失笑散降低氧糖剝奪再灌注BV2細(xì)胞損傷及NLRP3的表達(dá)

王蕾 李鵬飛 李帆 張春兵

摘要 目的：研究失笑散對(duì)BV2細(xì)胞氧糖剝奪再灌注（OGD/R）模型的保護(hù)作用及潛在機(jī)制。方法：將BV2細(xì)胞分為對(duì)照組，模型（OGD/R）組及失笑散組。失笑散組用不同濃度（1、10、20、50、100 μg/mL）預(yù)處理BV2細(xì)胞2 h。對(duì)照組正常培養(yǎng)，不給藥，不進(jìn)行糖氧剝奪（OGD）;模型組不給藥，與失笑散組同時(shí)進(jìn)行OGD，缺氧結(jié)束后再灌注24 h，收集細(xì)胞及其上清液。CCK-8法檢測(cè)BV2細(xì)胞的活力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BV2細(xì)胞的凋亡;實(shí)時(shí)定量PCR和ELISA分別檢測(cè)BV2細(xì)胞TNF-α、IL-6和NLRP3及相關(guān)蛋白Caspase-1、IL-1β、IL-18的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果：不同濃度失笑散并不影響B(tài)V2細(xì)胞活力。與對(duì)照組比較，模型組BV2細(xì)胞凋亡顯著增多（P<0.01），而高濃度失笑散明顯減少BV2細(xì)胞凋亡（P<0.05）。實(shí)時(shí)定量PCR和ELISA結(jié)果表明，與模型組比較，失笑散觀察組BV2細(xì)胞TNF-α、IL-6和NLRP3炎性小體及相關(guān)蛋白Caspase-1、IL-1β、IL-18的mRNA和蛋白表達(dá)量明顯減少（P<0.05）。結(jié)論：失笑散減輕OGD/R對(duì)BV2細(xì)胞的損傷及降低炎癥介質(zhì)的表達(dá)，機(jī)制可能與調(diào)控NLRP3炎性小體介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 失笑散;NLRP3炎性小體;氧糖剝奪再灌注模型;腦缺血再灌注損傷;小膠質(zhì)細(xì)胞;腦卒中;炎癥

Abstract Objective：To study the protective effects of Shixiao Powder on hypoxia glucose deprivation reperfusion（OGD/R） of BV2 cells model and explore the potential mechanism.Methods：BV2 cells were divided into a control group，a model group and a Shixiao Powder group.In Shixiao Powder group，BV2 cells were pretreated with different concentrations（1，10，20，50，100 μg/mL） for 2 h.BV2 cells in the control group were cultured normally without drug administration and OGD; BV2 cells in the model group were not treated with OGD at the same time as Shixiao Powder group.After hypoxia，reperfusion 24 h after hypoxia，and the cells and their supernatant were collected.The BV2 cell viability were examined by CCK-8; the apoptosis BV2 cells were observed by flow cytometry; the mRNA and protein expression of TNF-α，IL-6，NLRP3 inflammasome and related proteins（Caspase-1，IL-1β，IL-18） in BV2 cells were detected by real-time quantitative PCR and ELISA.Results：CCK-8 assay showed that there were no significant changes in BV2 cell viability with different concentrations of Shixiao Powder.Compared with the model group，the apoptosis ratio of BV2 cells increased significantly（P<0.01），while high concentration Shixiao Powder markedly reduced the apoptosis of BV2 cells（P<0.05）.The results of qPCR and ELISA demonstrated that the mRNA and protein expression of TNF-α，IL-6，NLRP3 inflammasome and related proteins in BV2 cells evidently decreased in Shixiao Powder treatment group（P<0.05）.Conclusion：Shixiao Powder can alleviate the damage of BV2 cells induced by hypoxia glucose deprivation reperfusion and the expression of NLRP3.The underlying mechanism may be related to the regulation of inflammatory signal pathway mediated by NLRP3 inflammasome.

Keywords Shixiao Powder; NLRP3 inflammasome; Oxygen glucose deprivation reperfusion model; Cerebral ischemia reperfusion injury; Microglia cells; Stroke; Inflammation

中圖分類號(hào)：R255.2;R289.4;R742文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.24.006

全世界每年有1 500萬人發(fā)生腦卒中，嚴(yán)重影響了人類健康[1]。近年來腦卒中成為我國(guó)的主要死因，約占全世界腦卒中死亡總?cè)藬?shù)的1/3[2]。腦卒中根據(jù)其潛在的病理學(xué)可分為缺血性腦卒中或出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中（Ischemic Stroke，IS）占所有腦卒中患者的85%[3]。免疫反應(yīng)誘導(dǎo)的缺血后炎癥是腦缺血再灌注損傷（Cerebral Ischemia Reperfusion Injury，CIRI）的重要過程，小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞，在缺血后被激活產(chǎn)生炎癥介質(zhì)[4]。NOD樣受體蛋白3（Nucleotide Binding Domain（NOD）-like Receptor Protein 3，NLRP3）炎性小體是重要的先天免疫模式識(shí)別受體，參與缺血后炎癥反應(yīng)[5]。近些年來的研究表明中醫(yī)藥通過抗氧化、抗炎和抗缺血再灌注損傷等機(jī)制治療腦卒中[6]。

