游離脂肪酸通過(guò)FFAR4抑制脂肪細(xì)胞KLF15的表達(dá)和葡萄糖消耗

仇同同，鄧玉春，王翠喆，唐慧,2，楊欣，張君

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院/新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000；2 石河子大學(xué)科研處，新疆 石河子 832000)

KLF15是Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，廣泛表達(dá)于肌肉組織、脂肪組織和肝臟等高代謝組織器官中[2]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，KLF15在脂肪組織糖代謝調(diào)控中發(fā)揮著重要的功能。在小鼠脂肪細(xì)胞中過(guò)表達(dá)KLF15轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞中SCD1蛋白表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌，且過(guò)表達(dá)KLF15可顯著增強(qiáng)脂肪細(xì)胞的胰島素敏感性[3-4]；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4(Glucose transporter-4，GLUT-4)和脂肪源性胰島素增敏因子(Adipose-derived insulin-sensitizing factor，Adipolin)被發(fā)現(xiàn)是胰島素抵抗的調(diào)節(jié)因子，已有文獻(xiàn)表明KLF15可與二者的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合而調(diào)控其表達(dá)，進(jìn)而改善胰島素敏感性[5-6]。而在我們之前的研究中發(fā)現(xiàn)，在肥胖個(gè)體網(wǎng)膜脂肪組織中KLF15的表達(dá)水平顯著降低，KLF15的低表達(dá)可能與血脂水平升高相關(guān)，但其具體的分子機(jī)制尚不清楚。

肥胖是胰島素抵抗的重要誘因之一，參與2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展[7]。已有文獻(xiàn)表明肥胖個(gè)體中血漿游離脂肪酸(Free Fatty Acid，F(xiàn)FA)水平增加與胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻和細(xì)胞葡萄糖代謝紊亂密切相關(guān)。然而盡管血漿FFA水平升高是導(dǎo)致肥胖誘發(fā)胰島素抵抗的重要危險(xiǎn)因素，但其中具體分子機(jī)制尚不明確[8-9]。已有文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞膜上一種具有7次跨膜結(jié)構(gòu)的特異性游離脂肪酸受體(Free Fatty Acid Receptor，F(xiàn)FAR)，也稱為G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled Receptors，GPRs)。其中FFAR1/GPR40和FFAR4/GPR120是長(zhǎng)鏈FFA的受體，在維持機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞分化、脂肪形成和能量代謝平衡等生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[10-11]。P?r Steneberg等人發(fā)現(xiàn)高脂飲食可以通過(guò)上調(diào) FFAR1的表達(dá)致使胰島β細(xì)胞胰島素分泌受損，進(jìn)而誘發(fā)胰島素抵抗和葡萄糖耐量受損。而對(duì)于敲除FFAR1的小鼠，高脂飲食并未出現(xiàn)上述現(xiàn)象[12]。Atsuhiko Ichimura的研究發(fā)現(xiàn)敲除FFAR4加重了高脂飲食小鼠的肥胖、胰島素抵抗和脂肪組織炎癥。但肥胖個(gè)體FFAR4表達(dá)明顯高于正常組，其發(fā)生的原因尚不清楚[13]。而FFAR4和FFAR1是否參與高水平FFA抑制KLF15的表達(dá)和脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)探討FFA對(duì)KLF15表達(dá)和脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗的影響及可能機(jī)制，揭示了FFA在糖代謝調(diào)節(jié)中一條新的分子機(jī)制，為臨床尋找治療肥胖、胰島素抵抗、炎癥及相關(guān)代謝疾病新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 3T3-L1脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

3T3-L1前脂肪細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。細(xì)胞放置在5% CO2和37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。使用細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括89.5% DMEM，10% 胎牛血清，1% 青/鏈霉素培養(yǎng)細(xì)胞至100%后，替換細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基為包含0.5 μm IBMX，1 μm地塞米松和1 μg·mL-1胰島素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。誘導(dǎo)48～96小時(shí)后，去除IBMX和地塞米松，更換為包含有1 μg·mL-1胰島素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行第二輪誘導(dǎo)，隨后每2天更換不含雙抗的完全培養(yǎng)基，直到第9天。誘導(dǎo)結(jié)束后，鏡下可見(jiàn)大量脂滴形成，說(shuō)明脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)成功。

1.2 FFA混合液的配制

將棕櫚酸(PA)(Sigma，美國(guó))和油酸(OA)(Sigma，美國(guó))加入0.1 mol·L-1NaOH溶液進(jìn)行皂化，隨后與30%無(wú)脂肪酸的BSA(Solarbio，美國(guó))等量混合配制為40 mmol·L-1的母液?；旌弦菏褂米貦八?PA)和油酸(OA)以1∶2比例混合，-20 ℃保存。工作液直接使用培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。

