甲酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與自噬的實(shí)驗(yàn)研究

陳 楠， 郝樂樂， 嚴(yán) 姣， 李亞妮， 劉賀榮

（寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，銀川 750004）

甲醇（CH3OH）可經(jīng)呼吸道、消化道、皮膚接觸進(jìn)入機(jī)體，甲醇主要在肝中代謝，在體內(nèi)醇脫氫酶催化作用下代謝成甲醛，然后通過(guò)醛脫氫酶被迅速氧化代謝為甲酸[1]。其中甲酸被認(rèn)為是甲醇毒性作用中的關(guān)鍵成分[2]。甲醇中毒后主要表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、眼部損傷和代謝性酸中毒。有研究表明[3]，甲醇中毒大鼠腦中可檢測(cè)到甲酸，說(shuō)明其可通過(guò)血腦屏障進(jìn)入大腦發(fā)揮毒作用。因此推測(cè)代謝產(chǎn)物甲酸可能在甲醇神經(jīng)毒性中發(fā)揮著重要的作用。細(xì)胞凋亡（apoptosis）又被稱為Ⅰ型細(xì)胞程序性死亡，是一種基于遺傳機(jī)制的細(xì)胞死亡模式，其誘導(dǎo)了一系列細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，如細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)凝聚、分裂凋亡小體等[4]，有報(bào)道表明[5]，各種有害因素引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷都與細(xì)胞的線粒體凋亡密切相關(guān)。自噬是Ⅱ型細(xì)胞程序性死亡方式，自噬在維持神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞正常功能中起到重要作用，維持神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)活動(dòng)需要大量的能量，而這些能量的需求在很大程度上是通過(guò)自噬來(lái)解決的[6-7]。越來(lái)越多的研究表明[8-9]，細(xì)胞的最終命運(yùn)是由自噬和凋亡的交叉作用決定的?？赡苁亲允蓳p傷可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，繼而破壞自噬過(guò)程，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[10]。因此，本文通過(guò)不同濃度甲醇代謝物——甲酸處理PC12 細(xì)胞，探討甲酸對(duì)PC12 細(xì)胞凋亡及自噬的影響，為進(jìn)一步闡明甲醇神經(jīng)毒性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

甲酸（天津大茂生物公司/中國(guó)）；胎牛血清（Biological Industries/以色列）；MEM 培養(yǎng)基（上海中橋新舟/中國(guó)）；CCK-8 細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒（貝博公司/中國(guó)）；凋亡試劑盒（貝博公司/中國(guó)）；AO/EB（貝博公司/中國(guó)）；熒光顯微鏡（Olympus/日本）；流式細(xì)胞儀（Sysmex/日本），電泳儀（Tanon/中國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與染毒

腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤高分化細(xì)胞株（PC12 細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)上?？茖W(xué)院細(xì)胞庫(kù)）用1640 完全培養(yǎng)液輕柔吹勻制備為細(xì)胞懸液，加入適量的細(xì)胞懸液于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且細(xì)胞狀態(tài)良好的PC12 細(xì)胞，棄舊培養(yǎng)液，經(jīng)過(guò)洗滌、消化后制備成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并用1640 完全培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞密度最終為6×103個(gè)/mL。分別接種于0、8.32、10.40、12.48、14.56、16.64、18.72 mmol·L-1甲酸的96 孔板中，每組5個(gè)復(fù)孔，每孔100 μL 染毒24 h。

1.3 CCK-8 法檢測(cè)PC12 細(xì)胞活力

待加藥24 h 后，棄掉含甲酸培養(yǎng)液，每孔加入含10% CCK-8 液的培養(yǎng)液100 μL，置于培養(yǎng)箱中孵育1~2 h 后，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm 處檢測(cè)各孔光密度（OD）值，由此確定染毒細(xì)胞的甲酸濃度為0、8.32、12.48、16.64 mmol·L-1；根據(jù)確定的甲酸染毒濃度，染毒PC12 細(xì)胞6、12、24、48 h。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。計(jì)算細(xì)胞活力，采用以下公式計(jì)算：細(xì)胞活力（細(xì)胞存活率）=（實(shí)驗(yàn)組OD 值-空白組OD 值）÷（對(duì)照組OD 值-空白組OD 值）×100%。

