基于ISSR標(biāo)記分析油梨種質(zhì)的遺傳多樣性

摘 要：基于ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析油梨種質(zhì)遺傳多樣性和親緣關(guān)系，旨在為油梨種質(zhì)資源的合理利用提供科學(xué)依據(jù)。選用12條ISSR多態(tài)性引物對(duì)54份油梨種質(zhì)的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用Popgene 1.32、NTSYSpc 2.1軟件計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)、種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)以及UPGMA聚類分析。結(jié)果顯示，篩選出的12條ISSR多態(tài)性引物共擴(kuò)增出106條譜帶，平均每條引物擴(kuò)增8.08條多態(tài)性譜帶，多態(tài)性位點(diǎn)比率PPB為91.83%，平均觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）、Shannon’s信息指數(shù)（I）以及多態(tài)性信息量（PIC）分別為1.89、1.47、0.28、0.43、0.63。油梨種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)在0.66～0.91之間，在遺傳相似系數(shù)0.72處，可劃分為5大類群，供試種質(zhì)并不完全按照地理來(lái)源進(jìn)行分類。54份油梨種質(zhì)有較高的遺傳多樣性，遺傳信息豐富，ISSR標(biāo)記對(duì)其多態(tài)性檢測(cè)有效性高，適用于其遺傳多樣性分析。

關(guān)鍵詞：油梨;種質(zhì)資源;ISSR;遺傳多樣性;聚類分析

中圖分類號(hào)：S-3? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Genetic Diversity Analysis of Avocado （Persea Americana Mill. ） Germplasms Based on ISSR Marker

ZHOU Hailan1，LI Shaopeng2，ZHOU Junan1，PANG Xinhua1，

OU Jingli1，PAN Zujian1，LI Juxin1，TANG Xiuguan1，Li Maofu2*

（1Guangxi Subtropical Crops Research Institute，Nanning， Guangxi 530001， China;

2College of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan，Haikou 570228， China）

Abstract：To provide scientific basis for rational utilization of avocado （Persea Americana Mill.） germplasm resources， the genetic diversity and relatedness of 54 avocado germplasms were studied based on ISSR marker technology. 12 ISSR primers with rich polymorphism and clear amplified bands were used for PCR amplification of genomic DNA of the 54 avocado germplasm resources. The genetic diversity parameters and genetic similarity coefficients among germplasms were calculated， and UPGMA cluster analysis was carried out by using Popgene 1.32 and NTSYSpc 2.1 software. Results showed that a total of 106 bands were amplified from 12 ISSR primers with an average of 8.08 polymorphic bands per primer， and the percentage of polymorphic bands （PPB） was 91.83%. The average number of observed alleles （Na）， effective number of alleles （Ne）， Nei's gene diversity index （H）， Shannon's information index （I） and? polymorphism information content （PIC） were 1.89， 1.47， 0.28， 0.43， 0.63， respectively. The genetic similarity coefficients among avocado germplasms ranged from 0.66 to 0.91. Based on the results of cluster analysis， avocado germplasms could be classified into five groups at the genetic similarity of 0.72， and the tested germplasms were not completely classified according to geographical origin. The 54 avocado germplasms had high genetic diversity and rich genetic information. ISSR markers were effective for polymorphism detection and suitable for genetic diversity analysis of avocado germplasms.

Key words：Avocado; germplasm resources; ISSR marker; genetic diversity; cluster analysis

油梨（Persea americana Mill.）是樟科（Lauraceae）鱷梨屬（Persea）植物，是世界許多熱帶和亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)和營(yíng)養(yǎng)水果作物[1-3]。中美洲土著居民早在公元前8000年就食用了油梨，他們稱其為“上帝的禮物”。油梨是一個(gè)高度多樣化的物種，其地方性變異產(chǎn)生了不同的生態(tài)種[4]，主要為墨西哥種族（Persea americana Miller var. Drymifolia）、危地馬拉種族（Persea nubigena Miller var. Guatemalensis）和西印度種族（Persea americana Miller var. Americana），種族間不存在不育障礙。油梨是一個(gè)二倍體物種 （2n = 2x = 24），屬異型雜交植物，開花表現(xiàn)出獨(dú)特的雌雄蕊異熟開放行為，有利于異花授粉，產(chǎn)生高度遺傳雜交，為利用遺傳變異進(jìn)行育種提供了很好的機(jī)會(huì)。因此，無(wú)論是自然產(chǎn)生還是人工誘導(dǎo)，許多商業(yè)性油梨通常是不同種族的雜交種[5]。分子標(biāo)記已被用于品種鑒定與分類、遺傳多樣性和進(jìn)化研究、構(gòu)建連鎖圖譜及標(biāo)記輔助育種篩選目標(biāo)性狀等。分子標(biāo)記已廣泛用于調(diào)查油梨資源的遺傳多樣性。Fiedler等[6]利用RAPDs標(biāo)記研究三個(gè)種族的16個(gè)油梨品種的遺傳差異，有效地分離發(fā)現(xiàn)了種族特異性標(biāo)記。Chen等[7-8]利用SNP標(biāo)記對(duì)來(lái)自墨西哥、哥斯達(dá)黎加、厄瓜多爾和多米尼加共和國(guó)的21份野生油梨進(jìn)行了核苷酸多樣性研究。Guzman等[9]利用Gross-German和Viruel[5]之前使用的28個(gè)SSR標(biāo)記，篩選了墨西哥國(guó)立油梨基因庫(kù)的318個(gè)樣本，根據(jù)他們的生態(tài)起源地區(qū)被分為兩類。Boza等[10]用SSR標(biāo)記對(duì)354株油梨樹進(jìn)行園藝種鑒定、居群結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性分析。

