長(zhǎng)白山二道白河區(qū)森林康養(yǎng)對(duì)人體免疫功能的影響

劉艷波 王煥琦 王洪俊 安麗萍 范春楠 包學(xué)英 賈曉靜 李潔 黃琴扉 張瑋尹 杜培革

摘要：為了探討森林康養(yǎng)對(duì)人體免疫功能的影響，篩選12名健康志愿者于2019年7月上旬在吉林省長(zhǎng)白山二道白河區(qū)森林康養(yǎng)基地進(jìn)行為期“3天2夜”的康養(yǎng)活動(dòng)?？叼B(yǎng)前后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD56+ NK細(xì)胞和CD3+淋巴細(xì)胞的百分比，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法測(cè)定血漿中顆粒酶、顆粒溶素和穿孔素的濃度。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)白山二道白河區(qū)夏季“3天2夜”的森林康養(yǎng)活動(dòng)顯著提高了外周血CD3+淋巴細(xì)胞和CD56+NK細(xì)胞的百分比（P<0.05），同時(shí)血漿中穿孔素、顆粒酶和顆粒溶素的水平增加（P<0.05）。由此可見，森林康養(yǎng)活動(dòng)在一定程度上可提高人體免疫功能。

關(guān)鍵詞：森林康養(yǎng)，NK細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，免疫活性，長(zhǎng)白山

DOI： 10.12169/zgcsly.2020.12.04.0004

Abstract：?To explore the effect of forest therapy in the summer on human immune function in Baihe District of Changbai Mountain， Jilin Province， the study screens and selects 12 healthy volunteers to have a three-day and two-night forest therapy there. The percentages of CD56+ NK cells and CD3+ lymphocytes in their peripheral blood are monitored using flow cytometry， and the concentrations of Grs， GNLY and perforin in plasma are tested using Elisa assay before and after forest therapy. The results show that compared with the pretest conditions， the forest therapy produces a significant increase in percentage of CD3+ lymphocytes and CD56+ NK cells （P<0.05）， and also an obvious increase in the perforin，GrA， GrB and GNLY levels in plasma. The results suggest that forest therapy activities can significantly increase human immune function to a certain extent.

Keywords： forest therapy， NK cell， lymphocyte， immunological activity， Changbai Mountain

森林康養(yǎng)是目前公認(rèn)的緩解壓力的有效途徑之一[1]，相關(guān)學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)：森林康養(yǎng)過程中自然殺傷細(xì)胞（Natural Killer Cell，NK）的數(shù)量和活性均增加[2-3];此外，森林康養(yǎng)還可緩解焦慮、憤怒等不良情緒。森林康養(yǎng)在日本和德國(guó)非常受歡迎，甚至作為藥物的一部分進(jìn)入國(guó)家醫(yī)療保險(xiǎn)領(lǐng)域。有研究證實(shí)森林康養(yǎng)具有提高機(jī)體免疫功能的效應(yīng)，主要由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（Cytotoxic T Lymphocyte，CTL）和NK細(xì)胞完成，因?yàn)檫@些細(xì)胞內(nèi)均含有穿孔素（Perforin）、顆粒酶（Granzyme，Grs）和顆粒溶素（Granulysin，GNLY）[4]。當(dāng)淋巴細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞后，顆粒酶會(huì)迅速釋放到淋巴細(xì)胞—靶細(xì)胞突觸中，通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡;穿孔素有助于顆粒酶進(jìn)入靶細(xì)胞胞質(zhì)發(fā)揮作用，該途徑是CTL誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的主要機(jī)制;顆粒溶素對(duì)多種微生物和腫瘤具有廣泛的細(xì)胞溶解活性[5]。因此，NK和淋巴細(xì)胞數(shù)量的增加，穿孔素、顆粒酶和顆粒溶素釋放增多被視為增強(qiáng)免疫功能的關(guān)鍵指標(biāo)。有學(xué)者已在日本進(jìn)行了針對(duì)健康志愿者為期3天2夜的森林康養(yǎng)對(duì)免疫功能影響的研究，但由于地理位置不同、森林結(jié)構(gòu)以及研究季節(jié)等諸多因素的差異，非常有必要進(jìn)行對(duì)比研究。本文通過分析健康志愿者夏季在長(zhǎng)白山二道白河區(qū)進(jìn)行森林康養(yǎng)前后免疫功能相關(guān)指標(biāo)的變化，明確森林康養(yǎng)能夠提高免疫功能的相關(guān)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況及研究對(duì)象

