成像監(jiān)測社會隔離抑郁癥小鼠皮層擴(kuò)散性抑制的血流動力學(xué)改變

激光散斑襯比成像監(jiān)測社會隔離抑郁小鼠皮層擴(kuò)散性抑制的血流動力學(xué)(圖2)中發(fā)現(xiàn)，社會隔離誘導(dǎo)的抑郁癥模型組小鼠腦血流變化率明顯小于正常小鼠(P<0.001)(圖3A)。與正常小鼠比較，充血持續(xù)時間延長(圖3B)，腦血流達(dá)峰時間延遲(圖3C)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。SI誘導(dǎo)的抑郁癥小鼠在軟腦膜血管的收縮或舒張的變化率比正常小鼠下降(圖3D)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

Baseline：基線圖像；2、3、4、5min：誘導(dǎo)皮層擴(kuò)散性抑郁(CSD)后2、3、4、5 min圖像。

N=8每組，**P<0.01,***P<0.001 versus control。

2.3 社會隔離誘導(dǎo)的抑郁癥小鼠中，星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯減少

社會隔離誘導(dǎo)的慢性抑郁癥小鼠腦片應(yīng)用免疫熒光方法對星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行染色，計數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)：在社會隔離誘導(dǎo)的慢性抑郁癥小鼠中，星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)數(shù)量較正常對照組明顯減少(P<0.001)(圖4A、4B)；而小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba-1)數(shù)量明顯增多(P<0.05)(圖4A、4C)。

N=8每組，*P<0.05 **P<0.01 versus control。標(biāo)尺上：500 um，標(biāo)尺下：100 um。

3 討論

本研究通過將小鼠單獨(dú)飼養(yǎng)成功構(gòu)建動物抑郁模型。通過機(jī)械損傷抑郁小鼠大腦皮層誘導(dǎo)CSD，并通過激光散斑襯比成像觀察CSD誘導(dǎo)血流下降在抑郁癥小鼠模型中的恢復(fù)能力。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在CSD誘導(dǎo)后，抑郁小鼠大腦皮層血流下降持續(xù)時間增加且不能恢復(fù)至正常，抑郁小鼠前額葉皮質(zhì)星型膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目下降，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活。

3.1 SI誘發(fā)抑郁行為

SI誘發(fā)嚙齒類動物空間認(rèn)知功能障礙、焦慮情緒和抑郁情緒，是理想的研究認(rèn)知和精神變化的動物模型。早期的社會隔離引發(fā)各種神經(jīng)元系統(tǒng)的功能變化，例如單胺能系統(tǒng)，促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子系統(tǒng)和GABA能系統(tǒng)，以及各種與壓力有關(guān)的行為反應(yīng)，包括攻擊性增強(qiáng)、運(yùn)動過度、對戊巴比妥和地西泮等GABA藥物的敏感性降低等。此外，SI不僅會損害海馬中的神經(jīng)發(fā)生，而且還會誘導(dǎo)嚙齒類動物少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟和髓鞘形成，以及改變樹突棘密度。我們將小鼠從斷奶后(3周齡)開始進(jìn)行SI 6周，小鼠在成年后表現(xiàn)出焦慮、絕望情緒，與已有的報道一致[4]。