1.4 AO/EB 染色熒光顯微鏡觀察各劑量組細(xì)胞的凋亡情況

收集上清液于15 mL 離心管中，用1 mLPBS洗滌細(xì)胞2 次后，收集舊培養(yǎng)液及用不含EDTA 胰酶消化30 s 的細(xì)胞于5 mL 的離心管中，置于轉(zhuǎn)速為1000 r·min-1的離心機(jī)中離心，用預(yù)冷的PBS 洗滌2 次，500 μL 染色液重懸細(xì)胞，加入A 染液及B染液各5 μL，輕輕混勻，4 ℃避光孵育20 min 后，棄去染液，用PBS 洗滌，用PBS 制備成細(xì)胞懸液，滴至載玻片上，加蓋玻片。以波長(zhǎng)488 nm 的紫外光激發(fā)，熒光顯微鏡下觀察各劑量組細(xì)胞的凋亡情況。

1.5 Annexin V-FITC 雙染法檢測(cè)PC12 細(xì)胞凋亡

細(xì)胞以3×105個(gè)/孔的密度接種于6 孔板內(nèi)，每組3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)12 h 后棄去培養(yǎng)液，加入濃度為0、8.32、12.48、16.64 mmol·L-1的甲酸染毒，染毒24 h 后，收集舊培養(yǎng)液及用不含EDTA 胰酶消化30 s 的細(xì)胞于5 mL 的離心管中，置于轉(zhuǎn)速為1000 r·min-1的離心機(jī)中離心，然后棄去上清液，加入1 mL 的PBS 洗滌2 次，冰上加入400 μL 異硫氰酸熒光素（FITC）結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞并加入5 μL Annexin V-FITC，4 ℃避光孵育15 min，再向細(xì)胞混懸液中加入10 μL 碘化丙啶（PI），4 ℃避光孵育5 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，其結(jié)果采用FSC Express 軟件分析。

1.6 MDC 染色觀察細(xì)胞自噬的情況

染毒24 h 后，用不含EDTA 的胰酶消化30 s，制備成細(xì)胞懸液，并移入1.5 mL 的EP 管中，置于轉(zhuǎn)速為800×g的離心機(jī)中離心5min，將上清液棄去，用稀釋的1×Wash Beffer 重懸細(xì)胞，使其細(xì)胞密度達(dá)到106個(gè)/mL。吸取90 μL 細(xì)胞懸液和10 μL MDC 染液于1.5 mL 的EP 管中，輕吹打?qū)⑵浠靹?，室溫避?0 min 后，將EP 管置于轉(zhuǎn)速為800×g的離心機(jī)中離心5 min，棄去染液，用稀釋的1×Wash Beffer 300 μL 洗滌細(xì)胞3 次。100 μL 的collection buffer 重懸細(xì)胞，并將100 μL 的細(xì)胞懸液滴于載玻片上，加蓋玻片，用熒光顯微鏡紫外激發(fā)光355 nm，阻斷濾光片512 nm 下觀察細(xì)胞自噬的情況。

1.7 Western blot 檢測(cè)PC12 細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白

染毒24 h 后，PBS 洗滌細(xì)胞2 次，每孔加入裂解液，用刮刀將細(xì)胞刮下，收集到EP 管中冰上裂解30 min。4 ℃，12000×g離心5 min。取上清液按照BCA 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。經(jīng)SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉TBST 溶液室溫下封閉，再將PVDF 孵育上相應(yīng)的一抗，4 ℃過(guò)夜，TBST 清洗3 次，二抗封閉，室溫孵育1 h，TBST 清洗3 次，膜蛋白表面上均勻涂抹顯影液，避光孵育5 min 后用Bio-rad 凝膠成像系統(tǒng)曝光顯影。應(yīng)用Image J 軟件分析灰度值（目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白的灰度值/內(nèi)參的灰度值）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。組間比較采用單因素的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甲酸對(duì)PC12 細(xì)胞活力的影響

