河源市新生兒α-珠蛋白生成障礙性貧血篩查及基因型分析*

劉運(yùn)華，劉曉燕，張 旻，李登峰，曾慶林

廣東省河源市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳實(shí)驗(yàn)室，廣東河源 517000

珠蛋白生成障礙性貧血是由一種或多種珠蛋白肽鏈合成受阻或抑制，導(dǎo)致血紅蛋白(Hb)組分異常，從而引起的溶血性貧血，是一種遺傳性溶血性疾病[1]。依肽鏈合成缺陷的差異，把珠蛋白生成障礙性貧血分為α、β、γ及δ 4種類型，α與β是主要的2種類型。不同國(guó)家發(fā)病率大約在1%～10%，在地中海地區(qū)的某些國(guó)家發(fā)病率高達(dá)10%[2]。我國(guó)長(zhǎng)江以南大部分地區(qū)，尤其是廣東、廣西及海南地區(qū)是α-珠蛋白生成障礙性貧血的高發(fā)區(qū)[3]。依臨床癥狀的差異將α-珠蛋白生成障礙性貧血?jiǎng)澐譃橹?、中、輕及靜止4種類型。中重度α-珠蛋白生成障礙性貧血嬰兒的出生給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。由于此類疾病無(wú)有效的治療方法，產(chǎn)前篩查與診斷是有效阻止此類重型疾病胎兒出生的有效手段[4]，故開展α-珠蛋白生成障礙性貧血普遍篩查對(duì)預(yù)防出生缺陷有較好的臨床價(jià)值。檢測(cè)新生兒期Hb Bart′s水平可作為α-珠蛋白生成障礙性貧血篩查和臨床早期診斷的敏感指標(biāo)[5-6]。2015年3月起，河源市新生兒疾病篩查中心開始篩查新生兒珠蛋白生成障礙性貧血。為分析河源市新生兒α-珠蛋白生成障礙性貧血篩查結(jié)果與Hb Bart′s篩查α-珠蛋白生成障礙性貧血的臨床價(jià)值，探索本地區(qū)新生兒α-珠蛋白生成障礙性貧血基因型分布特征，本研究對(duì)2015年3月至2019年10月的新生兒α-珠蛋白生成障礙性貧血的篩查結(jié)果與基因型分布特征進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 篩查標(biāo)本為2015年3月至2019年10月來(lái)自河源市五縣二區(qū)的新生兒足跟血干血斑，共160 370例，其中男84 983例，女74 293例，性別未知1 094例。202例隨機(jī)對(duì)照標(biāo)本為來(lái)自全市五縣二區(qū)的新生兒足跟血干血斑，新生兒中男119例，女83例；篩查與基因診斷均分兩批次與常規(guī)標(biāo)本一起進(jìn)行試驗(yàn)。在知情同意條件下，嚴(yán)格遵循采血流程，于分娩后72～168 h采集新生兒足跟血3～4滴，將黃豆般大小的血滴在不接觸皮膚情況下慢慢滲過(guò)濾紙片；標(biāo)本要求直徑≥8 mm，避免在紫外線或太陽(yáng)照射的條件下晾干3～4 h后，密封保存于4 ℃冰箱。標(biāo)本用快遞寄送至本中心，收到標(biāo)本后5個(gè)工作日內(nèi)采用全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行篩查，及時(shí)召回初篩陽(yáng)性個(gè)體檢測(cè)珠蛋白生成障礙性貧血基因。

1.2儀器與試劑 全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀Capillarys2與進(jìn)口配套Hb電泳試劑盒(含溶血素、沖洗液、緩沖液等)均購(gòu)自法國(guó)Sebia公司；DNA自動(dòng)提取儀Lab-Aid 824及配套試劑盒購(gòu)自廈門致善公司；PCR擴(kuò)增儀與電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；分子雜交儀ZWY-200D購(gòu)自上海智城公司；珠蛋白生成障礙性貧血基因診斷試劑盒與耗材購(gòu)自深圳亞能公司。

