基于RASEF基因性別間序列變異的鶴鴕性別鑒定

吳亞江 王 晨 翟俊瓊 陳 武

(廣州動(dòng)物園，廣州市野生動(dòng)物研究中心，廣州，510070)

雙垂鶴鴕(Casuariuscasuarius)俗稱食火雞，屬于平胸總目(Ratitae)，鶴鴕目(Struthioniformes)，鶴鴕科(Casuariidae)鳥類，分布于新幾內(nèi)亞南部及澳大利亞北部的熱帶雨林中，善于奔跑跳躍，性情機(jī)敏兇猛，主要以果實(shí)為食，偶爾捕捉一些蝸牛、昆蟲、小魚、鳥及鼠類。圈養(yǎng)條件下，處于幼雛至亞成體時(shí)期的鶴鴕，雌雄個(gè)體之間的體型外貌差別不大，性別鑒別存在極大的困難。需要確定其性別時(shí)，必須在保定狀態(tài)下翻查泄殖腔進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，否則從外觀來(lái)分辨鶴鴕幼雛甚至成年個(gè)體的性別是難以確定的，但鶴駝的保定是極為危險(xiǎn)，這種操作不僅對(duì)飼養(yǎng)人員和動(dòng)物造成極大的安全隱患，也對(duì)鶴鴕的飼養(yǎng)、配對(duì)和繁育造成了極大的困難。所以，需要建立一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、非損傷性的鶴鴕性別鑒定方法。

當(dāng)前國(guó)內(nèi)圈養(yǎng)條件下的鶴鴕數(shù)量較少，能夠成功繁殖的個(gè)體也是屈指可數(shù)[1-3]，主要原因是圈養(yǎng)鶴鴕性情比較兇猛，發(fā)情期同性之間易出現(xiàn)打斗，雌雄找不到合適的配對(duì)對(duì)象，造成雌雌、雄雄配對(duì)的現(xiàn)象。在不確定性別配對(duì)是否合適的情況下，繁殖期的營(yíng)養(yǎng)管理與群體管理就無(wú)從談起，導(dǎo)致鶴鴕即使能夠順利產(chǎn)卵，也會(huì)出現(xiàn)受精卵較少、質(zhì)量差、健雛率低的情況，造成人員物質(zhì)等方面很大的浪費(fèi)。如果能有一種從幼雛就能鑒定其性別的方法，我們可以進(jìn)行標(biāo)記，提早做好配對(duì)工作，減少發(fā)情期的打斗，提高配對(duì)種鳥的量，從而提高鶴鴕的繁殖率。

鳥類的性別按照染色體的不同，雌性個(gè)體的基因型為ZW，雄性的是ZZ。目前，常用EE0.6(0.6-Eco R I-fragment)和CHD(chromo-helicase-DNA-binding gene)性別連鎖基因鑒定鳥類的性別[4-7]。孫志明等[8]對(duì)白枕鶴(Grusvipio)和丹頂鶴(Grusjaponensis)CHD基因和EE0.6基因的序列進(jìn)行了特異性擴(kuò)增，成功地對(duì)鶴類的性別進(jìn)行了鑒定。Griffiths等[5]利用CHD基因?qū)饎傷W鵡Psittacdae等28種非平胸鳥類進(jìn)行了性別鑒定，但這種方法并不適合平胸鳥類性別鑒定。2010年付晶等[9-10]利用已報(bào)道的大量通用引物，進(jìn)行18種組合，最終找到了1對(duì)驗(yàn)證引物和1對(duì)有效引物，成功鑒定了鴯鹋(Dromaiusnovaehollandiae)和鴕鳥(Struthiocamelus)的性別。2015年，Morinha等[11]使用高分辨率溶解曲線的方法和測(cè)序的方法，對(duì)鴕鳥、美洲鴕(Rheaamericana)、鴯鹋和南方食火雞的4個(gè)性別鑒定候選基因(NTRK2、RASEF、TMEM2、DAPK1)進(jìn)行溶解曲線分析，詳細(xì)的解釋了這4個(gè)基因在4種鳥類上SNP位點(diǎn)的不同。但這一實(shí)驗(yàn)方法僅是理論上說(shuō)明這種方法的可行性，并沒(méi)有建立具體的鑒定方法，且該實(shí)驗(yàn)條件要求較高、操作復(fù)雜，成本高，實(shí)用性低等，不能夠推廣使用，存在極大的局限性。