不同濃度甲酸（0、8.32、10.40、12.48、14.56、16.64、18.72 mmol·L-1）對(duì)PC12 細(xì)胞干預(yù)24 h，各甲酸濃度組細(xì)胞活力差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。且各甲酸濃度組與細(xì)胞活力呈負(fù)相關(guān)，隨著甲酸濃度增加細(xì)胞活力逐漸減?。╮=-0.981，P<0.01）。根據(jù)回歸方程y=-0.0269x+0.9976 計(jì)算出半數(shù)抑制濃度IC50為18.27 mmol·L-1，確定0、8.32、12.48、16.64 mmol·L-1為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。根據(jù)確定的甲酸染毒濃度分別染毒PC12 細(xì)胞6、12、24、36、48 h 后，觀察細(xì)胞活力的改變，由圖2 可知，細(xì)胞活力隨著染毒時(shí)間的增加逐漸降低，有明顯的時(shí)間依賴關(guān)系。經(jīng)查閱文獻(xiàn)及觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)最終選取24 h 為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的染毒時(shí)間。見圖1、圖2。

2.2 AO/EB 染色觀察PC12 凋亡形態(tài)學(xué)的改變

甲酸濃度為0、8.32、12.48、16.64 mmol·L-1染毒PC12 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞經(jīng)AO/EB 雙染，AO能透過(guò)正常細(xì)胞完整的細(xì)胞膜，使細(xì)胞著綠色熒光，而EB 僅能通過(guò)細(xì)胞膜受損的細(xì)胞，嵌入DNA使之發(fā)出橙紅色熒光?；旌鲜褂脙煞N染料時(shí)，正?；罴?xì)胞的核染色質(zhì)著綠色，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；早期凋亡細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞呈黃綠色；晚期凋亡細(xì)胞，核染色質(zhì)發(fā)桔紅色熒光。0 mmol·L-1組無(wú)明顯的凋亡細(xì)胞，細(xì)胞染色為綠色；低濃度組可見少量早期凋亡細(xì)胞，細(xì)胞染色為呈黃綠色熒光；隨著甲酸濃度的增加，晚期凋亡細(xì)胞均增多，細(xì)胞染色呈桔紅色。見圖3。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

Annexin V-FITC/PI 雙染檢測(cè)PC12 細(xì)胞凋亡情況，不同類型凋亡率（早期、晚期、總凋亡率）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），均隨濃度的增加而增加，且8.32、12.48 和16.64 mmol·L-1濃度組與0 mmol·L-1濃度組比較三種類型凋亡率均升高（P均＜0.05）；12.48、16.64 mmol·L-1濃度組三種類型凋亡率均高于8.32 mmol·L-1組（P均＜0.05）；16.64 mmol·L-1組三種類型凋亡率高于12.48 mmol·L-1組（P＜0.05）。見圖4、表1。

表1 不同濃度甲酸干預(yù)PC12 細(xì)胞24 h 后細(xì)胞凋亡比較

2.4 MDC 染色觀察熒光強(qiáng)度

在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組可見極少量的藍(lán)色熒光，隨著甲酸濃度的增高，藍(lán)色熒光增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。8.32 mmol·L-1組與0 mmol·L-1組相比，熒光強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義（P ＞0.05）；12.48、16.64 mmol·L-1組與0 mmol·L-1組相比，熒光強(qiáng)度均增高（P均＜0.05）。見圖5、表2。

表2 MDC 染色甲酸染毒PC12 細(xì)胞后熒光強(qiáng)度變化

2.5 甲酸致PC12 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1、P62 表達(dá)情況的變化

結(jié)果表明，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1 相對(duì)表達(dá)量隨著濃度的增加而增高，而P62 蛋白相對(duì)表達(dá)量逐漸降低（P均＜0.01）。8.32 mmol·L-1組與0 mmol·L-1組相比，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），12.48、16.64 mmol·L-1組與0 mmol·L-1組相比，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)量增高（P均＜0.01）；與0 mmol·L-1組相比，8.32、12.48、16.64 mmol·L-1組Beclin-1蛋白表達(dá)量均增高（P均＜0.01）；12.48、16.64 mmol·L-1組與0 mmol·L-1組相比，P62 蛋白表達(dá)量均降低（P均＜0.05）。見圖6、表3。