失笑散由蒲黃、五靈脂組成，來源于《和劑局方》，其有活血通痹、散結(jié)止痛的作用[7]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)失笑散具有抗血小板、改善內(nèi)皮功能和降低炎癥介質(zhì)水平功效[8]。本研究擬通過構(gòu)建體外氧糖剝奪再灌注（Oxygen-glucose Deprivation and Reperfusion，OGD/R）模型，探討失笑散能否減輕CIRI及其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 選用小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2細(xì)胞（美國(guó)，ATCC細(xì)胞庫(kù)），BV2細(xì)胞用含10% FBS、90%高糖DMEM的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，放置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，24 h換液1次，48 h傳代1次，密切觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.1.2 藥物 蒲黃、五靈脂各30 g，將其放入電砂鍋內(nèi)，加入600 mL的純凈水，沒過藥材浸泡30 min。將電砂鍋加熱，煎煮1 h，用紗布過濾藥液至干凈容器。將藥渣放入電砂鍋中再次加入600 mL純凈水，煎煮1 h，過濾藥液。2次藥液合并混勻，靜置到室溫。藥液分裝至離心管中，12 000×g離心10 min。收集離心管里的上層藥液至旋蒸器，70 ℃旋蒸至藥液蒸發(fā)完畢。60 ℃將藥液減壓濃縮至60 mL，加入320 mL 95%乙醇，使藥液含醇量為80%，靜置過夜取上清液。60 ℃下將上清液減壓濃縮、干燥，得到失笑散干浸膏，用純水溶解、定容為30 mL，13 000×g離心5 min，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾、除菌，得到失笑散提取液，濃度為2 g/mL。所得藥液保存在4 ℃環(huán)境中，其后可調(diào)整所需藥液濃度。

1.1.3 試劑與儀器 蒲黃、五靈脂（江蘇省中醫(yī)院中藥房）;DMEM（高糖和無糖）培養(yǎng)基、胎牛血清、Trizol、0.25%胰蛋白酶（Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó)，貨號(hào)分別為：11965092、11966025、12483020、15596026、25200056）;DMSO（Sigma-Aldrich公司，德國(guó)，貨號(hào)：D2650）;DEPC（北京索萊寶生物科技有限公司，貨號(hào)：R1600）;異丙醇、三氯甲烷、無水乙醇（上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào)分別為：40064360、10006818、10009218）;CCK-8檢測(cè)試劑盒（同仁化學(xué)研究所，日本，貨號(hào)：CK04）;凋亡檢測(cè)試劑盒（Biouniquer公司，美國(guó)，貨號(hào)：BU-AP0101）;RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量PCR檢測(cè)試劑盒（TaKaRa公司，日本，貨號(hào)：2641A、RR037A）;小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β和IL18 ELISA檢測(cè)試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號(hào)分別為：ml002095、ml002293、ml001814和ml002294）。CO2培養(yǎng)箱（Thermo Scientific公司，美國(guó)，型號(hào)：311）;缺氧小室（Billups-Rothenberg公司，美國(guó)，型號(hào)：MIC-101）;核酸蛋白濃度檢測(cè)儀（Eppendorf公司，德國(guó)，型號(hào)：BioSpectrometer）;熱循環(huán)儀（Applied Biosystems公司，美國(guó)，型號(hào)：96 well Thermal Cycler）;PCR擴(kuò)增儀（Applied Biosystems公司，美國(guó)，型號(hào)：7500）;酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國(guó)，型號(hào)：3350）;流式細(xì)胞儀（BD公司，美國(guó)，型號(hào)：FACS Canto Ⅱ）。

1.2 方法

1.2.1 分組與OGD/R模型的制備 將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組和失笑散組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV2細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用1 mL高糖DMEM沖洗2次，加入胰酶消化細(xì)胞，在鏡下確認(rèn)細(xì)胞已被消化，再加入3 mL DMEM多次吹打，收取細(xì)胞懸液。離心后，用1 mL胎牛血清（FBS）重懸沉淀細(xì)胞。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，加入無糖DMEM（96孔板每孔100 μL，12孔板每孔1 mL）。將細(xì)胞培養(yǎng)板和氧濃度檢測(cè)儀同時(shí)放入缺氧小室中，連接缺氧裝置與備用氣瓶，用含95% N2和5% CO2的混合氣體通氣，流量為20 L/min，氧濃度監(jiān)測(cè)儀顯示缺氧小室內(nèi)氧濃度≤0.2%時(shí)，快速關(guān)緊進(jìn)、出氣閥，將缺氧裝置放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。除去培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，以高糖DMEM沖洗2次，再加入完全培養(yǎng)基，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，模擬再灌注損傷。