因此，迫切需要開發(fā)一種簡(jiǎn)單方便的鶴鴕性別鑒定方法，本研究基于RASEF基因的測(cè)序與分析，通過(guò)SNP位點(diǎn)對(duì)鶴鴕進(jìn)行性別鑒定，建立一種鑒定鶴鴕性別的快速、準(zhǔn)確、可靠和安全的分子生物學(xué)方法，為鶴鴕的飼養(yǎng)管理與繁殖提供便利。

1 研究材料

本試驗(yàn)共采集14只雙垂鶴鴕樣本，其中2019年從廣東多家動(dòng)物園采集6只雙垂鶴鴕的樣本，包括3只已知性別(2只雄鳥和1只雌鳥)和3只未知性別的個(gè)體，樣本均為羽毛。另外8只未知性別的個(gè)體作為驗(yàn)證樣本來(lái)自華東某動(dòng)物園，其中4份羽毛，4份血液樣品。11只未知性別鶴駝樣品，根據(jù)飼養(yǎng)繁殖記錄和形態(tài)學(xué)觀察，性別為雌性個(gè)體8只，雄性為3只。

2 研究方法

2.1 基因組DNA提取

使用Blood Tissue DNA Kit(Omega Bio-Tek公司)和Forensic Tissue DNA Kit(Omega Bio-Tek公司)試劑盒分別對(duì)血液和羽毛樣品進(jìn)行DNA的提取。將羽毛的基部剪碎或取10 μL血液放入1.5 mL Eppendorf 離心管中，按照試劑盒的提取方法和步驟完成基因組DNA的提取。取適量的總DNA，使用7415 Nano超微量分光光度計(jì)檢測(cè)基因組DNA的純度和濃度，將基因組DNA保存在-20℃冰箱，備用。

2.2 傳統(tǒng)方法實(shí)驗(yàn)測(cè)試

2.2.1 引物設(shè)計(jì)

文獻(xiàn)[8-9]中選取已報(bào)道的4對(duì)(EE0.6/1272、P9/P14、P2/P8和2550F/2718)鳥類性別鑒定的通用引物(表1)。其中EE0.6/1272作為驗(yàn)證引物，對(duì)鶴鴕性別進(jìn)行鑒定；P2/P8、P9/P14和2550F/2718是有效引物，檢測(cè)提取的鶴駝DNA是否為有效DNA。

2.2.2 PCR擴(kuò)增與檢測(cè)

以羽毛和血液中提取的DNA為模板，以EE0.6/1272、P9/P14和2550F/2718R為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)在BIO-RAD T100TMPCR 儀上進(jìn)行。引物PCR擴(kuò)增體系：擴(kuò)增總體積為50 μL，其中Premix ExTaq20 μL、ddH2O 15 μL、RASEF-F1 5 μL、RASEF-R1 5 μL 、DNA模板5 μL。陰性對(duì)照中加5 μL的ddH2O，其余試劑不變。

EE0.6/1272、 P2/P8、2550F/2718R反應(yīng)程序及條件均按照文獻(xiàn)中為標(biāo)準(zhǔn)。

P9/P14反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 30 s；47.0℃ 40 s；72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。

用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，用紫外線投射分析儀凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

2.3 新方法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與驗(yàn)證

2.3.1 引物設(shè)計(jì)

選取文獻(xiàn)中最新的研究報(bào)道中RASEF基因作為靶基因[11]，將用文獻(xiàn)中雙垂鶴鴕的序列，在NCBI中BLAST，得到平胸目鳥類鴕鳥南非亞種(Struthiocamelusaustralis)和褐幾維鳥北島亞種(Apteryxaustralismantelli)的基因組組裝的同源序列(NCBI登錄號(hào)：JJRT01061438.1和LK107340.1)。通過(guò)同源序列的保守區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)的引物見表1。

