棉花根際土壤真菌分離及黃萎病菌拮抗菌的篩選

郝海婷 牛冬冬 阿依妮薩·阿卜力海提 代先興唐澤文 李 猛 武 剛

（1塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院/南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

（2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

（3新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第一師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆 阿拉爾 843300）

棉花是我國(guó)重要的一種經(jīng)濟(jì)作物。新疆棉花總產(chǎn)量已連續(xù)20多年位居全國(guó)第一位[1]。隨著種植面積的不斷擴(kuò)大和連作種植，土傳病害發(fā)生嚴(yán)重，尤其是由大麗輪枝菌引起的棉花黃萎病是棉花主產(chǎn)區(qū)的重要病害，已嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)[2-3]。

一直以來，棉花黃萎病的防治比較困難，尚未找到根治的有效防治方法。當(dāng)前，在新疆地區(qū)，棉花黃萎病的防治大多采取“預(yù)防為主，綜合防治”的植保策略，主要通過種植抗病、耐病品種以及結(jié)合輪作、深翻等措施控制棉花黃萎病蔓延[4-5]。近年來，土壤消毒、種子消毒以及生物防治等手段逐漸在棉花黃萎病病害防治中開始應(yīng)用[5-6]。

生物防治既符合人們對(duì)綠色環(huán)保的需求，又可為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供保障，現(xiàn)已成為防治植物病害的研究熱點(diǎn)。生物防治方法中，利用有益微生物防治各種植物病害是切實(shí)可行的策略之一[7]。對(duì)植物病害有拮抗效果的有益微生物包括真菌、細(xì)菌和放線菌。拮抗真菌大多存在于植物根系和葉圍，對(duì)植物有著很好的親合性，在作物上定植，生防效果穩(wěn)定，拮抗菌分泌次級(jí)代謝產(chǎn)物，通過直接或間接的方式，達(dá)到阻礙或殺死病原菌的效果[8-9]。因此，尋找環(huán)境中高效、多功能的生防微生物是目前棉花黃萎病防治的發(fā)展方向[10]。

本研究通過對(duì)田間3株健康棉花的根際土壤真菌進(jìn)行分離和純化，利用皿內(nèi)對(duì)峙方法篩選對(duì)棉花黃萎病菌有抑制效果的拮抗菌，并利用分子方法鑒定菌種，明確其種屬地位，為研制防治棉花黃萎病的高效綠色微生物制劑提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 土壤拮抗真菌的分離、純化、形態(tài)觀察

棉花品種為新陸中37。選取棉田3個(gè)不同點(diǎn)分別取棉花根際土樣，每個(gè)點(diǎn)選擇一株健康棉花根際土壤。棉花根際土樣真菌分離采用稀釋平板法。具體步驟為：取棉花根際土樣5 g，懸浮于45 ml無菌水中，在水平搖床上以80 rpm、25℃條件下振蕩培養(yǎng)20 min，即得懸液，并以此稀釋至10-5倍。采用PDA培養(yǎng)基，用移液器分別取土壤稀釋液0.1 mL涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，25℃培養(yǎng)4～5 d，選取生長(zhǎng)良好的菌落繼續(xù)純化3次，觀察記錄。

1.2 棉花根際土壤微生物DNA提取

一種快速提取DNA的方法，具體步驟如下所示。第一步：無菌條件下，用無菌槍頭挑純化好的菌絲到1.5 mL離心管；第二步：加入50 uL 10*TE buffer溶液，振蕩分散菌絲；第三步：封口，微波爐700 W 2 min；第四步：取出立即冰浴2 min，然后離心10 min；第五步：移液器緩慢取10 uL上清液作為PCR模板。

1.3 拮抗真菌的分子鑒定

以提取DNA為模板進(jìn)行rDNA-ITS、EF-1α、βtubulin和ACT基因測(cè)序，在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast比對(duì)，選取序列同源性比較值較高的作為參考菌株，評(píng)估物種的相似度。所用引物序列見表1。

PCR反應(yīng)體系為25 uL：DNA模板1 uL，2×Es Taq Master Mix12.5 uL，引物-F0.3 uL，引物-R0.3 uL，ddH2O 10.9 uL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.4 抑菌實(shí)驗(yàn)