1.2.2 給藥方法 失笑散組采用失笑散不同濃度（1、10、20、50、100 μg/mL）預(yù)處理BV2細(xì)胞2 h。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 1）CCK-8法檢測(cè)BV2細(xì)胞活力：收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，按密度5×103/孔接種于96孔板中，用完全培養(yǎng)基在37 ℃溫箱培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，將不同濃度的失笑散（1、5、10、20、50、200、500、1 000、2 000 μg/mL）加入各孔，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑。培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值（450 nm）。2）流式細(xì)胞儀檢測(cè)BV2細(xì)胞凋亡：BV2細(xì)胞按1×105/孔密度接種在12孔板內(nèi)，失笑散組細(xì)胞分別用不同濃度的失笑散預(yù)處理2 h。模型組和失笑散組進(jìn)行OGD/R處理，操作同1.2.1。用無EDTA胰酶收集細(xì)胞到流式管中，流式管中加入500 μL的Annexin V Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium Iodide，混勻，室溫避光靜置15 min等待染色，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。3）實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)BV2細(xì)胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α的表達(dá)BV2細(xì)胞按1×105/孔的密度接種于12孔板中，失笑散組細(xì)胞分別用不同濃度失笑散預(yù)處理2 h。模型組和失笑散組進(jìn)行OGD/R操作，同1.2.1;OGD/R結(jié)束后，吸去各孔培養(yǎng)液，每1 mL Trizol消化兩孔，收集至1.5 mL無酶EP管中。使用Trizol法提取細(xì)胞RNA，用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定RNA值并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR引物信息見表1。以GAPDH作為內(nèi)參，目的基因的相對(duì)表達(dá)量按2-△△Ct的公式計(jì)算得到。4）ELISA法檢測(cè)BV2細(xì)胞炎癥介質(zhì)的表達(dá)：將細(xì)胞以1×104/孔的密度接種于96孔板，失笑散組細(xì)胞分別用不同濃度的失笑散預(yù)處理2 h，模型組和失笑散組進(jìn)行OGD/R處理，方法同1.2.1;細(xì)胞復(fù)氧結(jié)束后，收集各組細(xì)胞上清液待測(cè)。按照ELISA試劑盒說明檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.00統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行圖表繪制。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，然后采用One-way Analysis of variance法進(jìn)行組間比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 失笑散對(duì)BV2細(xì)胞活力的作用 不同濃度失笑散對(duì)BV2細(xì)胞的活力無顯著影響（均P>0.05）。見圖1。

2.2 失笑散對(duì)BV2細(xì)胞凋亡的影響 模型組細(xì)胞凋亡比例顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，失笑散組細(xì)胞凋亡比例均呈下降趨勢(shì)，當(dāng)失笑散濃度為500 μg/mL、1 000 μg/mL時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。

2.3 各組BV2細(xì)胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較 模型組細(xì)胞炎癥介質(zhì)的表達(dá)水平比對(duì)照組高，其中除IL-1β外，其余指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），尤以IL-18和Caspase-1升高最明顯。與模型組比較，失笑散組的炎癥介質(zhì)表達(dá)水平降低，各指標(biāo)下降程度不同。失笑散組各濃度比較，組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。見圖3。

2.4 各組細(xì)胞炎癥介質(zhì)的表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，模型組炎癥介質(zhì)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05、P<0.05、P<0.001、P<0.001）。與模型組比較，失笑散組炎癥介質(zhì)水平下降，但其中IL-1β、IL-18下降幅度較小（P<0.05、P<0.001），而IL-6、TNF-α明顯減少（P<0.05、P<0.001），但失笑散組各濃度降低炎癥介質(zhì)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。見圖4。