1.3方法

1.3.1Hb電泳 每例標(biāo)本打下1個(gè)直徑為3.5 mm干血斑放入樣品杯，用移液器加純凈水50 μL每杯，封好樣品杯并移進(jìn)濕盒，于4 ℃冰箱浸泡2 h以上或過(guò)夜，充分洗脫干血斑中紅細(xì)胞，以待上機(jī)電泳。運(yùn)用全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行檢測(cè)，操作步驟如下：讀取樣品架條形碼、溶血素稀釋標(biāo)本、清洗樣品針、清洗毛細(xì)管、標(biāo)本注入毛細(xì)管、電泳、分析各Hb成分的濃度，含正常HbF、HbA和Hb變異體(S、C、E、D與Hb Bart′s)，HbA2帶和部分Hb Bart′s帶由人工判讀。

1.3.2基因檢測(cè) 及時(shí)召回篩查陽(yáng)性新生兒(檢出Hb Bart′s帶)重新采血，檢測(cè)珠蛋白生成障礙性貧血基因；(--SEA、-α4.2、-α3.7)等缺失突變與αT(CS、QS、WS)3種點(diǎn)突變及17種β-珠蛋白生成障礙性貧血基因[CD41-42(-TTCT)、CD43(G>T)、IVS-Ⅱ-654(C>T)、-29(A>G)、-28(A>G)、CD 71-72(+A)、CD17(A>T)、CD26(G>A)、-30(T>C)、-32(C>A)、CAP(-AAAC)、Int(T>G)、CD14-15(+G)、CD27/28(+C)、CD31(-C)、IVS-Ⅰ-1(G>T)、IVS-Ⅰ-5(G>C)]，分別運(yùn)用跨越斷裂點(diǎn)聚合酶鏈反應(yīng)與反向斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)。

1.3.3質(zhì)量控制 室內(nèi)質(zhì)量控制：(1)Hb電泳，每批次試驗(yàn)均有第三方質(zhì)控物，與普通標(biāo)本一樣的操作流程。(2)基因檢測(cè)，每批次試驗(yàn)均進(jìn)行空白對(duì)照、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照(包括主要的缺失或突變類型)；Hb電泳與基因檢測(cè)的分析前、中、后均嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行。室間質(zhì)評(píng)：珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)參加廣東省臨床檢驗(yàn)中心與國(guó)家臨床檢驗(yàn)中心的室間質(zhì)評(píng)，均滿分通過(guò)。

1.3.4結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn) α-珠蛋白生成障礙性貧血初篩陽(yáng)性判讀標(biāo)準(zhǔn)：如果電泳結(jié)果讀到Hb Bart′s帶，就可判讀為α-珠蛋白生成障礙性貧血初篩陽(yáng)性?；蛟\斷判讀標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)試劑廠家提供的判讀標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1篩查與基因檢測(cè)結(jié)果 篩查160 370例標(biāo)本，檢出Hb Bart′s帶標(biāo)本16 804例，篩查陽(yáng)性率為10.48%。召回本院分娩的1 348例α-珠蛋白生成障礙性貧血初篩陽(yáng)性新生兒，確診α-珠蛋白生成障礙性貧血患兒1 271例，診斷符合率為94.29%。共檢出基因型別27種，靜止型5種，標(biāo)準(zhǔn)型5種，中間型5種，α合并β-珠蛋白生成障礙性貧血12種。1 271例α-珠蛋白生成障礙性貧血新生兒中，靜止型占27.93%(355/1 271)，基因型以-α3.7/αα與-α4.2/αα為主；標(biāo)準(zhǔn)型占67.82%(862/1 271)，基因型以--SEA/αα為主；中間型占2.05%(26/1 271)，基因型以--SEA/-α3.7為主；α合并β珠蛋白生成障礙性貧血占2.20%(28/1 271)，基因型以(--SEA/αα)/(βCD41-42/βN)和(--SEA/αα)/(βIVS-Ⅱ-654/βN)為主。見(jiàn)表1。

2.2Hb Bart′s水平與臨床表型的關(guān)系 α-珠蛋白生成障礙性貧血靜止型355例，Hb Bart′s水平為0.34±0.11，標(biāo)準(zhǔn)型862例，Hb Bart′s水平為2.08±0.78，中間型26例，Hb Bart′s水平為10.60±3.37，Hb Bart′s水平隨臨床表型的加重而逐步增高，3種臨床表型Hb Bart′s水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2 145，P<0.05)。

