一種迎春花葉枯病新病原菌的分離與鑒定

孟祥佳 龍欣鈺 曹帥 劉艷華 Rudoviko Galieya Medison 孫正祥

摘 要：迎春花（Jasminum nudiflorum Lindl.）是一種既有觀賞價(jià)值又有藥用價(jià)值的植物。2021年6月，湖北省荊州市發(fā)現(xiàn)了一種可以使迎春花葉片枯萎的真菌病害，其發(fā)病癥狀與已報(bào)道的迎春花病害不完全相同。為分離鑒定該病原菌并為該病害的后續(xù)研究和防治提供理論依據(jù)，本文采用組織分離和單孢分離法從病葉的病健交界處獲得分離物;采用菌絲和孢子懸浮液2種方法接種迎春花進(jìn)行致病性測(cè)定;通過(guò)觀察致病菌的形態(tài)特征和分析其rDNA-ITS和nLSU基因序列相結(jié)合的方法確定其分類地位。結(jié)果表明，從病組織中共分離獲得5株不同的真菌，接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)僅有菌株YC1-1可以使迎春花發(fā)病，接種癥狀與自然發(fā)病的癥狀相同，并能從發(fā)病部位再次分離到原接種的菌物。經(jīng)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，引起迎春花葉枯病的病原菌為Phlebiopsis crassa。這是世界上首次報(bào)道Phlebiopsis crassa引起迎春花葉枯病。

關(guān)鍵詞：迎春花;葉枯病;病原菌;鑒定;Phlebiopsis crassa

中圖分類號(hào)：S476? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Isolation and Identification of a New Pathogen Causing Leaf Blight on Jasminum nudiflorum Lindl

MENG Xiangjia，LONG Xinyu，CAO Shuai，LIU Yanhua，

Rudoviko Galieya Medison，SUN Zhengxiang*

（ College of Agriculture， Yangtze University / Forewarning and Management of

Agricultural and Forestry Pests， Hubei Engineering Technology Center， Jingzhou，

Hubei 434025， China）

Abstract：Winter jasmine is a plant with both ornamental and medicinal value. In June 2021， a fungal disease that caused leaves wilt on winter jasmine was found in Jingzhou city， Hubei province， which symptom is not exactly the same as that has been reported. The study aims to isolate and identify the pathogen and provide theoretical basis for the follow-up research and prevention of the disease. The pathogenic fungi were obtained by tissue isolation and single spore isolation from the junction of diseased leaves. The pathogenicity was determined by inoculating the host plant with mycelium and spore suspension. The taxonomic status of pathogen was determined by observing their morphological characteristics and analyzing their rDNA-ITS and nLSU gene sequences. The results showed that a total of 5 different fungi were isolated from the diseased tissues. The pathogenic test showed that only one strain YC1-1 could cause jasmine leaf wilt， and the symptoms were the same as those of field， and the original inoculated fungi could be re-isolated. Morphological and molecular characteristics showed the pathogen causing jasmine leaf blight was Phlebiopsis crassa. This is the first report of winter jasmine leaf blight caused by Phlebiopsis crassa in the world.

Key words： Jasminum nudiflorum; leaf blight; pathogen; identification; Phlebiopsis crassa

