貝母組織培養(yǎng)研究進展

高素芳 張延紅 何春雨 陳紅剛

摘要：根據(jù)相關(guān)文獻，對我國貝母組織培養(yǎng)技術(shù)相關(guān)研究的進展進行了歸納總結(jié)，從組織培養(yǎng)的材料消毒、外植體類型與大小、培養(yǎng)基、激素、溫度、光照等方面進行了闡述，并對其工廠化育苗中存在的問題進行了分析。

關(guān)鍵詞：貝母;組織培養(yǎng);影響因素;工廠化育苗

中圖分類號：S567.23? ? ?文獻標(biāo)志碼：A? ? ?文章編號：1001-1463（2021）12-0081-08

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2021.12.019

Research Progress of Tissue Culture of Fritillaria

GAO Sufang， ZHANG Yanhong， HE Chunyu， CHEN Honggang

（Department of Pharmacy， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou Gansu 730000， China）

Abstract：By referring to the literature of Fritillaria tissue culture， the tissue culture technology of Fritillaria in China was systematically summarized. In this paper， the material disinfection， the type and size of explants， the medium， hormones， temperature and light were discussed， and the existing problems in the rapid propagation of Fritillaria industrial seedling were analyzed.

Key words：Fritillaria;Tissue culture;Influence factors;Industrial breeding

中藥貝母是百合科多年生草本植物的干燥鱗莖，具有止咳、平喘的功效，是我國常用名貴中藥材之一。藥用川貝母的原植物有百合科植物川貝母（Fritillaria cirrhosa D. Don）、暗紫貝母（F. unibracteata Hsiao et K. C. Hsia）、甘肅貝母（F. Przewalskii Maxim.）或梭砂貝母（F. delarayi Franch.）、太白貝母（F. taipaiensis P. Y. Li）或瓦布貝母[F. unibracteata Hsiaoetet K. C. Hsia var. wabuensis（S. Y. Tang et S. C. Yue） Z. D. Liu，S. Wang et S.C. Chen];藥用平貝為同科植物平貝母（F. ussuriensis Maxim.）;藥用伊貝母包括同科植物新疆貝母（F. walujewii Rege1）和伊犁貝母（F. pallidiflora Schrenk）;藥用浙貝母為同科植物浙貝母（F. Thunbergii Miq.） [1 ]。貝母屬植物多生于高寒地帶，生長緩慢，產(chǎn)量低。近年來野生貝母生境遭到破壞，人工栽培貝母以種子繁殖時所需年限較長且萌發(fā)率低，以鱗莖繁殖雖1～2 a即可采收，但繁殖系數(shù)低，導(dǎo)致供不應(yīng)求，價格昂貴[2 ]。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)可在短期內(nèi)獲得大量性狀一致的優(yōu)良種苗，有望解決人工種植貝母生長周期長、繁殖系數(shù)低的問題。我國學(xué)者雖然開展了大量有關(guān)貝母組織培養(yǎng)的研究，但工作缺乏系統(tǒng)性和連續(xù)性，至今貝母組織培養(yǎng)工廠化育苗仍未實現(xiàn)。我們就影響貝母組織培養(yǎng)的因素做了分析歸納和總結(jié)，以期進一步推動貝母組培育苗和資源開發(fā)利用研究。

1? ?外植體的取材部位與時間

外植體生理年齡的差異以及取材部位不同都會顯著影響貝母組織培養(yǎng)的誘導(dǎo)率與生長速率，故在組織培養(yǎng)中外植體的取材時間與類型十分重要。貝母組織培養(yǎng)的取材部位有鱗莖、根、莖、葉等，絕大多數(shù)研究者以鱗莖為外植體，而且認為是最佳的外植體;其次為莖段，取材時間涉及生根期、出苗期、開花期、果熟期[3 - 12 ]。在湖北貝母、西藏卷葉貝母、浙貝母的研究中均發(fā)現(xiàn)以出苗期為取材時間效果最佳[13 - 15 ]，也有研究認為開花期也是最佳的取材時間，開花期僅次于苗期。衷維綱等[16 ]在對太白貝母的組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，采集鱗莖的時間與鱗莖再生的頻率及數(shù)量密切相關(guān)，小鱗莖誘導(dǎo)率出苗盛期 > 開花盛期 > 生根期，果熟期基本喪失器官再生能力，這與對浙貝母的研究一致。郭生楨等[17 ]于貝母開花期取鱗莖、葉、莖節(jié)間、莖為外植體，幼鱗莖的誘導(dǎo)率高達93.7%，其他外植體的誘導(dǎo)率均小于4%。王躍華等[3 ]以川貝母鱗片葉、葉、針形幼苗、莖段為外植體，小鱗莖的誘導(dǎo)率依次為70.5%、32%、21%、0，而且開花期和果實期的外植體明顯較苗期外植體產(chǎn)生的再生小鱗莖數(shù)目多，生長速度快。甘肅貝母鱗莖培養(yǎng)時鱗瓣越大、厚度越厚、比重越大誘導(dǎo)率越高，可能是由于厚鱗瓣貯藏了更多的營養(yǎng)物質(zhì)，生理代謝旺盛所致[10 ]。在對暗紫貝母的研究中發(fā)現(xiàn)，以鱗莖基部為取材部位誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)率高于其他部位[12 ]，在同科植物百合的組織培養(yǎng)中較厚的鱗片和鱗莖基部誘導(dǎo)效果也比薄鱗片和中上部的鱗片好[18 ]。