表1 篩查與基因檢測(cè)結(jié)果

2.3202例新生兒足跟血四格表分析結(jié)果 隨機(jī)同時(shí)檢測(cè)202例標(biāo)本的Hb Bart′s水平、3種缺失突變和3種非缺失突變的α-珠蛋白生成障礙性貧血基因。陽(yáng)性符合率為91.89%，95%置信區(qū)間為78.70%～97.21%；陰性符合率為99.39%，95%置信區(qū)間為96.65%～99.89%；總符合率為98.02%，95%置信區(qū)間為95.02%～99.23%。另外，未檢出Hb Bart′s帶167例(確診2例-α3.7/αα、1例αWSα/αα珠蛋白生成障礙性貧血)。見(jiàn)表2。

表2 202例新生兒足跟血四格表分析結(jié)果(n)

3 討 論

缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血以--SEA/αα、-α4.2/αα和-α3.7/αα 3種基因型較為普遍。常見(jiàn)非缺失型突變?chǔ)?珠蛋白生成障礙性貧血有HbCS、HbQS與HbWS，是發(fā)生在α2-珠蛋白基因或其調(diào)節(jié)序列上的點(diǎn)突變，影響mRNA的加工、翻譯及翻譯后肽鏈穩(wěn)定性等過(guò)程[7-9]。珠蛋白生成障礙性貧血是目前世界上發(fā)病率最高的單基因遺傳病，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界約有18億人攜帶珠蛋白生成障礙性貧血基因，每年約有20萬(wàn)以上各類重癥珠蛋白生成障礙性貧血新生兒出生[10]。

廣東省的珠蛋白生成障礙性貧血攜帶率僅次于廣西壯族自治區(qū)，主要類型是α-珠蛋白生成障礙性貧血、β-珠蛋白生成障礙性貧血[3]。因此，普遍開展人群α-珠蛋白生成障礙性貧血篩查對(duì)廣東省出生缺陷防控項(xiàng)目有重大戰(zhàn)略意義。目前，能最終診斷α-珠蛋白生成障礙性貧血的試驗(yàn)依據(jù)是分子水平的基因檢測(cè)，但其成本及技術(shù)要求相對(duì)較高，致使其不能成為α-珠蛋白生成障礙性貧血普遍篩查的常規(guī)方法。臨床上用于α-珠蛋白生成障礙性貧血篩查的常規(guī)技術(shù)有血常規(guī)檢查聯(lián)合紅細(xì)胞脆性試驗(yàn)、Hb電泳法、高效液相色譜法。因血常規(guī)檢查聯(lián)合紅細(xì)胞脆性試驗(yàn)篩查α-珠蛋白生成障礙性貧血有較高的漏檢率，所以不可單獨(dú)運(yùn)用。同時(shí)，技術(shù)要求高、干擾因素較多及成本高的高效液相色譜法也不能開展普遍篩查。故當(dāng)前國(guó)內(nèi)運(yùn)用于α-珠蛋白生成障礙性貧血篩查最常見(jiàn)的方法是Hb電泳。Hb電泳主要有瓊脂糖Hb電泳和毛細(xì)管Hb電泳，因?yàn)槊?xì)管Hb電泳方法更有優(yōu)勢(shì)[5]，大部分新生兒篩查中心實(shí)驗(yàn)室采用毛細(xì)管電泳技術(shù)篩查α-珠蛋白生成障礙性貧血。