迎春花（Jasminum nudiflorum Lindl.） 屬于木犀科素馨屬落葉灌木，也被稱為金腰帶、黃素馨，原產(chǎn)于我國(guó)甘肅、陜西、四川、云南西北部以及西藏東南部[1]。迎春花因?yàn)檩^易成活、生長(zhǎng)較快、耐旱能力較強(qiáng)以及觀賞性較高等特點(diǎn)，通常作為景觀植物種植在全國(guó)乃至世界各地[2]。除此之外，迎春花具有清熱解毒的功效，有重大的藥用價(jià)值[3，4]。2021年6月在湖北省荊州市荊州區(qū)長(zhǎng)江大學(xué)西校區(qū)（N 30° 21′，E 112° 8′）進(jìn)行植物病害調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)迎春花出現(xiàn)枝葉枯萎癥狀，發(fā)病率約40 %，嚴(yán)重影響了迎春花的觀賞價(jià)值與藥用價(jià)值，并且其發(fā)病癥狀與已報(bào)道的迎春花病害不完全相同。因此，分離和鑒定迎春花葉枯病的病原菌，可為該病害的后續(xù)研究和防治提供理論依據(jù)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)迎春花的研究主要在生理、栽培和提取物方面，如劉芳等[5]試管培養(yǎng)技術(shù)使迎春花生根率達(dá)到85 %;陳意蘭等[6]研究了不同程度干旱脅迫對(duì)迎春花葉片丙二醛（MDA） 含量和3種抗氧化酶活性的影響;Gu等[7]對(duì)迎春花提取物和熱解產(chǎn)物進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)多種化合物被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、能源和食品工業(yè)。目前關(guān)于迎春花病害方面的報(bào)道相對(duì)較少，本研究發(fā)現(xiàn)的迎春花葉枯病癥狀與已報(bào)道的迎春花病害不完全相同，推測(cè)為一種新病害，分離和鑒定其病原具有重要的研究?jī)r(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試材料：感病枝條及健康枝條于2021年6月采自于湖北省荊州市長(zhǎng)江大學(xué)西校區(qū)。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g、蒸餾水1 L。

1.2 病原菌的分離

2021年6月，從湖北省荊州市荊州區(qū)長(zhǎng)江大學(xué)西校區(qū)采集迎春花的發(fā)病枝條，在病健交界處切取組織塊（2 mm × 2 mm），各組織塊依次用70 %乙醇和2.5 %次氯酸鈉表面消毒2 min，之后用無(wú)菌水沖洗4次[8]。將消毒后的組織塊轉(zhuǎn)移至含有鏈霉素（50 mg/L）的PDA平板上，置于26℃培養(yǎng)箱中待分離物長(zhǎng)出后采用單孢分離法純化培養(yǎng)[9]。將獲得的純培養(yǎng)物保存于PDA 斜面（4 ℃）及15 %甘油中（-80℃），備用。

1.3 致病性測(cè)定

根據(jù)柯赫氏法則對(duì)供試菌株進(jìn)行致病性測(cè)定。選取健康且長(zhǎng)勢(shì)一致的迎春花枝條進(jìn)行水培生長(zhǎng)[10]，用無(wú)菌昆蟲針對(duì)待接種枝葉處進(jìn)行刺傷處理。本研究分別采用菌絲塊接種法和孢子液接種法分別進(jìn)行致病性檢測(cè)。

1.3.1 菌絲塊致病性測(cè)定

待測(cè)真菌純化培養(yǎng)5 d后，用直徑為5 mm打孔器在平板邊緣打取菌餅并使有菌絲面接觸傷口，并用聚乙烯袋包裹保濕24 h。以接種無(wú)菌的PDA菌餅為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。放置于溫室（28 ℃，光照培養(yǎng)16 h，黑暗培養(yǎng)8 h）中培養(yǎng)[11-12]。接種后，逐日觀察發(fā)病情況，待發(fā)病后，從發(fā)病組織上分離病原菌，觀察是否與接種病原菌的性狀一致。

1.3.2 孢子液致病性測(cè)定

待測(cè)真菌純化培養(yǎng)5 d后，用無(wú)菌水洗脫分生孢子，過(guò)濾后離心，再用滅菌水將濾液配制成孢子懸浮液（107 個(gè)/mL）。用無(wú)菌脫脂棉蘸取配制好的孢子懸浮液放置于傷口處，以蘸有無(wú)菌水的脫脂棉作對(duì)照[13]。培養(yǎng)條件及后續(xù)工作與1.3.1相同。

在初步確定病原菌后，為保證致病性實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，在原始發(fā)病地點(diǎn)選擇健康迎春花枝條進(jìn)行室外孢子液致病性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方法與上述相同。

1.4 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

菌落形態(tài)：供試菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3 d后用直徑5 mm的無(wú)菌打孔器打取菌落邊緣的菌絲塊，轉(zhuǎn)接于新的PDA培養(yǎng)基（90 mm培養(yǎng)皿）中央，置于25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察菌落形態(tài)，并測(cè)量菌落直徑。

