非洲豬瘟的流行病學和疫苗研究最新進展

劉 芳，孫海娟，王建國，宋艷萍

（1.山東省威海市環(huán)翠區(qū)溫泉畜牧獸醫(yī)中心站，山東 威海 264200；2.山東省威海市環(huán)翠區(qū)動物疫病預防控制中心，山東 威海）

ASFV 是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，其擁有龐大的雙鏈DNA 基因組，包含從170～190 kb 大小不等的毒株，編碼了超過150 種蛋白質(zhì)，僅僅從病毒體中被鑒定出來的結構蛋白就多達68 種，許多蛋白質(zhì)仍未被鑒定出來。正是由于ASFV 極其復雜，以及對其毒力因子及其相關保護性的了解太少，至今仍未研制出針對ASFV 的安全有效的疫苗[1]。

ASF 嚴重危害生豬養(yǎng)殖業(yè)，目前控制ASF的辦法是隔離和撲殺受影響地區(qū)的動物。接種疫苗是阻止疫病蔓延的重要手段，研制ASF 疫苗是當務之急。本文對ASF 的流行病學和疫苗研究的最新進展加以綜述，為后續(xù)疫苗研發(fā)提供參考和依據(jù)。

1 ASF 流行病學

ASFV 具有高度傳染性和穩(wěn)定性，健康豬可以通過直接接觸感染的豬或被病毒污染的墊草、飼料、飲水等感染，也可通過軟蜱等媒介昆蟲叮咬而感染。ASFV 發(fā)現(xiàn)于非洲，在軟蜱、疣豬和野豬之間維持著叢林傳播循環(huán)，這些動物并不因感染ASFV 而患病。然而，ASFV 在家豬和野豬之間傳播，卻會造成極高的致病率和致死率。ASFV 在非洲的流行，首次記錄于20 世紀初。1957 年，ASFV 出現(xiàn)在非洲以外的葡萄牙，隨后從20 世紀60 年代到80 年代蔓延到西歐。在20世紀70 年代至80 年代初期，ASFV 出現(xiàn)在加勒比群島和巴西。到90 年代中期，除了自1982 年以來一直流行ASFV 的撒丁島除外，美洲和歐洲已消除ASFV[2]。2007 年，ASFV 傳入到高加索地區(qū)，并迅速傳播到東歐，然后繼續(xù)蔓延。隨后，ASFV 在遠至比利時西部的野豬中被發(fā)現(xiàn)。目前，ASFV 正在我國的家豬中傳播，并已蔓延至周邊國家，包括蒙古、越南、柬埔寨、老撾和朝鮮[3]。ASFV 目前有24 種基于主要衣殼蛋白p72 的基因型，以及基于病毒血凝素CD2 樣蛋白（CD2v）和C 型凝集素的8 種血清型[4]。在我國傳播的病毒已經(jīng)被鑒定為高致病性的基因II 型毒株。

2 疫苗研究進展

2.1 滅活疫苗

滅活疫苗具備制備工藝簡單、價格便宜等優(yōu)勢，因此是疫苗研制的首選工藝，ASF 疫情暴發(fā)后，最先開始研究的是滅活疫苗，但滅活疫苗誘導的免疫應答弱而且很難誘導產(chǎn)生有效的中和抗體，無法對ASFV 的感染起到保護作用。

2.2 減毒活疫苗

自然致弱活疫苗ASFV 可以通過細胞傳代培養(yǎng)使毒力減弱，但經(jīng)多次傳代培養(yǎng)后的毒株失去了保護性免疫抗原，無法誘導有效的免疫應答。經(jīng)豬骨髓細胞傳代培養(yǎng)獲得的弱毒株在西班牙和葡萄牙進行田間試驗，免疫豬群出現(xiàn)很多慢性或持續(xù)性ASFV 感染，產(chǎn)生嚴重副作用。自然致弱毒株 OURT88/3 和NH/P68 免疫豬群后可獲得抗親代毒株的100 % 免疫保護率，以及抗不同基因型ASFV 的66 %～100 % 交叉保護率。但自然致弱ASF 疫苗安全性問題堪憂，副作用多，且有毒力返強的可能，這在一定程度上阻礙了其作為商品化疫苗的發(fā)展。