本研究在吉林省長(zhǎng)白山二道白河區(qū)著名的風(fēng)景地長(zhǎng)白山天池附近開展，康養(yǎng)區(qū)分為休閑娛樂區(qū)、森林本底區(qū)和棧道休憩區(qū)，二道白河區(qū)夏季林分豐富，覆蓋著大量的喬木和灌木，景色宜人，且森林步道完好，輔助設(shè)施完善。本次森林康養(yǎng)研究期間環(huán)境質(zhì)量佳，適合康養(yǎng)活動(dòng)[6]。

本研究從吉林市政府部門及當(dāng)?shù)卮髮W(xué)篩選12名健康志愿者，其年齡介于50～60歲，平均年齡為（55.8±6.68）歲。所有志愿者均無心血管疾病、精神疾病史，3個(gè)月內(nèi)未服用任何影響身心健康的藥物，近期沒有參加過森林康養(yǎng)或其他類似的旅行。所有志愿者在森林康養(yǎng)過程中三餐合理搭配，不可飲用含有酒精的飲料。該項(xiàng)研究符合北華大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求，康養(yǎng)前，所有的志愿者均親自簽署知情同意書并詳細(xì)填寫調(diào)查問卷[6-8]。

1.2 康養(yǎng)過程

志愿者于2019年7月上旬在長(zhǎng)白山二道白河區(qū)進(jìn)行了為期3天2夜康養(yǎng)之旅，為防止情緒波動(dòng)對(duì)康養(yǎng)效果產(chǎn)生影響，志愿者在酒店內(nèi)可以隨意活動(dòng)，但要避免劇烈運(yùn)動(dòng)以及長(zhǎng)時(shí)間瀏覽手機(jī)網(wǎng)頁(yè)、打電話或其他影響睡眠的刺激性活動(dòng)。本研究的康養(yǎng)活動(dòng)與日本學(xué)者李卿教授[4]設(shè)計(jì)的森林浴相似。主要過程為：第1天下午，志愿者在廣泛種植白樺、胡桃、松樹、柏樹和灌木的康養(yǎng)區(qū)漫步，時(shí)長(zhǎng)為2 h;第2天，志愿者分別于上午和下午在林中步道各漫步2 h，森林漫步期間在棧道休憩區(qū)約進(jìn)行1 h森林冥想，徹底放松;第3天一大早，志愿者抽取血樣并完成問卷調(diào)查后返回吉林市。除午餐時(shí)間外，所有志愿者9∶00—17∶00停留在森林康養(yǎng)區(qū)。第1天和第3天早8∶00前完成采取及調(diào)查問卷工作。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

為驗(yàn)證森林康養(yǎng)對(duì)免疫功能的影響，本研究分別于森林康養(yǎng)前后采集志愿者靜脈血樣，進(jìn)行外周血CD56+ NK 細(xì)胞和CD3+ 淋巴細(xì)胞百分比檢測(cè)，以及血清GrA、GrB、perforin和GNLY分泌水平檢測(cè)。

1.3.1 主要試劑

本研究所用主要試劑有：抗CD3-FITC （ab34275）抗體和抗CD56-FITC （ab234250）抗體購(gòu)自Abcam公司 （Cambridge， MA， USA）;人源性 GNLY Elisa kit（XL-Eh1850）試劑盒、人源性 Gra-A Elisa kit（XL-Eh1375）試劑盒、人源性Gra-B Elisa kit （XL-Eh1374）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司（Cambridge， MA， USA）;其他均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3.2CD56+ NK細(xì)胞和CD3+淋巴細(xì)胞百分比檢測(cè)

抽取靜脈血，采用乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）進(jìn)行抗凝，抗CD56-FITC抗體和抗CD3-FITC抗體與100 μL 全血混合，分別與特異性的靶細(xì)胞結(jié)合，紅細(xì)胞經(jīng)氯化銨溶液處理后產(chǎn)生溶血，離心后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)NK細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的百分比。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme Linked Immunosorbent Assay， ELISA）

制備血漿于4 ℃冰箱內(nèi)保存。利用生物素標(biāo)記的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)perforin、Grs和GNLY的水平。ELISA試驗(yàn)的主要過程為：首先將血漿加入事先包被好的孔板內(nèi)，37 ℃孵育2 h后，將生物素標(biāo)記的perforin、GrA、GrB和GNLY 抗體加入孔板內(nèi)，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素（streptavidin-HRP）形成復(fù)合物，孵育2 h后充分洗滌，除去未結(jié)合的酶;然后加入底物A和B以生成藍(lán)色產(chǎn)物，該產(chǎn)物在酸的作用下轉(zhuǎn)化為最終的黃色。顏色的深度與樣品中靶分子的濃度呈正比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用配對(duì)的t檢驗(yàn)檢測(cè)康養(yǎng)前后相關(guān)指標(biāo)的變化，使用Microsoft Excel software package作圖，以P<0.05作為差異具有顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 森林康養(yǎng)對(duì)外周血淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞百分比的影響