3 討論

目前，腦卒中是全世界死亡和長(zhǎng)期殘疾的主要原因。腦缺血組織再灌注時(shí)氧氣的重新注入將會(huì)觸發(fā)氧化應(yīng)激，引發(fā)灌注損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞和組織的損傷和死亡[9]。CIRI誘導(dǎo)腦組織炎癥顯著增加[10]。盡管其中的機(jī)制尚不明確，但是腦缺血能夠打破促炎和抗炎應(yīng)答的平衡。腦卒中臨床前研究表明，抑制炎癥反應(yīng)可以減少腦損傷，改善神經(jīng)功能。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要免疫巨噬樣細(xì)胞。腦缺血后，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活產(chǎn)生炎癥介質(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞破壞和死亡[11]。腦卒中發(fā)作時(shí)（<24 h）TNF-α和IL-6升高，血清中IL-6的水平與腦卒中的嚴(yán)重程度及不良反應(yīng)正相關(guān)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組中的IL-6和TNF-α均升高。OGD/R處理后，BV2細(xì)胞IL-6和TNF-α升高，與本研究結(jié)果一致。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)化濁解毒活血通絡(luò)方降低CIRI模型IL-6和TNF-α的表達(dá)水平，從而降低腦缺血再灌注損傷的程度[13]。血栓通能夠顯著抑制OGD/R BV2細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，OGD/R可以顯著減少BV2細(xì)胞的活力和釋放IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥介質(zhì)，使腦組織受到損害，而中藥單體銀杏內(nèi)酯可以增加OGD/R BV2細(xì)胞的活力，銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯可以減少OGD/R BV2細(xì)胞IL-6和TNF-α等炎癥介質(zhì)的水平[15]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪（Tetramethylpyrazine）能顯著降低腦缺血再灌注損傷TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達(dá)水平，減輕炎癥反應(yīng)[16]。前期的研究基礎(chǔ)，給我們提供了中醫(yī)藥通過抗炎治療CIRI的思路。本研究通過OGD/R模型誘導(dǎo)BV2細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，用失笑散進(jìn)行干預(yù)，觀察其保護(hù)作用及抗炎機(jī)制。

NLRP3炎性小體調(diào)節(jié)腦卒中發(fā)展過程的炎癥應(yīng)答，炎癥水平的調(diào)節(jié)在腦卒中的防治中可能起著至關(guān)重要的作用[17]。NLRP3炎性小體是目前最具特征的炎癥體，由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（Apoptosis-associated Speck-like Protein Containing a CARD，ASC）和Caspase-1前體（procaspase-1）組成，NLRP3炎性小體可以激活procaspase-1裂解成p20和p10亞基，形成活性Caspase-1，進(jìn)而導(dǎo)致IL-1β和IL-18的成熟和分泌[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎性小體通過自分泌/旁分泌模式參與神經(jīng)血管損傷，降低NLRP3炎性小體表達(dá)可改善小鼠CIRI損傷[19]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組中的NLRP3表達(dá)水平高于對(duì)照組，約為對(duì)照組的2.5倍。由此可見，NLRP3炎性小體與CIRI的病理過程關(guān)系密切，抑制或者減少NLRP3炎性小體的激活有望成為治療CIRI的新方法。有研究發(fā)現(xiàn)腦心通抑制NLRP3炎性小體的激活，降低Caspase-1的活化體的產(chǎn)生，減少炎癥介質(zhì)的表達(dá)，減輕腦卒中后炎癥的損傷[20]。有研究報(bào)道中藥單體漢防己甲素保護(hù)BV2細(xì)胞在OGD/R處理后造成的損傷，下調(diào)NLRP3、IL-1β和IL-18的水平[21]。本研究失笑散是通過調(diào)控NLRP3炎性小體減輕OGD/R BV2細(xì)胞炎癥介質(zhì)表達(dá)。

失笑散為中醫(yī)經(jīng)典名方，具有活血祛瘀、散結(jié)止痛的作用，臨床常用于治療瘀血停滯證。祝光禮等[22]發(fā)現(xiàn)失笑散可以降低血清及細(xì)胞上清液中肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌肌鈣蛋白Ⅰ水平，表明其有良好的抗心肌缺血作用。有研究報(bào)道失笑散治療反流性食管炎能夠改善食管黏膜炎癥[23]。以上研究證實(shí)失笑散具有抗心肌缺血、抗炎止痛等功效。目前，尚未見失笑散治療腦卒中的研究報(bào)道。本研究使用失笑散預(yù)處理BV2細(xì)胞2 h，發(fā)現(xiàn)其能減少OGD/R BV2細(xì)胞的凋亡，說明失笑散能保護(hù)OGD/R造成的BV2細(xì)胞損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，失笑散降低OGD/R BV2細(xì)胞模型中TNF-α、IL-6炎癥介質(zhì)的mRNA及蛋白的表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過失笑散處理過后BV2細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1及其介導(dǎo)的炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-18 mRNA及蛋白的表達(dá)也下降。這些體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示失笑散可降低腦缺血再灌注引起的小膠質(zhì)細(xì)胞的損傷及炎癥介質(zhì)的表達(dá)。未來將構(gòu)建大鼠腦缺血再灌注損傷模型，從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)失笑散的保護(hù)作用。

綜上所述，本研究結(jié)果提示失笑散降低OGD/R BV2細(xì)胞的損傷，其機(jī)制可能與調(diào)控NLRP3炎性小體及其介導(dǎo)的炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-18的表達(dá)有關(guān)。本研究為失笑散的臨床應(yīng)用和CIRI機(jī)制進(jìn)一步提供了理論依據(jù)。

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（2020-12-22收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）