油梨于1918年首次被引入中國(guó)臺(tái)灣省，迅速繁殖產(chǎn)生了許多具有理想特性的商業(yè)性優(yōu)良品種。中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院、廣西職業(yè)技術(shù)學(xué)院以及其他國(guó)有或私營(yíng)農(nóng)場(chǎng)已選育出十多個(gè)優(yōu)質(zhì)油梨品種。自20世紀(jì)50年代末以來(lái)，從美國(guó)、以色列、墨西哥和中美洲引入我國(guó)的油梨品種有上百種[11]。此外，油梨品種之間的自然雜交經(jīng)常發(fā)生，產(chǎn)生了許多新的油梨雜交種，在進(jìn)化過程中產(chǎn)生了豐富的遺傳多樣性。已有的研究報(bào)道用分子標(biāo)記對(duì)油梨種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性研究涉及到的數(shù)目有限，廣泛性有待進(jìn)一步研究。簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性（ISSR）是在SSR標(biāo)記上創(chuàng)建，植物基因組中ISSR序列普遍存在。本研究采用ISSR標(biāo)記對(duì)油梨種質(zhì)資源圃內(nèi)的54份油梨種質(zhì)進(jìn)行多態(tài)性研究，評(píng)估油梨種質(zhì)間的遺傳多樣性，為管理核心種質(zhì)、遺傳改良及拓寬油梨育種材料提供理論基礎(chǔ)，提高育種效率。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料選用與周海蘭等[12]相同（見表1）。試驗(yàn)所用的引物序列是加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的第九套 ISSR 引物序列，編號(hào)為UBC801～900，共100條，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。Taq酶、dNTPs等試劑藥品均從TAKARA公司購(gòu)買。主要儀器設(shè)備：PCR儀（Eppendorf Mastercycler Pro S，德國(guó)），瓊脂糖水平電泳儀（Standard Power Pack P25，德國(guó)），核酸蛋白儀（Nanovue plus超微量分光光度計(jì)，英國(guó)），紫外凝膠成像系統(tǒng)（DBT-2000W，泰亞賽福）等。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

選取供試材料健康無(wú)病害的干凈嫩葉，采用改良2×CTAB法[13]提取嫩葉DNA，并用核酸蛋白儀檢測(cè)DNA的濃度和純度，獲得的DNA放置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ISSR引物篩選及PCR擴(kuò)增

以表型差異明顯的哈斯、大嶺 7 號(hào)、福爾特及巴康4個(gè)油梨種質(zhì)嫩葉DNA為模板對(duì)100條ISSR引物進(jìn)行多態(tài)性篩選。ISSR-PCR的反應(yīng)程序采用TD-PCR擴(kuò)增程序：94 ℃，預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s（-1 ℃/循環(huán)），72 ℃延伸1 min，20個(gè)循環(huán);94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，20個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min;4℃終止。ISSR-PCR反應(yīng)體系為：在20 μL的反應(yīng)體系中，2X PCR buffer 2 μL;dNTPs（2.5 Mm）2 μL;MgCl2（25 Mm）1.6 μL;rTaq酶 0.2 μL;引物（10 μM）0.8μL;DNA模板（20 ng）2 μL;ddH2O補(bǔ)足至20 μL。用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)PCR產(chǎn)物，在120 V恒電壓下，電泳40 min，拍照保存，統(tǒng)計(jì)分析電泳條帶。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