通過平板對(duì)峙法測(cè)定分離真菌對(duì)大麗輪枝菌的拮抗效果，具體步驟：在新鮮固體PDA培養(yǎng)皿正中間用記號(hào)筆分別在距離點(diǎn)2.5 cm左右兩側(cè)同一水平線上做標(biāo)記；用8 mm無菌打孔器在大麗輪枝菌培養(yǎng)皿邊緣打孔，菌餅菌絲面朝下放入PDA左側(cè)標(biāo)記處，封口，放入28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d（大麗輪枝菌生長(zhǎng)緩慢）；生長(zhǎng)5～7 d的大麗輪枝菌培養(yǎng)基另一端加入純化后的分離真菌，同樣用8 mm無菌打孔器打孔，菌餅菌絲面朝下放入，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至產(chǎn)生抑菌圈；對(duì)照是在新鮮固體PDA培養(yǎng)皿左側(cè)標(biāo)記點(diǎn)打上8 mm大麗輪枝菌菌餅，右側(cè)標(biāo)記點(diǎn)打8 mm PDA空白菌餅，放入28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；每個(gè)實(shí)驗(yàn)三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

表1 所用引物序列及其來源

計(jì)算抑菌率：抑菌率=（對(duì)照組真菌菌落生長(zhǎng)直徑-處理組真菌菌落生長(zhǎng)直徑）/對(duì)照組真菌菌落生長(zhǎng)直徑×100%。抑菌率數(shù)值越高說明抑菌作用越強(qiáng)，拮抗效果越好。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理；使用Bioedit進(jìn)行序列整理，進(jìn)一步在NCBI上比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花根際土壤真菌的分離情況

采用稀釋平板法進(jìn)行菌株的分離與純化，從3份土壤樣本中分離獲得若干菌株，針對(duì)這些分離真菌的菌落形態(tài)特征進(jìn)行初步判斷，將這些菌株分為3大類。第一類菌株包括C11，菌株C11接種至PDA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5 d后，菌落正面呈白色，背面呈淡黃色，邊緣菌絲形狀不規(guī)則（圖1：A和B）；第二類菌株包括C41、A21和C421，菌落呈波浪狀或高山狀，氣生菌絲呈白色，且輻射狀蔓延，有的菌株有白色菌絲隆起，7 d后菌絲幾乎鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿，基內(nèi)菌絲多層重疊（圖 1：C和 D）；第三類菌株包括 B11、B51、C31和C91，菌落正面呈白色，5 d左右后背面呈淡粉色，菌絲發(fā)達(dá)，絨毛狀（圖1：E和F）。

圖1 代表菌株菌落形態(tài)圖

2.2 棉花黃萎病拮抗菌的篩選

采用皿內(nèi)對(duì)峙法對(duì)分離真菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)（見表2、圖2）。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，分離出的每株真菌都對(duì)棉花黃萎病菌有一定的抑制作用，抑菌率為29.51%～42.86%，說明這些菌可能產(chǎn)生了具有抑制棉花黃萎病菌活性的代謝產(chǎn)物。

表2 棉花根際土壤分離真菌對(duì)棉花黃萎病菌的抑制效果

圖2 棉花根際土壤分離真菌對(duì)棉花黃萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

2.3 棉花根際土壤真菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

采用通用引物ITS1和ITS4，擴(kuò)增8株菌株，得到的片段長(zhǎng)度為570～680 bp之間（見表3）；分別采用EF-1α、β-tubulin和ACT基因擴(kuò)增根際土壤真菌，擴(kuò)增片段范圍分別為 216～229 bp、329～439 bp和 268～274 bp。

將測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步和NCBI上的基因序列進(jìn)行比對(duì)（表3），結(jié)果表明：分離獲得的B11菌，其ITS序列與粉紅粘帚霉Clonostachys rosea菌株的ITS序列同源性為99.83%（登錄號(hào)KX058045.1）、EF-1α序列與C.rosea菌株同源性為97.99%（登錄號(hào)MK752496.1）、β-tubulin序列與C.rosea菌株同源性為98.07%（登錄號(hào)KJ413352.1）、Actin序列與C.rosea菌株同源性為98.85%（登錄號(hào)MH102067.1）。分離獲得的B51菌，其ITS序列與粉紅粘帚霉C.rosea菌株的ITS序列同源性為99.82%（登錄號(hào)MT845995.1）、EF-1α序列與C.rosea菌株同源性為98.01%（登錄號(hào)MK752496.1）、β-tubulin序列與C.rosea菌株同源性為98.37%（登錄號(hào)AF358166.1）。分離獲得的C31菌，其ITS序列與粉紅粘帚霉C.rosea菌株的ITS序列同源性為99.83%（登錄號(hào) KX058045.1）、EF-1α序列與C.rosea菌株同源性為97.99%（登錄號(hào)MK752496.1）、β-tubulin序列與C.rosea菌株同源性為96.90%（登錄號(hào)KJ413352.1）、Actin序列與C.rosea菌株同源性為99.23%（登錄號(hào)MH102067.1）。分離獲得的C91菌，其ITS序列與粉紅粘帚霉C.rosea菌株的ITS序列同源性為 99.83%（登錄號(hào)KX058045.1）、EF-1α序列與C.rosea菌株同源性為99.49%（登錄號(hào)MT462122.1）、β-tubulin序列與C.rosea菌株同源性為97.83%（登錄號(hào)KJ413352.1）。