重組致弱活疫苗敲除 ASFV TK、UK、9GL、EP402R、NL 或MCF 360/55 基因，可使ASFV 毒力減弱且具有較好的免疫原性，用此方法制備的重組致弱活疫苗對豬群進行免疫，可以不同程度抵御來自同源或異源ASFV 毒株的感染。我國哈獸研正研制的七基因缺失疫苗，已初步證明其具有一定的安全性和有效性[5]。若進一步確定ASFV 毒力關鍵基因，實現(xiàn)對目標毒力基因進行敲除或修改，找到穩(wěn)定的生產(chǎn)細胞系，重組致弱活疫苗將有望制備成我國首個商品化ASF疫苗[6]。

2.3 亞單位疫苗

最早證明可以抵抗ASFV 攻擊的重組ASFV蛋白是桿狀病毒表達的ASFV 血凝素（HA）蛋白，CD2v[7]。CD2v 不是強免疫原性抗原，需要大劑量的蛋白質(zhì)才能誘導較好的免疫保護作用。ASFV p54 和p30 分別參與病毒的附著和內(nèi)化，它們都能誘導機體產(chǎn)生中和抗體。單獨用p54 或p30 抗原免疫豬，可誘導免疫的豬產(chǎn)生中和抗體，但無法阻止免疫豬群的感染死亡。用p54 和p30 聯(lián)合免疫的豬，出現(xiàn)臨床癥狀延緩，病毒血癥減少的現(xiàn)象，部分豬受到保護免受E75 株強毒的攻擊。同樣用桿狀病毒表達的p54/p30 融合蛋白免疫的豬也可減少病毒血癥，同時保護所有豬免受E75 的致命攻擊。

用桿狀病毒表達蛋白p30+p54+p72+p22的混合物免疫的豬，對ASFV Pr4Ⅰ毒株的同源毒株的攻擊沒有保護作用，表明這些蛋白誘導的中和抗體不足以起到保護作用。早期重組CD2v的研究同樣支持這一結論，在沒有中和抗體的情況下產(chǎn)生了保護作用，這表明，中和抗體以外的因素在ASFV 保護中產(chǎn)生了作用。Oura 的試驗結果顯示，用減毒ASFV 株免疫去除了CD8+T 細胞的豬受到了同源毒株的攻擊，而未去除CD8+T細胞的豬則受到了保護，這證實了細胞介導的細胞毒性 T 淋巴細胞（CTL）免疫應答對抵抗ASFV 攻擊的重要作用[8]，該項研究表明，除了抗體外還需要一種能夠刺激T 細胞介導的免疫反應的疫苗來抵抗ASFV 的感染。

2.4 DNA 疫苗

DNA 疫苗與亞單位疫苗相比，能夠誘導CTL 免疫應答，對抵抗ASFV 的感染具有重要的保護作用[9]。同ASFV 亞單位疫苗制劑一樣，DNA 疫苗途徑的靶抗原也是p54 和p30。使用編碼p54/p30 融合蛋白的質(zhì)粒DNA 疫苗免疫豬，既不產(chǎn)生中和抗體，也不產(chǎn)生T 細胞反應，對ASFV 攻擊沒有保護作用[10]。用編碼豬白細胞抗原的SLAⅡ與p54/p30 融合的DNA 疫苗免疫豬，可產(chǎn)生廣泛的免疫應答，包括特異性抗體和T 細胞，但沒有保護豬免受ASFV 的攻擊。將ASFV 血凝素蛋白CD2v（稱為sHA）融合到p54/p30 嵌合體上[11]，用sHA/p54/p30 融合體對豬進行免疫，確實誘導了抗原特異性的B 細胞和T 細胞免疫反應，但沒有保護作用。然而在sHA/p54/p30 融合構建體中加入泛素對豬進行免疫接種，可誘導免疫豬群產(chǎn)生強烈的細胞免疫，并保護其免受ASFV 的攻擊，在缺乏可檢測到的中和抗體的情況下，存活率與T 細胞的存在具有相關性，進一步支持了CTLs 在抗ASFV 中具有重要作用。