1.3 阻斷劑的使用

FFAR4和FFAR1信號(hào)通路的阻斷使用AH7614(150 μmol·L-1，Tocris，英國(guó))和GW1100(15 μmol·L-1，MCE，美國(guó))。

1.4 葡萄糖濃度的檢測(cè)

脂肪細(xì)胞上清液使用葡萄糖檢測(cè)試劑盒(南京建成，中國(guó))進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)值計(jì)算如下：

1.5 RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR

細(xì)胞經(jīng)處理后采用Trizol法提取總RNA，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher)反轉(zhuǎn)錄以及使用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行定量分析(QIAGEN)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以EXCEL形式呈現(xiàn)。表達(dá)量以內(nèi)參作為對(duì)照，進(jìn)行量化，擴(kuò)增引物如下。ACTIN，正:CAGGAGGAGCAATGATCTTGA，反：ACTACCTCATGAAGATCCTCA；KLF15，正GCGAGAAGCCCT TTGCCT，反：GCTTCACACCCGAGTGAGAT； Adipolin，正:TACCACGTCCAACCGTGAG，反：GTCATGTGGGC ATCTGAGAG；GLUT4，正:TTGGAGAGAGAGCGTCCAAT，反：CTCAAAGAAGGCCACAAAGC[1]。

1.6 蛋白提取和免疫印跡試驗(yàn)

使用含1%PMSF RIPA裂解液裂解細(xì)胞。提取的總蛋白采用凝膠電泳 (SDS-PAGE)。轉(zhuǎn)膜采用NC膜，轉(zhuǎn)膜成功后的印記膜封閉在 5% BSA溶液中。封閉結(jié)束后孵育一抗，兔抗山羊KLF15 (Abcam，ab2647.1，1∶1 000稀釋)、山羊抗兔FFAR4 (Abcam，ab230869，1∶1 000稀釋)、山羊抗兔FFAR1 (Thermofisher，PA5-75351，1∶1 000稀釋)，山羊抗兔p38 MAPK (Cell Signaling，4511S，1∶1 000稀釋)、山羊抗小鼠GAPDH(ZSGB-BIO，TA-08，1∶1000稀釋)和山羊抗小鼠β-Tubulin (ZSGB-BIO，TA-10，1∶1 000稀釋)過(guò)夜。室溫孵育二抗抗兔lgG，抗山羊lgG或者抗鼠lgG(ZSGB-BIO)。采用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行可視化檢測(cè) (FluorChem HD2，USA)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本文中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果，數(shù)據(jù)采用SPSS21.0軟件進(jìn)行分析。兩組間數(shù)據(jù)比較采用雙側(cè)T檢驗(yàn)(符合正態(tài)分布)和非參數(shù)秩和檢驗(yàn)(不符合正態(tài)分布)。3組數(shù)據(jù)使用one-way anova。P<0.05即認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

使用3T3-L1前脂肪細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)后分化為成熟脂肪細(xì)胞。未誘導(dǎo)分化的3T3-L1細(xì)胞呈梭型(圖1A)。經(jīng)油紅O染色后，可見(jiàn)鏡下存在多個(gè)大小不一，聚集于細(xì)胞內(nèi)，并圍繞成環(huán)狀的脂滴，表明脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)完成(圖1B)。

2.2 不同濃度FFA混合液刺激脂肪細(xì)胞，觀察對(duì)FFAR4、FFAR1、磷酸化p38 MAPK、KLF15及葡萄糖消耗的影響

使用多個(gè)濃度(0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1)FFA混合液刺激脂肪細(xì)胞48 h，觀察對(duì)脂肪細(xì)胞KLF15、Adipolin、GLUT4、FFAR4、FFAR1、磷酸化的p38 MAPK以及葡萄糖消耗的影響。

結(jié)果顯示：0.8 mmol·L-1FFA混合液刺激組KLF15、FFAR1以及KLF15的下游靶基因Adipolin和GLUT4的表達(dá)水平低于0 mmol·L-1刺激組，F(xiàn)FAR4的表達(dá)水平高于0 mmol·L-1刺激組，而p38 MAPK磷酸化水平無(wú)顯著變化，見(jiàn)圖2A-B；0.8 mmol·L-1FFA混合液顯著抑制脂肪細(xì)胞消耗葡萄糖(P<0.01)(圖2C)。