貝母組織培養(yǎng)除使用鱗莖之外還有一些其他取材部位的誘導(dǎo)效果也較好。伊貝母鱗莖萌發(fā)產(chǎn)生的幼莖可用于誘導(dǎo)小鱗莖直接發(fā)生，小鱗莖誘導(dǎo)率高達91%，這與徐元紅等[19 ]、王小菁等[20 ]的研究相似。許矛[21 ]在平貝母組織培養(yǎng)中以莖段為外植體取得了80.9%的愈傷誘導(dǎo)率。在浙貝母組培中發(fā)現(xiàn)，莖段的誘導(dǎo)率僅次于鱗莖。因此，莖段也是可用于貝母組織培養(yǎng)的一種較好的外植體，與鱗莖相比較，生長于地上的莖段比生長于地下的鱗莖容易滅菌。以浙貝母取帶花蕾的花梗作試驗材料，接種的子房可直接誘導(dǎo)產(chǎn)生小鱗莖[22 ];以浙貝母種胚為外植體，可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織并進一步分化出小鱗莖[23 ]。我們收集了一些以鱗莖為取材部位再生小鱗莖或者植株的試驗方法（表1）。 2? ?外植體滅菌

外植體的滅菌方法是否得當(dāng)，決定了材料能否建立起無菌培養(yǎng)體系，是開展組織培養(yǎng)工作的前提條件。貝母組織培養(yǎng)最常用的外植體為鱗莖，但由于其特殊的結(jié)構(gòu)以及生長于地下，鱗莖表面攜帶了大量微生物，因此滅菌的難度高于其他部位，材料污染率高，這也是阻礙貝母組織培養(yǎng)廣泛開展的重要原因之一。

貝母鱗莖種類不同，生長年限和產(chǎn)地來源不同，滅菌的難易程度都有差異。因此，必須先要進行外植體滅菌試驗。大多研究者采用的滅菌方法為：洗衣粉或清水洗干凈，用70%～75%酒精漂洗20～60 s，再用0.1%～0.2% HgCl2滅菌8～20 min，最后用無菌水沖洗3～5次。張振霞等[10 ]以暗紫貝母鱗莖為試材采用該滅菌方法，污染率僅為7.5%，且生長狀態(tài)好，但一些試驗中的污染率還是偏高[10 ]。如果采用上述方法滅菌效果不佳，可采用多次滅菌法或多種藥劑交替滅菌或多次滅菌法。例如，在甘肅貝母鱗莖滅菌時先用70%乙醇浸泡15 s，然后用0.1% HgCl2浸泡10 min，再用無菌水沖洗5次，4 ℃冷藏過夜，第2天重復(fù)上述滅菌步驟，可以取得較好的滅菌效果[12 ]。伊貝母鱗莖滅菌時先用75%乙醇浸泡，之后無菌水沖洗3次，然后用0.8% NaClO滅菌8 min，無菌水沖洗3次，再用2% NaClO浸泡6 min，無菌水沖洗3次，污染率僅為3.8%，且鱗莖生長狀態(tài)良好[11 ]。

3? ?培養(yǎng)基

MS培養(yǎng)基元素種類豐富，元素平衡，緩沖性能好，微量元素和有機成分齊全且較豐富。貝母組織培養(yǎng)研究中所采用的培養(yǎng)基有多種，其中鱗莖培養(yǎng)以MS為佳且具有普遍適用性，生根時多采用1/2 MS作基本培養(yǎng)基。衷維綱等[16 ]在對太白貝母的研究中發(fā)現(xiàn)，LS和White培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果不如MS，不加激素的MS就能使鱗莖切片產(chǎn)生小鱗莖，但形成的時間晚，數(shù)量少，個頭小。愈傷組織分化時，可以選用不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以實現(xiàn)不同的分化方向。有報道稱MS培養(yǎng)基有利于不定芽的形成，N6培養(yǎng)基有利于體細胞胚的形成[7 ]。