α-珠蛋白生成障礙性貧血的產(chǎn)生機(jī)制是α-珠蛋白基因缺失或點(diǎn)突變?cè)斐搔?珠蛋白鏈合成減少，導(dǎo)致非α鏈相對(duì)過(guò)剩而形成四聚體；新生兒期γ鏈形成四聚體，Hb電泳結(jié)果即表現(xiàn)為Hb Bart′s帶[11]。在新生兒期，利用臍血Hb電泳、Bart′s定量測(cè)定技術(shù)篩查α-珠蛋白生成障礙性貧血，其結(jié)果與基因檢測(cè)結(jié)果診斷符合率為91.8%；兒童及成人期，利用靜脈血Hb電泳、HbA2定量技術(shù)篩查α-珠蛋白生成障礙性貧血，診斷符合率為75.1%[5]。目前，運(yùn)用毛細(xì)管Hb電泳技術(shù)篩查新生兒α-珠蛋白生成障礙性貧血的報(bào)道中，大部分是采集臍血作為標(biāo)本進(jìn)行電泳。與臍血比較，新生兒出生后3～7 d采集足根血干血斑篩查α-珠蛋白生成障礙性貧血更有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)楦裳邩?biāo)本方便各合作單位的寄送，又可永久儲(chǔ)存，更有利于該技術(shù)的管理與全面推廣。

本研究中，篩查與基因診斷符合率為94.29%，稍高于葉立新等[5]、黃金芬等[10]、陳小蘭等[12]報(bào)道的診斷符合率，表明運(yùn)用全自動(dòng)毛細(xì)管電泳技術(shù)篩查新生兒α-珠蛋白生成障礙性貧血可滿足臨床需求。隨機(jī)同時(shí)檢測(cè)Hb Bart′s水平與珠蛋白生成障礙性貧血基因的202例的對(duì)照標(biāo)本中，篩查與珠蛋白生成障礙性貧血基因診斷符合率為91.89%，低于上述的94.29%，可能是隨機(jī)對(duì)照標(biāo)本部分篩查陽(yáng)性新生兒屬于稀有型珠蛋白生成障礙性貧血，不在所用試劑的檢測(cè)范圍內(nèi)，也可能是Hb Bart′s水平與基因檢測(cè)符合率有差異的原因；也不排除操作誤差引起。未檢出Hb Bart′s帶的標(biāo)本167例(確診2例-α3.7/αα、1例αWSα/αα珠蛋白生成障礙性貧血)，結(jié)果表明該技術(shù)無(wú)法檢出少部分靜止型α-珠蛋白生成障礙性貧血，與WU等[13]提出的Hb Bart′s帶不能作為新生兒-α3.7/αα型珠蛋白生成障礙性貧血的篩選方法觀點(diǎn)相符；但與ALAUDDIN等[14]報(bào)道的利用毛細(xì)管電泳系統(tǒng)分析Hb Bart′s方法可以篩選新生兒非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血稍有差異。

本研究提示，依據(jù)Hb Bart′s水平可初步判斷α-珠蛋白生成障礙性貧血分型，確診1 271例α-珠蛋白生成障礙性貧血中，有402例Hb Bart′s水平在0%～<1%，靜止型343例(85.32%)；844例Hb Bart′s水平在1%～<5%，標(biāo)準(zhǔn)型810例(95.97%)；25例Hb Bart′s水平>5%，中間型(HbH病)24例(96.00%)。因沒(méi)有篩查出重型α-珠蛋白生成障礙性貧血個(gè)體，無(wú)法討論重型α-珠蛋白生成障礙性貧血Hb Bart′s的水平。

本研究檢出的基因型別27種，排在前3名基因型依次是--SEA/αα、-α3.7/αα與-α4.2/αα，此基因分布特點(diǎn)與相關(guān)研究的地區(qū)報(bào)道的α-珠蛋白生成障礙性貧血主要基因型別是一致的[15-18]，與本地區(qū)作者胡莉莉等[19]、劉平等[20]報(bào)道的α-珠蛋白生成障礙性貧血主要基因型別相同。

綜上所述，運(yùn)用干血斑毛細(xì)管電泳技術(shù)篩查新生兒α-珠蛋白生成障礙性貧血有較高的診斷符合率，可在早期發(fā)現(xiàn)α-珠蛋白生成障礙性貧血。本研究闡明了河源地區(qū)α-珠蛋白生成障礙性貧血基因分布特征，以此制訂珠蛋白生成障礙性貧血防控策略，做好相關(guān)遺傳咨詢與宣傳工作，可指導(dǎo)廣大適婚人群進(jìn)行合理婚育，提高新生兒出生質(zhì)量。