表3 甲酸染毒PC12 細(xì)胞后自噬相關(guān)蛋白灰度分析情況

3 討論

有報(bào)道表明[11-12]，各種有害因素引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷與細(xì)胞凋亡相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)甲酸是否能夠誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞凋亡展開研究。采用CCK-8 方法檢測(cè)不同濃度甲酸干預(yù)不同時(shí)間PC12 細(xì)胞后其細(xì)胞活力改變，結(jié)果表明隨著甲酸濃度和時(shí)間增加，PC12 細(xì)胞的活力逐漸降低，有明顯的濃度和時(shí)間依賴性，說(shuō)明甲酸具有細(xì)胞毒性作用，對(duì)PC12 細(xì)胞的活力有抑制作用。細(xì)胞凋亡是一種常見的細(xì)胞死亡方式，許多不同的神經(jīng)病理狀態(tài)都與細(xì)胞凋亡有關(guān)[13-14]。本研究采用AO/EB 染色可見，不同濃度甲酸染毒引起PC12 細(xì)胞呈凋亡特征性形態(tài)，進(jìn)一步利用Annexin VFITC/PI 雙染來(lái)定量檢測(cè)甲酸暴露細(xì)胞的凋亡率，發(fā)現(xiàn)早期、晚期、總凋亡率均隨甲酸濃度的增加而升高，與孫凌聰?shù)萚15]研究結(jié)果一致，說(shuō)明甲酸暴露能引起PC12 細(xì)胞損傷，且這種損傷作用可能與其誘發(fā)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。

自噬是負(fù)責(zé)清除蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的細(xì)胞途徑，因此一定程度的自噬對(duì)于維持正常的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)是必要的[16]。很多外源性化合物能夠誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[17-18]。自噬是否參與甲酸致神經(jīng)細(xì)胞毒性需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞自噬情況進(jìn)行檢測(cè)。MDC 陽(yáng)性囊泡積累對(duì)自噬誘導(dǎo)做出反應(yīng)[19-20]，本研究通過(guò)熒光顯微鏡對(duì)PC12 細(xì)胞自噬進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組可見極少量的藍(lán)色熒光，隨著甲酸濃度的增高，藍(lán)色熒光增多，提示甲酸干預(yù)的PC12 細(xì)胞自噬囊泡形成逐漸增加，自噬水平有明顯的濃度依賴性。因此我們進(jìn)一步用Western blot 檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同濃度甲酸染毒PC12 細(xì)胞24 h 后，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1 相對(duì)表達(dá)量逐漸增高，而P62 蛋白相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，自噬水平隨之升高，結(jié)果與鉛中毒[21]引起自噬相關(guān)蛋白的結(jié)果一致，分析原因可能為當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，胞漿型LC3Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば蚅C3Ⅱ，所以，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ與自噬體數(shù)量成正相關(guān)[22]。Beclin-1 是Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶（PtdIns3K）復(fù)合物的關(guān)鍵成分[23]，也是自噬體形成的必須蛋白，Beclin1表達(dá)上升則提示發(fā)生自噬[24]。P62 蛋白與神經(jīng)遞質(zhì)性疾病相關(guān)，P62 蛋白能夠把目標(biāo)蛋白運(yùn)送到自噬體內(nèi)使其發(fā)生自噬性降解，P62 蛋白的表達(dá)量與自噬流強(qiáng)弱成負(fù)相關(guān)[25]。

綜上，甲酸可通過(guò)引起細(xì)胞凋亡產(chǎn)生神經(jīng)損傷，也可引起神經(jīng)細(xì)胞自噬發(fā)生，但其中自噬與凋亡是否有關(guān)聯(lián)，以及具體的關(guān)系尚不明確，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可加入相應(yīng)的抑制劑來(lái)進(jìn)一步深入探討。