為建立更好的貝母組織培養(yǎng)快繁系統(tǒng)，我國學(xué)者對MS培養(yǎng)基做出了一定的調(diào)整，發(fā)現(xiàn)有利于彭澤貝母愈傷組織生長的N、P、K、Ca最佳濃度分別為MS培養(yǎng)基的1/4、1、1/4、1/2倍，調(diào)整后的培養(yǎng)基上生長的愈傷組織生長率高出MS培養(yǎng)基20.26%[24 ]。在平貝母組織培養(yǎng)研究中以鱗莖為外植體，采用MS液體培養(yǎng)基（KH2PO4的用量調(diào)整為250 mg/L，VB1 5 mg/L）添加NAA和KT，可直接誘導(dǎo)產(chǎn)生小鱗莖，在液體培養(yǎng)基中無論是鱗莖生長速率還是小鱗莖的誘導(dǎo)率都顯著高于固體培養(yǎng)基[25 ]。也有研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加酪氨酸后暗紫貝母鱗莖的生長率明顯提高[26 ]。

4? ?植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)

在植物組織培養(yǎng)中，植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)雖然用量極少，但作用巨大，在外植體脫分化和器官發(fā)生時起到關(guān)鍵性甚至是決定性的作用。植物種類和外植體、外植體的年齡和取材季節(jié)以及植株再生途徑不同，培養(yǎng)時所需的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類、濃度和配比有所不同。絕大多數(shù)研究資料表明，細胞分裂素和生長素配比使用能取得較好的誘導(dǎo)和培養(yǎng)效果。在對浙貝母的研究中發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基上不加任何激素時無法誘導(dǎo)產(chǎn)生小鱗莖或愈傷組織，在只加入2，4-D、KT、NAA其中一種時即可誘導(dǎo)出小鱗莖或愈傷組織，但誘導(dǎo)率顯著低于兩種激素配合使用[15 ]，這與對暗紫貝母、康定貝母的研究結(jié)果相符[6， 8 ]。太白貝母組織培養(yǎng)中只加KT未能提高誘導(dǎo)率，同時添加NAA（0.5～2 mg/L）后產(chǎn)生的鱗莖多且大，但濃度太高時誘導(dǎo)率反而有所下降[16 ]。

貝母通過組織培養(yǎng)再生植株有直接發(fā)生途徑和間接發(fā)生途徑兩種形式，再生途徑不同所需的激素種類和濃度有所不同。在間接發(fā)生途徑中，通常使用0.5～2.0 mg/L NAA和1.0～4.0 mg/L6-BA或0.5～2.0 mg/L NAA和0.5～2.0 mg/L KT配合誘導(dǎo)愈傷組織，有時也配合使用2，4-D。湖北貝母鱗瓣誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織最佳激素組為2.0 mg/L NAA+ 1.0 mg/L 6-BA，誘導(dǎo)率為80%[27 ];梭砂貝母鱗瓣誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織最佳激素組為0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA[28 ];康定貝母鱗瓣誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織最佳激素組為NAA 3.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L，誘導(dǎo)率88.6%[8 ];暗紫貝母鱗瓣誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織最佳激素組為0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA，誘導(dǎo)率為80.0%[6 ];伊貝母鱗瓣誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織最佳激素組為0.5 mg/LNAA+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L GA3，誘導(dǎo)率100%[29 ];卷葉貝母種子在10 mg/L GA3溶液中浸泡48 h后再解剖種胚誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織最佳激素組為0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA，誘導(dǎo)率為95%[30 ]。浙貝母鱗瓣誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織或小鱗莖最佳激素組為1.0 mg/L NAA+2.0 mg/L 2，4-D，誘導(dǎo)率為60.8%[15 ]。