經(jīng)過3天2夜的森林康養(yǎng)，志愿者外周血淋巴細(xì)胞的百分比明顯增加（P= 0.049），NK細(xì)胞的百分比亦明顯增加（P = 0.027）（圖1）。

2.2 森林康養(yǎng)對(duì)穿孔素、顆粒酶及顆粒溶素釋放的影響

NK細(xì)胞主要通過細(xì)胞毒顆粒的釋放以及受體介導(dǎo)的凋亡途徑誘導(dǎo)靶細(xì)胞死亡，一旦NK細(xì)胞接近欲殺死的靶細(xì)胞，perforin就從淋巴細(xì)胞釋放，在靶細(xì)胞的胞膜形成微小孔道，Grs以及其他的相關(guān)分子將通過微孔道進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞的凋亡。3天2夜的森林康養(yǎng)可顯著提高志愿者血漿中perforin的水平（圖2）（P= 0.011） ，同時(shí)，血漿中GrA（圖2）和GrB（P=0.044）（圖3）的水平明顯增加。

GNLY可以借助其陽離子兩性結(jié)構(gòu)裂解細(xì)菌膜，并具有對(duì)線粒體和溶酶體膜的透化作用，能夠殺死CTL或NK細(xì)胞靶向的其他細(xì)胞，是反映機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示：為期3天2夜的森林康養(yǎng)明顯增加CD56+ NK 細(xì)胞和CD3+ 淋巴細(xì)胞釋放GNLY（圖2）。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本研究于盛夏7月在長(zhǎng)白山二道白河區(qū)進(jìn)行為期3天2夜的康養(yǎng)活動(dòng)，對(duì)比分析了森林康養(yǎng)前后全血CD3+淋巴細(xì)胞和CD56+NK細(xì)胞百分比變化以及血漿perforin、GrA、GrB和GNLY水平差異。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：為期3天2夜的康養(yǎng)活動(dòng)明顯提高了CD3+淋巴細(xì)胞和CD56+NK細(xì)胞百分比，同時(shí)血漿中Perforin、GrA、GrB和GNLY的水平較康養(yǎng)前也明顯增加。研究結(jié)果證實(shí)了夏季在長(zhǎng)白山地區(qū)進(jìn)行森林康養(yǎng)可以明顯提高機(jī)體免疫功能，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探討，本研究還存在需改進(jìn)之處，如增加不同年齡段志愿者人數(shù)、適當(dāng)延長(zhǎng)康養(yǎng)時(shí)間，進(jìn)行春、秋、冬季康養(yǎng)效果比較等，條件允許可進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探討森林康養(yǎng)提高機(jī)體免疫功能的機(jī)理等。

3.2 討論

本研究結(jié)果表明，森林康養(yǎng)后明顯提高了血液中CD3+淋巴細(xì)胞和CD56+NK細(xì)胞百分比，同時(shí)血漿中Perforin、GrA、GrB和GNLY的水平較康養(yǎng)前也明顯增加。說明森林康養(yǎng)可使免疫細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)進(jìn)入外周血的數(shù)量增加，同時(shí)提高淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性。這也可能是由于這些細(xì)胞在多種抗原（如芬多精）的刺激下被激活，它們通過顆粒胞吐途徑將細(xì)胞內(nèi)perforin、Grs和GNLY釋放到細(xì)胞外，發(fā)揮相應(yīng)的免疫功能。已有研究證實(shí)，如果將小鼠的perforin基因敲除，則NK細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒作用將大大降低[9-10]，說明NK細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒作用至少部分通過perforin起作用。前期研究已表明，森林康養(yǎng)可緩解健康及2型糖尿病人群的應(yīng)激反應(yīng)，使交感神經(jīng)系統(tǒng)活性降低[6，8]，降低皮質(zhì)醇分泌及大腦前額葉活動(dòng)，但可增強(qiáng)副交感神經(jīng)系統(tǒng)的活性，并使外周血中淋巴細(xì)胞增加[11-12]，這些淋巴細(xì)胞可釋放大量的perforin、GrA、GrB和GNLY進(jìn)入血液循環(huán)，直接攻擊外來的異體細(xì)胞、體內(nèi)突變的腫瘤細(xì)胞和病毒感染的細(xì)胞。其他研究還表明，一般情況下，Perforin和Grs均貯存在NK細(xì)胞、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞及其他有核細(xì)胞的胞漿顆粒中，一旦這些細(xì)胞被激活，Perforin單體即可插入細(xì)胞膜，在鈣離子作用下，多個(gè)perforin聚合成內(nèi)徑約16nm的通道，使Grs等多種毒蛋白迅速進(jìn)入靶細(xì)胞。GrA既可直接激活Caspase，也可通過裂解IL-1發(fā)揮促凋亡效應(yīng);而GrB可直接降解Caspase底物、核基質(zhì)抗原、核酶抑制劑催化亞基及核纖層蛋白而發(fā)揮抗腫瘤及抗微生物效應(yīng)[13-14]。在殺傷異物的同時(shí)，Grs可通過正反饋途徑迅速合成更多的Grs[15]，發(fā)揮更強(qiáng)大的免疫效應(yīng)。GNLY主要由細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌，在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中，GNLY與perforin和Grs等顆粒成分一起排出胞外，參與抗菌、抗病毒、抗寄生蟲及殺傷腫瘤細(xì)胞等免疫過程[16]。因此，Perforin、GrA、GrB和GNLY的血漿水平在一定程度可以反應(yīng)機(jī)體短時(shí)間內(nèi)的免疫狀況。