3.2 激光散斑檢測抑郁癥小鼠腦血流動力學(xué)變化

血管順應(yīng)性以及血流動力學(xué)改變參與了抑郁癥的發(fā)病。根據(jù)腦血管損傷的部位，抑郁癥狀的表現(xiàn)可能不同。近些年基于腦血流動力學(xué)改變的腦功能成像技術(shù)層出不窮，包括功能磁共振成像、正電子發(fā)射層析成像、激光掃描共聚焦顯微成像、雙光子激光掃描熒光顯微成像、內(nèi)源信號光學(xué)成像、激光散斑襯比成像、熒光成像等技術(shù)。各光學(xué)成像技術(shù)都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。其中，功能磁共振成像和正電子發(fā)射層析成像的優(yōu)勢在于無創(chuàng)，但是不能實(shí)時動態(tài)多參數(shù)進(jìn)行監(jiān)測；激光掃描共聚焦顯微成像和雙光子激光掃描熒光顯微成像分辨率在亞細(xì)胞水平，但是是視場相對較??；激光散斑襯比成像(laser speckle contrast imaging,LSCI)技術(shù)是利用血管中紅細(xì)胞運(yùn)動產(chǎn)生的后向散射光形成動態(tài)散斑對比度值來獲取血流速度信息，通過非接觸成像能夠獲得全視場的二維高分辨率的血流分布的圖像，具有較高的時間和空間分辨率，實(shí)時動態(tài)進(jìn)行多參數(shù)監(jiān)測。激光散斑襯比成像技術(shù)不需要注入外源性物質(zhì)，就可以實(shí)現(xiàn)長時間、大視場(36 mm×26 mm)、連續(xù)性血流及血管直徑變化的監(jiān)測。目前此技術(shù)已應(yīng)用于科研和臨床中，可使科研及醫(yī)務(wù)人員實(shí)時動態(tài)觀察到體內(nèi)微血管的血流分布及變化情況。但是LSCI也存在缺點(diǎn)，1)該項(xiàng)技術(shù)為有創(chuàng)性操作，為達(dá)到一定清晰度需要打開小鼠頭皮及磨薄顱骨；2)監(jiān)測參數(shù)較少，僅能監(jiān)測CBF及血管直徑等指標(biāo)，不能監(jiān)測細(xì)胞代謝指標(biāo)等參數(shù)；3)監(jiān)測深度僅在小鼠大腦皮層，不能同時監(jiān)測深部白質(zhì)的CBF及細(xì)胞代謝變化情況。本研究采用激光散斑襯比成像檢測小鼠大腦皮質(zhì)在CSD過程中前額葉皮質(zhì)血流在損傷后數(shù)分鐘內(nèi)的改變。

CSD是神經(jīng)元去極化波在大腦皮質(zhì)傳播的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象是細(xì)胞內(nèi)外離子發(fā)生劇烈交換的過程，并伴有皮層血流和供氧的短暫變化[5]。在CSD發(fā)生時，為了維持離子水平和神經(jīng)功能，大腦對能量的需求顯著增加，為了維持代謝平衡，皮層神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞將釋放各類神經(jīng)遞質(zhì)，如5-HT、NO、CO、腺苷、K+等，調(diào)節(jié)血流變化[6]。離體或在體的動物組織或模型中，CSD的誘發(fā)方式有很多，包括局部使用氯化鉀、機(jī)械刺激、損傷、代謝抑制劑和DC電刺激等。CSD觸發(fā)細(xì)胞外鉀離子濃度突然升高，從靜息狀態(tài)的3 mmol升高至30～50 mmol，有時甚至高達(dá)80 mmol，導(dǎo)致局部神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的去極化，細(xì)胞膜通過非選擇性離子通道的開放，引起細(xì)胞膜通透性增加。隨著鉀離子的外流，細(xì)胞外的鈉離子、氯離子和鈣離子的內(nèi)流進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞水腫，此時細(xì)胞外空間縮小50%以上，進(jìn)而又增加了細(xì)胞外離子的濃度[7]。為了維持電位平衡，大量的負(fù)離子被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，包括：谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、GABA、腺苷和兒茶酚胺等神經(jīng)遞質(zhì)。細(xì)胞外大量的K+又誘發(fā)鄰近細(xì)胞的去極化，導(dǎo)致CSD波向周圍傳播，而細(xì)胞外谷氨酸濃度增高及NMDA受體的激活進(jìn)一步促進(jìn)CSD的傳播。復(fù)極化過程中，由于細(xì)胞內(nèi)外大量的離子、水和神經(jīng)遞質(zhì)的自我調(diào)節(jié)能力是有限的，需要Na-K-ATP酶、星形膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的緩沖及重吸收和血管間隙的緩沖作用等機(jī)制的參與在短時間恢復(fù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。此過程是能量依賴型，需要大量O2和葡萄糖的消耗，引起血管、腦血流及線粒體代謝變化。因此，在嚴(yán)重能量受損的組織，恢復(fù)平衡的時間延遲，可能加重受損程度。