直接發(fā)生途徑中通常使用到NAA、6-BA、ZT、KT等。其中KT和NAA，KT和IAA，BA和NAA配比使用效果好。浙貝母子房誘導(dǎo)小鱗莖直接發(fā)生的最佳激素配比為0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L KT，這與伊貝母莖段的研究結(jié)果類似[19， 22 ]。在平貝母組織培養(yǎng)中，以葉片為外植體，在MS+0.5 mg/L IAA+0.5 mg/L KT培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)直接形成小鱗莖[31 ]。伊貝母黃化莖段誘導(dǎo)小鱗莖的最佳激素配比為0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA，誘導(dǎo)率為100%[20 ];卷葉貝母鱗瓣誘導(dǎo)小鱗莖的最佳激素組為0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA，誘導(dǎo)率85%[32 ]，這與對川貝母的研究相一致[3 ]。卷葉貝母試管苗幼葉誘導(dǎo)小鱗莖的最佳激素組合為1.0 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT，誘導(dǎo)率高達83.37%[32 ]。浙貝母鱗瓣誘導(dǎo)小鱗莖的最佳激素組為1.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT [33 ]。

5? ?碳源

碳源是培養(yǎng)基的必要成分之一，有提供能源和調(diào)節(jié)滲透壓的作用，通常選用蔗糖，在貝母組織培養(yǎng)中廣泛使用的濃度為3%～5%。有研究認為糖有利于小鱗莖形成，在暗紫貝母和平貝母的研究中發(fā)現(xiàn)，5%的蔗糖濃度更為合適貝母鱗莖的生長和生物堿的累積[26，34 ];5%的蔗糖濃度有利于暗紫貝母鱗瓣分化不定芽[35 ]，4%的蔗糖濃度對平貝母愈傷組織的生長和生物堿積累效果好[35 ]，可能是由于在貝母組織培養(yǎng)的不同階段所消耗的蔗糖多少不同。

6? ?溫度和光照

通常組織培養(yǎng)適宜溫度為23～28 ℃，但野生貝母生長在高海拔、低氣溫的山區(qū)，其組織培養(yǎng)適宜溫度較其他植物低。在浙貝母組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，10～25 ℃都可以誘導(dǎo)出小鱗莖及愈傷組織，誘導(dǎo)率最高達78.6%，其最適溫度為20±1 ℃[15 ]。對湖北貝母、甘肅貝母、暗紫貝母、伊貝母的研究中也有類似的結(jié)果[26 - 27， 36 - 37]。甘肅貝母芽的誘導(dǎo)率培養(yǎng)溫度為20 ℃>15 ℃>25 ℃>10 ℃，繼代增殖時也表現(xiàn)出此規(guī)律，培養(yǎng)條件為黑暗>12 h光照>24 h光照[36 ]。浙貝母鱗莖培養(yǎng)時采用21～23 ℃、光照9～10 h，培養(yǎng)效果較好[15 ]。浙貝母子房在10～18 ℃光照培養(yǎng)下可直接長出小鱗莖[15 ]。以平貝母鱗片為試材，16～20 ℃散射光條件下可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷[15 ]。太白貝母鱗莖培養(yǎng)時，黑暗和每日8～10 h光照的培養(yǎng)效果無明顯差異[15 ]。目前的研究表明，20 ℃培養(yǎng)溫度，黑暗、散射光或400～1 800 lx的光照條件均可誘導(dǎo)小鱗莖或愈傷產(chǎn)生。

具有鱗莖或者球莖的植物，比如唐菖蒲、麝香百合，通過組織培養(yǎng)獲得再生植株或者愈傷組織再生器官時均需要經(jīng)過一定的低溫處理才可以在移栽后正常生長，貝母也有這一特性[38 ]。再生的浙貝母小鱗莖需要5 ℃低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)30 d以上，之后轉(zhuǎn)至正常溫度光照條件后方可再生植株[15 ];伊貝母小鱗莖需在0～5 ℃低溫貯藏80 d后，鱗莖100%長根并抽出黃化芽，照光后轉(zhuǎn)綠成苗[9 ]，對平貝母和太白貝母的研究也有類似報道[16， 21 ]。川貝母胚狀體在經(jīng)低溫處理40 d后成苗率最高[39 ]。