觀察凝膠電泳圖，同一條引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，相對(duì)遷移率相同的為1個(gè)位點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增條帶時(shí)，按同一位點(diǎn)有無(wú)條帶進(jìn)行1、0賦值，有帶（陽(yáng)性）記為1，無(wú)帶（陰性）記為0，在Excel錄入數(shù)據(jù)，形成（1、0）數(shù)據(jù)矩陣。統(tǒng)計(jì)總擴(kuò)增條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)、多態(tài)性條帶比率（Percentage of polymorphic bands，PPB）和多態(tài)性信息含量（Polymorphism information content，PIC）。多態(tài)性信息含量根據(jù)公式PIC = 1 - ∑ Pi 2計(jì)算，Pi表示第i種基因型出現(xiàn)的頻率[14]。采用Popgene 1.32進(jìn)行遺傳多樣性參數(shù)分析，計(jì)算觀測(cè)等位基因數(shù)（Observed number of alleles，Na），有效等位基因數(shù)（Effective number of alleles，Ne）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（Nei's gene diversity，H）、Shannon’s信息指數(shù)（Shannon's Information index，I）等。NTSYSpc 2.1軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳相似系數(shù)計(jì)算和UPGMA法聚類，分析54份油梨種質(zhì)的親緣關(guān)系和遺傳多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選結(jié)果

降落PCR（Touchdown PCR）程序省去了大量引物退火溫度的摸索，減少非特異性帶的產(chǎn)生，提高篩選效率。試驗(yàn)以4個(gè)油梨樣品的DNA為模板，從100條ISSR引物中選出12條擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定性好的多態(tài)性引物用于油梨種質(zhì)的ISSR遺傳多樣性分析，見表2。

2.2 遺傳多樣性分析

采用經(jīng)篩選出的12條ISSR多態(tài)性引物對(duì)54份油梨基因組DNA進(jìn)行ISSR擴(kuò)增（圖1），統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。每條引物擴(kuò)增產(chǎn)生條帶4-13條，共產(chǎn)生條帶106條，其中每條引物產(chǎn)生的多態(tài)性條帶在3～12條之間，共97條，占總條帶的91.51%（多態(tài)性條帶比率PPB），多態(tài)性較好。每條引物的多態(tài)性信息量（PIC）為0.52～0.76，平均為0.63，觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）的變化范圍為1.67～2，平均1.89，有效等位基因數(shù)（Ne）的分布范圍為1.24～1.65，平均為1.47，Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）變化范圍為0.17～0.37，平均0.28，Shannon’s信息指數(shù)（I）變化在0.28～0.55之間，平均0.43，表明篩選獲得的12條ISSR引物的綜合表現(xiàn)較好，適合進(jìn)行油梨種質(zhì)親緣關(guān)系和遺傳多樣性評(píng)價(jià)，可以作為一種工具來(lái)區(qū)分不同來(lái)源的基因型。

2.3 聚類結(jié)果

UPGMA聚類結(jié)果顯示，所有個(gè)體的遺傳相似性系數(shù)在0.66～0.91之間。相似系數(shù)為0.72時(shí)，UPGMA分析將群體分為5類（圖2）。在第一類（A）中，將來(lái)自云南的5份種質(zhì)（YN003、YN011、YN022、YN027、YN028）和廣西的4份種質(zhì)（Hass、桂研10號(hào)、桂肯大2號(hào)、桂墾大3號(hào)）及海南的35份種質(zhì)（DKM、Pollock、大嶺2號(hào)、大嶺3號(hào)、大嶺4號(hào)、大嶺5號(hào)、大嶺8號(hào)、大嶺10號(hào)、大嶺11號(hào)、大嶺12號(hào)、大嶺13號(hào)、大嶺14號(hào)、大嶺15號(hào)、大嶺17號(hào)、芙蓉田1號(hào)、芙蓉田2號(hào)、芙蓉田3號(hào)、芙蓉田4號(hào)、芙蓉田5號(hào)、芙蓉田6號(hào)、芙蓉田7號(hào)、芙蓉田8號(hào)、芙蓉田9號(hào)、熱研2號(hào)、熱研3號(hào)、熱研16號(hào)、大嶺6號(hào)、大嶺9號(hào)、大嶺16號(hào)、Y2-12、Y3-1、Y3-23、Y6-5、Y7-20、Y10-1）進(jìn)行了分組，歸為A類，共44份種質(zhì)，占供試種質(zhì)的81.48%。第二類（B）包括3個(gè)來(lái)自海南的種質(zhì)，為大嶺7號(hào)、熱研17號(hào)、Y1-10。第三類（C）為來(lái)自廣西的Fuerte、Bacon。第四類（D）為來(lái)自云南的4份種質(zhì)（YN005、YN010、YN016、YN020）。第五類（E）來(lái)自云南的1份種質(zhì)YN006。表明這些供試種質(zhì)并不完全按照地理來(lái)源進(jìn)行分組。另一方面，需要指出的是，在類群中，基因型間的遺傳相似性最大的為種質(zhì)7（大嶺2號(hào)）和種質(zhì)21（芙蓉田3號(hào)）、種質(zhì)9（大嶺4號(hào)）和種質(zhì)10（大嶺5號(hào)）。