分離獲得的C11菌，其ITS序列與球毛殼菌Chaetomium globosum菌株的ITS序列同源性為100.00%（登錄號(hào)MN809366.1）；C41、A21和C421菌株，其ITS序列與高山被孢霉Mortierella alpina菌株的ITS序列同源性分別為99.41%（登錄號(hào)MF093212.1）、99.71%（登錄號(hào)KX343169.1）和99.56%（登錄號(hào)MT453270.1）。

根據(jù)分子研究結(jié)果，結(jié)合形態(tài)學(xué)的初步鑒定，該8株菌中B11、B51、C31和C91為C.rosea，歸屬于真菌界，半知菌門，叢梗孢科，粘帚霉屬；C41、A21和C421為M.alpina，歸屬于真菌界，接合菌門，被孢霉科，被孢霉屬；C11菌株為C.globosum，歸屬于真菌界，子囊菌門，毛殼科，毛殼屬。

表3 棉花根際土壤真菌的rDNA-ITS、EF-1α、β-tubulin和ACT序列相似性分析

3 討論與結(jié)論

粉紅粘帚霉是重要的生防真菌，具有生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)孢量大、拮抗能力強(qiáng)等多種優(yōu)點(diǎn)，除了對(duì)病原菌有重寄生、抗生、溶菌、競(jìng)爭(zhēng)作用外，還能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[11]，有良好的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。高航等[12]研究發(fā)現(xiàn)粉紅粘帚霉有較強(qiáng)的寄生能力，對(duì)林果枝干病害病原菌抑制率達(dá)60%以上；趙士振等[13]研究發(fā)現(xiàn)粉紅粘帚霉對(duì)果蔬灰霉病有很好的防效，能有效的寄生灰霉菌核及抑制孢子的產(chǎn)生；楊蕊等[14]研究發(fā)現(xiàn)粉紅粘帚霉菌絲可以重寄生苗期玉米莖基腐病病原菌菌絲,導(dǎo)致病菌菌絲細(xì)胞原生質(zhì)顆粒化、潰解，從而達(dá)到防治效果。但目前有關(guān)粉紅粘帚霉防治棉花黃萎病的報(bào)道較少，有待進(jìn)一步圍繞粉紅粘帚霉防治棉花黃萎病開展系統(tǒng)研究。

本研究還分離出一株在農(nóng)業(yè)和工業(yè)都有應(yīng)用的球毛殼菌。該菌對(duì)病原微生物和蚜蟲的生物防治有顯著作用[15-17]，可產(chǎn)生大量有生物活性的次級(jí)代謝物[18]，如球毛殼菌素，具有廣譜拮抗性和抗逆性，對(duì)多種作物病害具有良好的防治效果?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，球毛殼菌作為拮抗菌對(duì)三七根腐病[19]、油菜根腫病[20]、玉米大斑病[21]以及南方根結(jié)線蟲[22]都有很好的防治效果。新疆棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)主要受棉花黃萎病和棉蚜的影響，后續(xù)有必要將球毛殼菌作為潛在的棉花黃萎病和棉蚜防治菌，采用以菌治菌、以菌治蟲的防治策略，開發(fā)利用球毛殼菌防治棉花病蟲害。

綜上所述，本研究通過對(duì)棉花根際土壤真菌的研究，獲得的2株潛在拮抗菌（粉紅粘帚霉和球毛殼菌），可為進(jìn)一步有效防治棉花黃萎病提供菌種資源[23]，對(duì)后續(xù)棉花黃萎病在生物防治方面的研究具有重要意義。