7? ?試管苗移栽

試管苗移栽是離體快速繁殖的最后環(huán)節(jié)，是試管苗能否走向大田的關(guān)鍵。能移栽到大田的貝母組織培養(yǎng)產(chǎn)物分為兩類，一是小鱗莖，二是試管苗，它們都需要適合的馴化移栽方案。浙貝母試管苗過程為3 000 lx光照培養(yǎng)7 d→開瓶煉苗2～3 d→洗凈根系培養(yǎng)基→移入裝有土和沙按體積比為3∶1比例混合制成栽培土的小花盆中，并上蓋玻璃罩。當(dāng)試管苗移栽后個體間生長差異大、發(fā)育不良時，補充澆灌1/2 MS營養(yǎng)液，馴化后的小苗與大田栽培的小苗差異不大，成活率能達80.6%[40 ]。西藏卷葉貝母試管苗過程為溫室開瓶煉苗3 d→洗凈根系培養(yǎng)基→穴栽至苗床（河砂、羊糞、珍珠巖體積比為3∶1∶1）上→用塑料薄膜覆蓋7 d，移栽成活率可達70%[14 ]。浙貝母鱗莖經(jīng)洗凈培養(yǎng)基→晾干后潤砂貯藏，使其在常溫下越夏休眠，可將直徑 > 0.5 cm以上的試管鱗莖完好地保存下來，但直徑 < 0.5 cm的鱗莖不能保存，完好率只有30%左右[39 ]。

8? ?存在的問題和展望

絕大多數(shù)貝母的組織培養(yǎng)以鱗莖為外植體，但由于鱗莖生長于地下，帶菌多，很難滅菌徹底。我們在對甘肅貝母進行組織培養(yǎng)時以休眠芽為外植體，萌發(fā)后獲得大量無菌幼嫩的莖段，或者鱗莖經(jīng)簡單消毒后剝?nèi)ネ鈱影瑢?nèi)部的小芽為外植體直接接種培養(yǎng)。休眠芽基部的小鱗莖因包裹在休眠芽內(nèi)部，本身處于無菌狀態(tài)，只要對休眠芽進行簡單消毒即可解剖出無菌小鱗莖，可以獲得大量的幼嫩外植體。以伊貝母黃化莖段為外植體可直接再生小鱗莖，誘導(dǎo)率91%。以上外植體與大鱗莖相比，污染率低、材料幼嫩、培養(yǎng)效果好，是組織培養(yǎng)的理想外植體[20 ]。因此，科研工作者可更多的嘗試采用休眠芽、內(nèi)生小鱗莖、莖段和子房為外植體，以高效深入地開展研究。

貝母組織培養(yǎng)中培養(yǎng)物生長速度慢，增殖效率低，無法達到快速繁殖的目的。目前，幾乎所有的相關(guān)文獻都采用固體培養(yǎng)基和恒溫培養(yǎng)條件，有關(guān)液體培養(yǎng)和變溫試驗鮮見報道。植物組織培養(yǎng)科研工作者可以嘗試從多方面開展試驗，采用更多更有效的技術(shù)和方法解決貝母培養(yǎng)物生長繁殖慢的難題。

在組織培養(yǎng)中直接發(fā)生途徑與間接發(fā)生途徑相比，不經(jīng)愈傷組織直接產(chǎn)生植物器官或者再生植株，遺傳變異率小且耗時短，是離體快速繁殖的理想途徑。由外植體直接生成小鱗莖，然后由鱗片繼代培養(yǎng)再次產(chǎn)生小鱗莖，如此周而復(fù)始，達到快速繁殖的目的。我國已有許多學(xué)者開展了貝母組織培養(yǎng)研究，但研究還不夠深入和廣泛。首先，研究涉及的植物種類雖較多，但主要集中于伊貝母、浙貝母，對每種植物研究缺乏系統(tǒng)性和后續(xù)的深入研究。其次，由外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生小鱗莖雖能夠?qū)崿F(xiàn)，但小鱗莖的繼代增殖系數(shù)小，達不到快速繁殖的目的。此外，移栽技術(shù)不成熟，植株容易死亡，直接影響到大田推廣和生產(chǎn)應(yīng)用。因此，貝母試管鱗莖的高頻誘導(dǎo)、試管鱗莖的萌發(fā)和馴化栽培是今后研究重點。

近年來，隨著植物生物技術(shù)的發(fā)展，科研工作者先后在試管中誘導(dǎo)出了馬鈴薯、半夏、地黃、芋、生姜等地下營養(yǎng)繁殖器官，試圖代替試管苗，其中試管馬鈴薯塊莖和試管半夏塊莖的培養(yǎng)技術(shù)已成熟，可替代試管苗作為商品供應(yīng)[38 ]。在國外，單子葉植物如百合、洋蔥、鳶尾、石蒜等地下營養(yǎng)繁殖器官的組織培養(yǎng)技術(shù)已應(yīng)用于生產(chǎn)實踐[41 ]。貝母是一種藥用價值很高的常用中藥材，但種植效率低，藥材價格昂貴，因此有必要建立貝母離體快速繁殖技術(shù)體系，盡快應(yīng)用于生產(chǎn)實踐。

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（本文責(zé)編：陳? ?珩）