表1 RASEF基因引物序列Tab.1 Primer sequence of RASEF gene

2.3.2 目的基因 PCR擴(kuò)增

設(shè)計(jì)的引物反應(yīng)體系和條件如下：擴(kuò)增反應(yīng)在BIO-RAD T100TMPCR 儀上進(jìn)行。引物PCR擴(kuò)增體系：擴(kuò)增總體積為50 μL，其中Premix ExTaq20 μL、ddH2O 15 μL、上下游引物(10 pmol/L)各5 μL、DNA模板5 μL。陰性對(duì)照中加5 μL的ddH2O，其余試劑不變。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s；49℃退火1 min；72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。利用1.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物，然后送至睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2.3.3 退火溫度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

以上述提取的DNA為模板進(jìn)行PCR，設(shè)退火溫度分別為49.0℃、47.0℃、46.0℃、45.0℃，其他條件及體系維持不變，擴(kuò)增后利用1.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物，確定最佳退火溫度。

2.3.4 靈敏性測(cè)試

用7415 Nano超微量分光光度計(jì)分別檢測(cè)羽毛和血液提取的基因組DNA的濃度，血液DNA的初始濃度在80—100 ng/μL，羽毛DNA的初始濃度在15—20 ng/μL，對(duì)80 ng/μL的樣品以0、5、25、125倍分別稀釋到80 ng/μL、3.2 ng/μL、0.64 ng/μL，并以各自濃度為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增后利用1.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物，觀察測(cè)試結(jié)果。

2.3.5 序列處理

3730xl(ABI)測(cè)序儀雙向測(cè)序，利用DNAStar v 7.1.0軟件包(DNASTARlnc，Madison，WI，USA)中的Seqman程序?qū)y(cè)序結(jié)果進(jìn)行正反鏈?zhǔn)止ばＵ?，所有的核苷酸位點(diǎn)均無(wú)雜峰。在序列中，如果存在明顯由于測(cè)序問(wèn)題造成的堿基錯(cuò)誤，為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性需重新對(duì)其測(cè)定。序列經(jīng)過(guò)校對(duì)無(wú)誤后，利用SeqMan中的“存成一致序列(save consensus)”選項(xiàng)中“Single file”命令，根據(jù)樣品信息重新命名，將正反鏈存成fas，aqd和seq 3種形式的文件，完成序列的拼接和手工校對(duì)。最后，比對(duì)分析序列中的SNP位點(diǎn)。

3 結(jié)果分析

1對(duì)驗(yàn)證引物(EE0.6/1272)和3對(duì)有效引物(P2/P8、P9/P14和2550F/2718)對(duì)已知性別中的雌雄2只鶴鴕進(jìn)行PCR檢測(cè)，瓊脂糖凝膠結(jié)果表明：3對(duì)驗(yàn)證引物中，P9/P14出現(xiàn)條帶，P2/P8和2550F/2718均無(wú)條帶(圖1)，1對(duì)有效引物雌雄都出現(xiàn)多條電泳條帶(圖2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，利用1對(duì)驗(yàn)證引物和1對(duì)有效引物性別檢測(cè)的方法無(wú)法鑒定鶴鴕的性別。

我們使用本實(shí)驗(yàn)新設(shè)計(jì)的引物檢測(cè)14只鶴鴕，PCR擴(kuò)增后用瓊脂糖凝膠電泳(圖3)。結(jié)果顯示，此引物通過(guò)PCR成功擴(kuò)增14只鶴鴕的樣本，擴(kuò)增條帶單一，條帶大小符合預(yù)期，約為300 bp(圖3)。退火溫度測(cè)試顯示，在45—49℃均能擴(kuò)增出目的大小條帶，而在退火溫度為49.0℃擴(kuò)增條帶最明亮；濃度為 80 ng/μL 的DNA為模板，以5倍依次稀釋，PCR均出現(xiàn)目的條帶(圖5)，稀釋0倍時(shí)條帶最亮，亮度隨著濃度降低而減弱。