孢子形態(tài)：挑取少量待試菌株菌絲轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基上，將無(wú)菌蓋玻片斜插入PDA培養(yǎng)基中距菌餅15 mm處，置于25 ℃恒溫條件下，每天8 h光照的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌絲完全覆蓋蓋玻片后，通過(guò)顯微鏡觀察并記錄其分生孢子產(chǎn)孢方式、形態(tài)、顏色及大小，初步確定病原菌的分類學(xué)地位。

1.5 病原菌分子鑒定

采用CTAB法提取病原真菌的DNA，分別用引物ITS1/ITS4[14]、LROR/LR7[15]進(jìn)行PCR擴(kuò)增（引物均有華大基因有限公司提供）。PCR 反應(yīng)體系總體積：2×SuperStar PCR Mix 12.5 μL，正、反向引物各1 μL，DNA模板2.5 μL，ddH2O 8 μL。擴(kuò)增ITS反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性 30 s;94 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán);最后 72 ℃延伸5 min，-20 ℃保存。擴(kuò)增 nLSU 的 PCR 參數(shù)：96 ℃預(yù)變性 30 s;96 ℃變性 10 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 35個(gè)循環(huán);最后 72℃延伸 6 min，-20 ℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)目的片段單一且大小無(wú)誤后將剩余的PCR產(chǎn)物送往華大基因有限公司進(jìn)行核酸測(cè)序。通過(guò)NCBI網(wǎng)站的BLAST程序?qū)λ眯蛄蟹謩e進(jìn)行同源比對(duì)分析。使用Phydit軟件將本研究序列與其他比對(duì)序列的2個(gè)基因序列接拼合并后，用MEGA 7.0軟件的自展法（Bootstrap）建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，進(jìn)化樹基于1000次重復(fù)檢驗(yàn)所得。

2 結(jié)果與分析

2.1 迎春花葉枯病癥狀

迎春花葉枯病發(fā)病前期，葉片有褐色的不規(guī)則病斑，主要集中于葉緣及葉尖端，少量集中于中部，中期病斑蔓延至整個(gè)葉片使其枯萎并脫落，后期嚴(yán)重時(shí)該病沿維管束蔓延使枝條及前端20～30 cm處的所有葉片均出現(xiàn)病發(fā)癥（圖1-A，B，C）。

2.2 病原菌分離、培養(yǎng)及致病性測(cè)定

對(duì)迎春花病健交界處進(jìn)行分離培養(yǎng)后獲得5種不同的真菌菌株，編號(hào)分別為YC1-1， YC1-3，YC2-2，YC2-3，YC3-2。其中僅有YC1-1接種健康迎春花葉片在2 d后明顯觀察到有病斑出現(xiàn)（圖1-E，G），5 d后的發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀相似（圖1-F，H）。室外致病性實(shí)驗(yàn)7 d后葉片也出現(xiàn)了相同的病斑（圖1-D）。依據(jù)柯赫氏法則，從發(fā)病的葉片再次進(jìn)行分離，得到與接種菌株相同的菌物。因此，菌株YC1-1確為迎春花葉枯病的病原菌。

2.3 形態(tài)學(xué)鑒定

菌株YC1-1在PDA上的菌落中央為乳白色絮狀，邊緣為輪紋狀，顏色較淺，菌絲稀疏（圖2-A，D）。顯微觀察表明，初生菌絲薄壁較直，直徑約1.5～3.5 μm，生殖菌絲細(xì)胞壁稍厚，分枝多，直徑可達(dá)2.2～3.2 μm（圖2-B， E）。擔(dān)孢子由生殖菌絲上的擔(dān)子產(chǎn)生，擔(dān)孢子棍棒型至橢圓形，無(wú)色，薄壁，光滑，大小為4.3～6.0 μm × 2.4～3.1 μm（n=30）（圖2-C，F(xiàn)）。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征[16-18]，該病原菌初步鑒定為Phlebiopsis sp.。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