建立的為識別ASFV 保護性免疫中T 細胞靶點的DNA 表達文庫，再次證明CTL 反應在抗ASFV 中的具有重要作用[12]。該文由80 個基于I型 Ba71v A 毒株的SFV 開放閱讀框組成，與泛素融合，約占 ASFV 編碼蛋白質(zhì)的一半。用DNA 文庫免疫豬，可使60 % 的豬免受致死性強毒株E75 的攻擊。免疫豬體內(nèi)未檢測到特異性抗ASFV 的抗體，但在攻毒后可檢測到ASFV 特異性T 細胞。

2.5 病毒載體疫苗

使用病毒載體是誘導特異性免疫及非特異性免疫的另一種疫苗方法。通過去除或使用免疫原替換病毒毒力基因，或使病毒載體無法復制來保障疫苗的安全性。同時，病毒載體疫苗可區(qū)分自然感染動物和疫苗接種動物，即編碼免疫原的病毒載體可以作為疫苗標記。迄今為止，在豬身上已經(jīng)評估了幾種基于載體的方法，但很少有針對ASFV 強毒株攻毒的試驗。

構建表達ASFV p30、p54、p72 的質(zhì)粒型甲病毒復制子載體系統(tǒng)來免疫豬。表達p30 的甲病毒免疫接種的豬產(chǎn)生高水平的p30 抗體，用p30免疫的豬血清中和病毒呈現(xiàn)陽性，提示中和活性水平偏低。表達p54 的甲病毒免疫接種豬產(chǎn)生低水平的抗p54 抗體，表達p72 甲病毒免疫豬血清未檢測到抗原特異性抗體。但將CD2v 的sHA 結構域加入p72 確實產(chǎn)生了可檢測水平的抗p72 抗體。各抗原在體外的表達水平與產(chǎn)生的免疫應答相關。遺憾的是，這項研究沒有包括細胞介導的免疫反應的數(shù)據(jù)，也未進行豬群攻毒保護試驗[13]。

用病毒載體遞呈抗原混合物免疫接種豬后，對其免疫原性進行研究。腺病毒遞送的ASFV 抗原p30+p54+p72+pp62，ASFV 基因A151R+B119 L+B602L+EP402R+PRR+B438L+K205R+A104R同時誘導高水平的抗原特異性體液免疫和細胞免疫應答[14]。另一種ASF 疫苗是由改良的痘苗病毒安卡拉載體遞送的ASFV 抗原p72、CD2v 和C型凝集素[15]。雖然沒有誘導表達抗原特異性抗體，但在免疫豬體內(nèi)檢測到了每一種抗原的T 細胞反應。然而，這些免疫研究都沒有完整的豬群攻毒保護試驗數(shù)據(jù)，免疫效果有待驗證。

3 小結

ASF 對全球的養(yǎng)豬行業(yè)造成嚴重影響，針對ASF 的多種疫苗策略已被研究，誘導產(chǎn)生中和抗體及CTL 反應是ASF 疫苗設計的重要內(nèi)容，許多策略需要進一步進行豬群攻毒保護試驗。目前來看，減毒活疫苗可以提供抵抗ASFV 的免疫保護，但卻有較多副作用，安全性有待提高，需要確定ASFV 毒力基因以準確對病毒基因進行改造，其次，找到穩(wěn)定的生產(chǎn)細胞系也是減毒活疫苗作為ASF 商品化疫苗生產(chǎn)需要解決的一個重要問題。亞單位疫苗和DNA 疫苗采用靶向方法，副作用小，安全性高，但研究者至今仍不清楚在毒理和免疫病理學或保護中發(fā)揮作用的ASFV 靶點有哪些，加深對ASFV 單個蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)組功能的理解，對于合理設計靶向疫苗非常重要。