對(duì)鶴鴕的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用反向引物RASEF-R1的測(cè)序結(jié)果由于存在插入缺失而出現(xiàn)大量雙峰，而使用正向引物RASEF-F1的測(cè)序結(jié)果序列峰值較好，可以作為后期分析資料。通過(guò)比較采自廣東某些動(dòng)物園的3只已知性別個(gè)體的序列，發(fā)現(xiàn)雄性個(gè)體在擴(kuò)增RASEF基因序列的第119位點(diǎn)、157位點(diǎn)和162位點(diǎn)分別為G/G、T/T、C/C，而雌性個(gè)體在這3個(gè)位點(diǎn)均為雜合子A/G、T/G、C/T。由于鳥類的雄性染色體是ZZ，雌性染色體為ZW，所以雄性個(gè)體在這3個(gè)位點(diǎn)呈現(xiàn)單一的堿基峰值，而雌性個(gè)體的這3個(gè)位點(diǎn)的堿基為雜合子，測(cè)序結(jié)果在該位點(diǎn)中出現(xiàn)雙峰(圖6)。

我們對(duì)驗(yàn)證組中未知性別的11只鶴鴕樣本進(jìn)行鑒定，根據(jù)測(cè)序結(jié)果判定為2只雄性和9只雌性，結(jié)果與動(dòng)物園后續(xù)提供的形態(tài)學(xué)鑒定信息相一致。因此，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以準(zhǔn)確地對(duì)未知性別的鶴鴕樣品進(jìn)行性別鑒定。

4 討論

目前，從外觀無(wú)法鑒定性別的鳥類，通常采用分子生物學(xué)的方法篩選性染色體基因組上的非同源區(qū)域，然后進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增，用瓊脂糖凝膠檢測(cè)條帶的方法來(lái)鑒定鳥類的性別，電泳結(jié)果呈現(xiàn)2條帶的為雌性，1條帶的是雄性，或者電泳結(jié)果呈現(xiàn)1條帶的為雌性，無(wú)條帶的是雄性。鸚鵡(Psittaculaspp.)、丹頂鶴與雀類等鳥類的性別鑒定方法都是基于EE0.6和CHD基因的同源性序列來(lái)開發(fā)的。

迄今為止，關(guān)于鶴鴕的非保定狀態(tài)下簡(jiǎn)易可靠的性別鑒定方法極少。因此，建立一種簡(jiǎn)單、便捷、無(wú)損且對(duì)鶴鴕傷害較小的性別鑒定方法非常迫切。本研究中，由于RASEF基因短小，存在連鎖變異位點(diǎn)，測(cè)序簡(jiǎn)單，我們把RASEF基因作為靶向基因，選取其他平胸總目鳥類的RASEF基因的同源序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR及測(cè)序。RASEF基因序列顯示，雄性所有位點(diǎn)的堿基均為單一峰值；雌性個(gè)體中，有3個(gè)位點(diǎn)(119、157和162)均為雜合子(圖5)，利用該基因在性染色體中SNP位點(diǎn)上的差異檢測(cè)個(gè)體的性別。我們對(duì)14只采自不同動(dòng)物園的鶴鳥羽毛或組織利用該方法進(jìn)行鑒定，其結(jié)果與后續(xù)形態(tài)學(xué)分析一致，說(shuō)明該方法結(jié)果可靠。同時(shí)，做最適退火溫度試驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)各退火溫度均能擴(kuò)增出目的條帶，說(shuō)明該引物對(duì)退火溫度要求不高，適用的溫度范圍較廣；敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示4種不同濃度均能有效擴(kuò)增出目的條帶，也表明該引物敏感性高，對(duì)試驗(yàn)樣品采集的量要求不高。

本研究打破傳統(tǒng)利用PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR條帶數(shù)量來(lái)確定性的實(shí)驗(yàn)方法，利用正向測(cè)序的SNP位點(diǎn)變化情況來(lái)確定鶴鴕的性別，鑒定結(jié)果與付晶等[9-10]實(shí)驗(yàn)方法相比，無(wú)雜帶、錯(cuò)峰等現(xiàn)象，鑒定結(jié)果更可靠?；赗ASEF對(duì)鶴鴕進(jìn)行性別鑒定的方法，具有成本小、不用捕捉動(dòng)物、靈敏度較高，僅需采集少量羽毛、對(duì)動(dòng)物沒(méi)有任何損傷、鑒定快速等優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)的準(zhǔn)確率極高，是一種較理想的鶴鴕性別鑒定方法。未來(lái)可以在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步開發(fā)熒光定量PCR的檢測(cè)方法，減少測(cè)序的過(guò)程，可以獲得更簡(jiǎn)便快捷的效果，為以后平胸鳥類性別鑒定的研究提供了新的技術(shù)方法和研究方向。