3 討論與結(jié)論

油梨在我國(guó)越來(lái)越受歡迎，在熱帶和亞熱帶地區(qū)如廣西、海南、云南、貴州、廣東、福建和臺(tái)灣等南方省份廣泛種植與使用。油梨種質(zhì)資源的多樣性是油梨改良工程的重要組成部分，在當(dāng)前選育油梨品種的過程中，需要一個(gè)高度多樣化的基因庫(kù)，以增加產(chǎn)量、提高果實(shí)品質(zhì)、抗病蟲害及改善含油量等，而關(guān)于我國(guó)油梨遺傳多樣性背景的研究很少。本研究以從廣西、云南、海南收集的油梨種質(zhì)資源為研究對(duì)象，利用ISSR分子標(biāo)記闡明54份油梨種質(zhì)資源間的親緣關(guān)系，為我國(guó)油梨種質(zhì)資源的改良育種提供參考。

本研究采用ISSR標(biāo)記對(duì)54份油梨種質(zhì)資源進(jìn)行親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示，所有個(gè)體的遺傳相似系數(shù)在0.66～0.91之間，在相似系數(shù)為0.72時(shí)，供試種質(zhì)分成5個(gè)類群，與前面研究油梨遺傳多樣性的SSR分析[12]分成4個(gè)類群存在差異，但大多數(shù)供試種質(zhì)能聚為一類群，聚類結(jié)果整體上表現(xiàn)一致。本研究的供試種質(zhì)在相似系數(shù)為0.72時(shí)，劃分為5個(gè)類群：聚為A類群的有44份油梨種質(zhì)，包括來(lái)自云南的5份、廣西的4份及海南的35份;B類群為來(lái)源于海南的3份種質(zhì);C類群為來(lái)源于廣西的2份種質(zhì);D類群為來(lái)自云南的4份種質(zhì);E類群來(lái)自云南的1份種質(zhì)。可見，A類群的種質(zhì)不完全按照地理來(lái)源分類，國(guó)內(nèi)的油梨種質(zhì)最初由海外引進(jìn)的，經(jīng)過種子和芽條的傳播和繁殖散布到南方多省的熱帶亞熱帶區(qū)域，這可能造成了在A類群來(lái)自不同地區(qū)的種質(zhì)遺傳背景相似性高的原因之一。然而，B類群、C類群、D類群及E類群是完全按照地理來(lái)源分類的，且油梨種質(zhì)資源的遺傳背景與地理分布有一定的相關(guān)性，來(lái)源于同一地區(qū)的種質(zhì)資源遺傳變異較小。綜合表明，分為5個(gè)類群的供試油梨種質(zhì)并不存在完全的地理來(lái)源的聚類，且在一定程度上體現(xiàn)了供試種質(zhì)地理來(lái)源的相似性。

多態(tài)性信息量（PIC）是評(píng)估基因變異程度的主要指標(biāo)之一。本研究中利用12條ISSR多態(tài)性引物對(duì)54份油梨種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，PIC平均值為0.63，PIC大于0.5，表明位點(diǎn)具有高度多態(tài)性。Cuiris-Pérez H等[14]利用7個(gè)ISSR分子標(biāo)記對(duì)77份油梨種質(zhì)資源的遺傳多樣性、種質(zhì)鑒定的研究中，PIC均值為0.92遠(yuǎn)高于本研究，墨西哥作為油梨原產(chǎn)地，相對(duì)來(lái)說油梨種質(zhì)資源基因型更豐富多樣，群體遺傳多樣性也相對(duì)較高。此外，在親緣關(guān)系密切的油梨?zhèn)€體中，與油梨的其他分子標(biāo)記研究結(jié)果一樣[15-18]，ISSR標(biāo)記檢測(cè)遺傳變異的有效性在本研究中得到了證實(shí)，研究中沒有發(fā)現(xiàn)供試的油梨種質(zhì)資源之間遺傳相似系數(shù)為1，各種質(zhì)不存在重復(fù)收集，供試種質(zhì)存在廣泛的遺傳變異，均可保存起來(lái)用于選育種，表明ISSR可以作為一種工具來(lái)區(qū)分不同來(lái)源的基因型。然而，本研究中ISSR標(biāo)記檢測(cè)到的位點(diǎn)沒有關(guān)聯(lián)農(nóng)業(yè)形態(tài)特征，這種聯(lián)合研究在加速育種過程中很重要，值得在后續(xù)的研究中考慮。

綜上所述，本研究證明了ISSR標(biāo)記在油梨遺傳多樣性分析中的應(yīng)用價(jià)值，檢測(cè)到的高多態(tài)性位點(diǎn)可為油梨基因組學(xué)、育種和選擇提供分子標(biāo)記材料來(lái)源，未來(lái)的工作重點(diǎn)是研究油梨形態(tài)和發(fā)育多樣性的進(jìn)化，為油梨的育種和選擇提供新的依據(jù)。

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