2.3 FFA混合液刺激脂肪細(xì)胞同時(shí)阻斷FFAR4，觀察對(duì)磷酸化p38 MAPK、KLF15及葡萄糖消耗的影響

0.8 mmol·L-1FFA混合液刺激脂肪細(xì)胞后，KLF15及下游靶基因Adipolin和GLUT4的表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組(P<0.01)，上清液葡萄糖濃度顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，p38 MAPK磷酸化水平無(wú)顯著變化；0.8 mmol·L-1FFA混合液刺激脂肪細(xì)胞的同時(shí)加入AH7614阻斷FFAR4，KLF15及下游靶基因Adipolin和GLUT4表達(dá)水平顯著高于0.8 mmol·L-1FFA混合液?jiǎn)为?dú)刺激組(P<0.01)，上清液葡萄糖濃度顯著低于0.8 mmol·L-1FFA混合液?jiǎn)为?dú)刺激組(P<0.05)，p38 MAPK磷酸化水平無(wú)顯著變化(圖3A-C)。

圖3 不同濃度的FFA混合液刺激脂肪細(xì)胞，檢測(cè)KLF15、FFAR4、FFAR1、Adipolin和GLUT4的表達(dá)水平、p38 MAPK磷酸化水平以及上清液葡萄糖濃度

2.4 FFA混合液刺激脂肪細(xì)胞同時(shí)阻斷FFAR1，觀察對(duì)磷酸化p38 MAPK、KLF15及葡萄糖消耗的影響

0.8 mmol·L-1FFA混合液刺激脂肪細(xì)胞后，KLF15及下游靶基因Adipolin和GLUT4的表達(dá)水平低于空白對(duì)照組，上清液葡萄糖濃度顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，而p38 MAPK磷酸化水平無(wú)顯著變化；0.8 mmol·L-1FFA混合液刺激脂肪細(xì)胞的同時(shí)加入GW1100阻斷FFAR1后，KLF15和GLUT4的表達(dá)水平低于0.8 mmol·L-1FFA混合液?jiǎn)为?dú)刺激組，而Adipolin的表達(dá)，p38 MAPK磷酸化水平以及上清液葡萄糖濃度無(wú)顯著變化(圖4A-C)。

圖4 0.8 mM FFA混合液刺激脂肪細(xì)胞后加入GW1100，檢測(cè)KLF15、Adipolin和GLUT4的表達(dá)水平和上清液葡萄糖濃度

3 討論

作為KLF轉(zhuǎn)錄因子家族成員，Krüppel樣因子15(Krüppel-like factor，KLF15)在脂肪組織、肝臟、心臟和骨骼肌中均有表達(dá)，其中以脂肪組織中KLF15的含量最為豐富。多篇文獻(xiàn)表明，KLF15在糖、脂以及其它的物質(zhì)能量代謝中作用十分顯著，存在有雙向調(diào)控的機(jī)制[14-16]。而我們之前的研究中發(fā)現(xiàn)，肥胖個(gè)體網(wǎng)膜脂肪組織中KLF15顯著降低[17]，其具體的分子機(jī)制尚不十分明確。

胰島素抵抗在臨床上非常重要，因?yàn)樗c2型糖尿病、高血壓、血脂異常、凝血和纖溶異常等多種疾病密切相關(guān)。已有文獻(xiàn)表明血漿游離脂肪酸(Free Fatty Acid，F(xiàn)FA)水平升高被發(fā)現(xiàn)是肥胖伴T(mén)2DM胰島素抵抗發(fā)生的危險(xiǎn)因素。FFA引起胰島素抵抗的機(jī)制包括脂質(zhì)代謝物和促炎因子的產(chǎn)生、細(xì)胞應(yīng)激，如氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等，但對(duì)于其具體的分子機(jī)制的了解仍然有限。總之，血漿FFA水平的升高是肥胖相關(guān)胰島素抵抗和心血管疾病的重要原因，但由于缺乏容易獲得的測(cè)量FFA的方法和缺乏降低血漿FFA水平的藥物，使給予對(duì)應(yīng)的治療和應(yīng)用受到了阻礙[18]。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸(Palmitic Acids，PA)和油酸(Oleic Acid，OA)在人體血清樣本游離脂肪酸中濃度最高，并且在肥胖受試個(gè)體的血清中具有升高的現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)選用PA和OA以1∶2的比例混合處理脂肪細(xì)胞，這一配比來(lái)源于文獻(xiàn)報(bào)道的用于模擬人體肥胖狀態(tài)和脂肪肝模型的建立[19]。在我們使用FFA混合液刺激脂肪細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示脂肪細(xì)胞KLF15及其靶基因Adipolin和GLUT4顯著降低，葡萄糖消耗能力顯著被抑制。提示FFA混合液可抑制脂肪細(xì)胞KLF15表達(dá)和葡萄糖消耗，其具體的分子機(jī)制尚不明了。