目前，CSD的研究主要集中在偏頭痛發(fā)病機(jī)制，而幾乎沒有CSD與抑郁癥發(fā)病機(jī)制的相關(guān)報道。我們的研究發(fā)現(xiàn)通過機(jī)械損傷抑郁小鼠大腦皮層引起的CSD，其誘發(fā)的皮層血流下降持續(xù)時間增加且不能恢復(fù)至正常，提示CSD參與抑郁的發(fā)病過程。

3.3 SI抑郁模型誘發(fā)膠質(zhì)細(xì)胞改變

星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目下降和抑郁嚴(yán)重程度成正相關(guān)。抑郁患者前額葉皮質(zhì)、海馬和杏仁核中的星型膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)顯著下降。星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP及S100β mRNA在抑郁模型大鼠皮層表達(dá)下降。慢性應(yīng)激狀態(tài)破壞星型膠質(zhì)細(xì)胞終足的長度、分支和體積，從而導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞萎縮[8-9]。這些研究表明，抑郁癥狀與星型膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目相關(guān)。相反，星型膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目減少加重抑郁癥狀。例如，毒性誘導(dǎo)的大鼠前額葉皮質(zhì)星型膠質(zhì)細(xì)胞丟失可以引起抑郁癥狀[10]。在小鼠抑郁動物模型中，運(yùn)用抗抑郁藥物能上調(diào)星型膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白[11]。并且，抑郁患者血漿中S100β水平上升，而在使用抗抑郁藥物后S100β含量下降，是目前抑郁癥診斷的標(biāo)志物之一[12]。與前人研究一致，在我們CUMS動物模型中，同樣發(fā)現(xiàn)GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目減少。星形膠質(zhì)細(xì)胞減少及其功能改變可能是本研究中SI動物模型抑郁癥的發(fā)病機(jī)制之一。另外，星型膠質(zhì)細(xì)胞可通過其終足上的AQP調(diào)節(jié)CSD。水腫的星型膠質(zhì)細(xì)胞終足導(dǎo)致血管周圍間隙空間變小，影響CSD在皮質(zhì)的傳播[13]。

星型膠質(zhì)細(xì)胞對維持大腦內(nèi)環(huán)境發(fā)揮重要作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞通過攝取突觸間隙的谷氨酸，調(diào)節(jié)突觸的興奮性。如前所述星型膠質(zhì)細(xì)胞在抑郁癥患者大腦皮層的完整性缺失，將導(dǎo)致谷氨酸再攝取障礙，引起谷氨酸毒性，加重神經(jīng)元損傷。星型膠質(zhì)細(xì)胞終足包繞著血管并通過轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子促進(jìn)血管收縮，參與腦血流和神經(jīng)元活性的調(diào)節(jié)[14]。大量研究表明抑郁癥患者大腦血流下降，而且老年患者血流下降更為嚴(yán)重[15]，意味著抑郁癥患者大腦血管調(diào)節(jié)功能受損。本研究亦發(fā)現(xiàn)：CSD誘導(dǎo)SI抑郁小鼠皮層血流調(diào)節(jié)能力受損，其原因之一可能是星型膠質(zhì)細(xì)胞對血管的調(diào)控能力下降。

另一方面，小膠質(zhì)細(xì)胞激活與外周及中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞因子生成增多密切相關(guān)，因此也進(jìn)一步改變突觸可塑性、神經(jīng)再生和抑郁相關(guān)行為[16]。抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，能夠抑制IL-1β生成。Grinberg等人研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞活化更容易誘發(fā)CSD，可能與小膠質(zhì)細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子α增加神經(jīng)元的興奮性有關(guān)[17]，小膠質(zhì)細(xì)胞可作為治療抑郁癥新的靶點(diǎn)。因而，細(xì)胞因子和小膠質(zhì)細(xì)胞也參與了抑郁癥的發(fā)病。我們的研究顯示SI抑郁小鼠皮層小膠質(zhì)細(xì)胞激活，可能參與SI誘導(dǎo)的抑郁發(fā)病。