參考文獻(xiàn)

[1]FRUMKIN H.Beyond toxicity：human health and the natural environment[J].American Journal of Preventive Medicine，2001，20（3）：234-240.

[2]LI Q，NAKADAI A，MATSUSHIMA H，et al.Phytoncides （wood essential oils） induce human natural killer cell activity[J].Immunopharmacol Immunotoxicol，2006，28（2）：319-333.

[3]易逸瑜，張慶費(fèi)，安齊，等.城市森林游憩發(fā)展探討[J].中國(guó)城市林業(yè)，2018，16（1）：7-10

[4]LI Q，MORIMOTO K，KOBAYASHI M，et al.Visiting a forest，but not a city，increases human natural killer activity and expression of anti-cancer proteins[J].International Journal of Immunopathology & Pharmacology，2008，21（1）：117-127.

[5]LI Q，KOBAYASHI M，INAGAKI H，et al.A day trip to a forest park increases human natural killer activity and the expression of anti-cancer proteins in male subjects[J].J Biol Regul Homeost Agents，2010，24（2）：157-165.

[6]修淑秋，王煥琦，王洪俊，等.長(zhǎng)白山二道白河地區(qū)森林康養(yǎng)緩解心理應(yīng)激作用[J].中國(guó)城市林業(yè)，2021，19（5）：40-45.

[7]MORITA E，F(xiàn)UKUDA S，NAGANO J，et al.Psychological effects of forest environments on healthy adults：shinrin-yoku （forest-air bathing，walking） as a possible method of stress reduction[J].Public Health，2007，121（1）：54-63.

[8]劉艷波，李燕，王煥琦，等.敦化雁鳴湖鎮(zhèn)森林康養(yǎng)區(qū)森林揮發(fā)物變化規(guī)律及康養(yǎng)緩解2型糖尿病患者應(yīng)激反應(yīng)[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2021，22（4）：421-431.

[9]KGI D，LEDERMANN B， BRKI K，et al.Cytotoxicity mediated by T cells and natural killer cells is greatly impaired in perforin deficient mice[J].Nature，1994，369（6475）：31-37.

[10]LI Q，NAKADAI A，TAKEDA K，et al.Dimethyl 2，2-dichlorovinyl phosphate （DDVP） markedly inhibits activities of natural killer cells，cytotoxic T lymphocytes and Iymphokine-activated killer cells via the Fas-ligand/Fas pathway in perforin-knockout （PKO） mice[J].Toxicology，2004，204（1）：41-50.

[11]MORI H，NISHIJO K，KAWAMURA H，et al.Unique immunomodulation by electro-acupuncture in humans possibly via stimulation of the autonomic nervous system[J].Neurosci Lett，2002，320（1-2）：21-24.

[12]PARK B J，TSUNETSUGU Y，KASETANI T，et al.The physiological effects of Shinrin-yoku （taking in the forest atmosphere or forest bathing）：evidence from field experiments in 24 forests across Japan[J].Environmental Health & Preventive Medicine，2010，15（1）：18-26

[13]SMYTH M J，KELLY J M，SUTTON V R，et al.Unlocking the secrets of cytotoxic granule proteins[J].Journal of Leukocyte Biology，2001，70（1）：18-29.

[14]Zhang D，BERESFORDP J，GREENBERG A H，et al.Granzymes A and B directly cleave lamins and disrupt the nuclear lamina during granule mediated cytolysis[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2001，98（10）：5746-5751.

[15]HINK-SCHAUER C，ESTEBANEZ-PERPINA E，KURSCHUS F C，et al.Crystal structure of the apoptosis-inducing human granzyme A dimer[J].Nature Structural Biology，2003，10（7）：535-540.

[16]李樹華，姚亞男，劉暢，等.綠地之于人體健康的功效與機(jī)理：綠色醫(yī)學(xué)的提案[J].中國(guó)園林，2019，35（6）：5-11.