早期的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FA可以通過(guò)脂肪酸結(jié)合蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，通過(guò)調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子而調(diào)控下游基因，另一方面FFA通過(guò)使細(xì)胞內(nèi)某些蛋白發(fā)生脂?；M(jìn)而影響細(xì)胞功能。而近期的文獻(xiàn)表明，細(xì)胞膜上存在有多個(gè)特定的FFA受體(FFAR)，F(xiàn)FA可以作為配體，在與其結(jié)合后通過(guò)影響相關(guān)的信號(hào)分子，如絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)，第二信使CAMP等，進(jìn)而在維持細(xì)胞分化、脂肪形成和能量代謝中發(fā)揮重要作用[20-21]。已有文獻(xiàn)證實(shí)，G蛋白偶聯(lián)受體40/FFAR1和G蛋白偶聯(lián)受體120/FFAR4是特異性的長(zhǎng)鏈FFA受體，均表達(dá)于脂肪細(xì)胞，其中FFAR4在脂肪細(xì)胞中表達(dá)更高。FFAR1可被飽和的長(zhǎng)鏈12C-16C脂肪酸和長(zhǎng)鏈不飽和的18C-20C脂肪酸激活，F(xiàn)FAR4可被飽和的長(zhǎng)鏈14C-18C脂肪酸和不飽和的長(zhǎng)鏈16C-22C脂肪酸激活[22]。FFAR1和FFAR4增強(qiáng)胰島素分泌作用的發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是2型糖尿病的新型治療靶點(diǎn)，但對(duì)于其中具體分子機(jī)制的了解依然不夠完整。

在不同脂肪酸和不同作用時(shí)間下，F(xiàn)FAR1和FFAR4發(fā)揮著不同的作用。RODRIGUEZ P F的研究結(jié)果表明，在肥胖受試個(gè)體的脂肪細(xì)胞中PA和OA誘導(dǎo)了炎癥因子TNF-α和IL-6的高表達(dá)，而在抑制FFAR4的表達(dá)后，二者的促炎作用均顯著消失[23]。STENEBERG P等[12]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)短時(shí)間FFA通過(guò)FFAR1促進(jìn)了胰島素的釋放，而在給與持續(xù)的刺激后則出現(xiàn)胰島細(xì)胞功能受損的現(xiàn)象。同時(shí)在上調(diào)FFAR1的小鼠中，高脂飲食加重了肥胖、血糖血脂異常升高、脂肪組織炎癥的發(fā)生。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FFA混合液刺激脂肪細(xì)胞后，游離脂肪酸受體FFAR1的蛋白表達(dá)降低，而FFAR4的表達(dá)和p38 MAPK磷酸化水平增高。為了進(jìn)一步明確FFAR4、FFAR1及p38 MAPK磷酸化在FFA抑制KLF15表達(dá)中的調(diào)控關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)在FFA刺激脂肪細(xì)胞的同時(shí)使用拮抗劑阻斷FFAR4和FFAR1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明阻斷FFAR4后，F(xiàn)FA對(duì)于上清液葡萄糖消耗和脂肪細(xì)胞KLF15表達(dá)的抑制作用均減弱；阻斷FFAR1后，KLF15的表達(dá)進(jìn)一步被抑制，脂肪細(xì)胞對(duì)于葡萄糖的消耗無(wú)顯著的變化。結(jié)果表明，高水平的FFA通過(guò)激活FFAR4通路抑制脂肪細(xì)胞KLF15的表達(dá)和葡萄糖消耗。而FFAR1參與FFA抑制脂肪細(xì)胞KLF15的表達(dá)和葡萄糖消耗的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

MAPK是存在于細(xì)胞內(nèi)部分子信號(hào)傳遞的關(guān)鍵通路，在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中具有十分重要的作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道MAPK是GPRs受體的下游關(guān)鍵信號(hào)通路[24-25]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)趩为?dú)使用FFA以及FFA處理脂肪細(xì)胞的同時(shí)阻斷FFAR4和FFAR1后，發(fā)現(xiàn)p38 MAPK的磷酸化水平均未發(fā)生顯著變化，實(shí)驗(yàn)表明磷酸化p38 MAPK可能并未參與FFA通過(guò)FFARs抑制脂肪細(xì)胞KLF15的表達(dá)和葡萄糖代謝。已有研究發(fā)現(xiàn)，MAPK家族中的p38 MAPK、ERK、JNK信號(hào)通路均受FFAR4的調(diào)控[26-27]。而在脂肪細(xì)胞中，F(xiàn)FA是否可以通過(guò)ERK或JNK信號(hào)通路影響KLF15表達(dá)和葡萄糖的消耗，有待進(jìn)一步研究。

基于此，我們通過(guò)體外構(gòu)建3T3-L1脂肪細(xì)胞細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)高水平的FFA混合液可通過(guò)激活FFAR4抑制脂肪細(xì)胞KLF15的表達(dá)和葡萄糖消耗。該發(fā)現(xiàn)將為明確肥胖導(dǎo)致脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗異常提供新的分子理論依據(jù)，并為相關(guān)疾病的臨床治療提供可能的靶點(diǎn)。