將YC1-1的rDNA-ITS和nLSU基因序列分別上傳至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得登錄號(hào)（表1）。同時(shí)，利用NCBI中Blast程序?qū)ι鲜鲂蛄蟹謩e進(jìn)行同源相似性比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)rDNA-ITS和nLSU序列分別與NCBI中的Phlebiopsis crassa菌株（菌株號(hào)He 5866）的rDNA-ITS和nLSU序列（登錄號(hào)分別為：MT386376、MT447408）的相似度分別為99.67 %、99.93 %。從NCBI中分別下載與YC1-1親緣相近的種的rDNA-ITS和nLSU序列，將2種序列合并后，以Phanerina mellea的相應(yīng)序列合并后作為外群，采用MEGA 7.0軟件構(gòu)建ML（maximum likelihood）系統(tǒng)發(fā)育樹。各參考菌株編號(hào)、地理分布及GenBank登錄號(hào)如表1所示。結(jié)果顯示YC1-1與P. crassa聚為1簇，bootstrap支持率為92 %（圖3）。結(jié)合形態(tài)特征及分子鑒定結(jié)果，將迎春花葉枯病的病原菌鑒定為P. crassa，這是世界上首次報(bào)道Phlebiopsis crassa引起迎春花葉枯病。

3 結(jié)論與討論

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于迎春花病害的文章相對(duì)較少，僅Xu等[19]報(bào)道由植原體引起的迎春花叢枝病和方天露等[20]報(bào)道由果生炭疽菌（Colletotrichum fructicola）引起的迎春花枝條枯死，而未見葉枯病報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)病原菌YC1-1的致病性檢測(cè)、形態(tài)學(xué)觀察、以及分子生物學(xué)鑒定，明確引起迎春花葉枯病的病原菌為一種木腐真菌Phlebiopsis crassa。

木腐真菌主要存在于各種枯死的樹干、倒木、及人工木制品上，通過(guò)分泌產(chǎn)生各種生物酶降解木材中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，在森林生態(tài)系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用，是生態(tài)系統(tǒng)重要的分解者。但同時(shí)它們也能引起林木病害，造成林業(yè)生產(chǎn)上的損失。林木腐朽真菌作為食用、藥用、工業(yè)工程用等資源，也有著重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

P. crassa屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、傘菌綱（Agaricomycetes）、多孔菌目（Polyporales）、平革菌科（Phanerochaetaceae）、Phlebiopsis屬[16]。Phlebiopsis屬目前共有19種，且在全球廣泛分布[17]。木腐真菌能夠以木材為生長(zhǎng)基質(zhì)，能將木材中的木質(zhì)素、纖維素和半纖維素轉(zhuǎn)化為自身可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可使木材顏色發(fā)生改變，產(chǎn)生環(huán)狀條紋，從而導(dǎo)致樹木發(fā)生腐朽，對(duì)木材力學(xué)性能具有極大的破壞作用[21-23]。木材腐朽包括立木腐朽和木材腐朽2大類：立木腐朽作為病原菌寄生于活體樹木上引起林木病害，造成林業(yè)損失;木材腐朽指生長(zhǎng)在枯死的樹干、倒木、及人工木制品上的腐朽菌，主要營(yíng)腐生生活。除此之外，還有許多真菌屬于兼性腐生菌和兼性寄生[24，25]，推測(cè)本研究中的P. crassa為寄生于迎春花上的病原菌。

本研究中的致病性實(shí)驗(yàn)接種P. crassa 病原菌3 d后，迎春花同樣產(chǎn)生了環(huán)狀條紋的病斑，并且在致病性試驗(yàn)中，可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)病原菌孢子液接種產(chǎn)生的病斑顏色呈黑色，而經(jīng)病原菌菌絲塊接種產(chǎn)生的病斑顏色呈黃褐色。根據(jù)Daniela等[26]關(guān)于水分含量變化對(duì)木腐真菌色素形成的研究中可以推測(cè)，孢子液中的水分可能使色素含量增加。

目前國(guó)內(nèi)外尚未有關(guān)于P. crassa作為植物病害致病菌的報(bào)道，因此這是我國(guó)乃至全世界首次報(bào)道該菌在迎春花上引起的病害。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，湖邊、河邊迎春花發(fā)病率較高，推測(cè)該病原菌在濕度較大環(huán)境下更容易使迎春花發(fā)病。

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