白酒固態(tài)釀造中酵母種群結(jié)構(gòu)和生態(tài)環(huán)境多樣性變化規(guī)律的研究進(jìn)展

任妍菱 林 巧 趙樹(shù)東 楊柳煒 張婷婷 余 鑫

（西昌學(xué)院，四川西昌 615000）

目前，關(guān)于白酒發(fā)酵過(guò)程中酵母種類(lèi)和酵母總數(shù)變化的報(bào)道中，酵母生態(tài)分布的變化和整個(gè)釀造過(guò)程中的種群結(jié)構(gòu)尚不十分清楚。研究仍處于起步階段，白酒釀造是一種自然的多細(xì)菌固態(tài)發(fā)酵過(guò)程，酵母種群的挖掘有助于白酒固態(tài)發(fā)酵微生物的研究，對(duì)白酒質(zhì)量、安全的提升具有重要意義；研究釀造環(huán)境中微生物組成結(jié)構(gòu)有助于解析完全微生物的真實(shí)物種信息。同時(shí)，也能具體了解影響白酒發(fā)酵的環(huán)境微生物，為進(jìn)一步分析酵母功能和選擇適合白酒釀造的優(yōu)良酵母菌種奠定了基礎(chǔ)。

1 酵母種群結(jié)構(gòu)

酵母是白酒生產(chǎn)過(guò)程中的主要功能微生物，如在淀粉糖化、酒精生成、芳香物質(zhì)形成、糟醅發(fā)酵、成品質(zhì)量等方面都起到重要作用。

羅方雯等研究結(jié)果表明，在醬香型白酒釀造過(guò)程中分離出的酵母包括復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、紅酵母屬（Rhodotorula）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces）、柯達(dá)酵母屬（Kodamaea）、拜耳結(jié)合酵母屬（Zygosaccharomyces）、南極假絲酵母屬（Pseudozyma sp）各1 種，隱球菌屬（Cryptococcus）、德巴利酵母屬（Torulaspora）、釀酒酵母屬（Saccharomyces）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）各2 種，絲孢酵母屬（Trichosporon）3 種，維克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）4 種，畢赤酵母屬（Pichia/Hyphopichia）6 種，假絲酵母屬等，得出釀造環(huán)境的特征性?xún)?yōu)勢(shì)酵母為W.anomalus、S.cerevisiae 和H.burtonii；醬香型大曲的特征性?xún)?yōu)勢(shì)酵母為W.anomalus 和S.fibuliquras，明確了醬香型大曲的優(yōu)勢(shì)酵母菌結(jié)構(gòu)。

李增勝等在研究清香型白酒的發(fā)酵過(guò)程中發(fā)現(xiàn)酒中的酵母主要是釀酒酵母屬，具有最強(qiáng)的酒精生產(chǎn)能力；其次是具有較弱酒精生產(chǎn)能力的漢遜酵母、假絲酵母菌和擬內(nèi)孢霉；此外還有少量的畢赤酵母和產(chǎn)膜酵母。其中，釀酒酵母、漢遜酵母和內(nèi)生孢子擬內(nèi)孢霉均為無(wú)孢菌屬，釀酒酵母和內(nèi)生菌屬；假絲酵母是鏈球菌科的一種，屬于半已知真菌。

崔小亮等研究結(jié)果表明，在濃香型白酒的生產(chǎn)過(guò)程中可以分離培養(yǎng)的酵母類(lèi)型包括釀酒酵母、庫(kù)氏畢赤酵母、海洋嗜殺酵母、扣囊復(fù)膜酵母菌、拜氏接合酵母、半乳糖酵母、洛倫隱球菌。功能性酵母篩選結(jié)果表明，S.fibuligera WY 5-1 和S.cerevisiae WY 3-2 具有良好的乙醇生產(chǎn)特性。巴斯德畢赤氏酵母WY 6-3 和WY 9-2 具有良好的酯生產(chǎn)特性，溫度和pH 的耐受性為濃香型白酒在工業(yè)生產(chǎn)中選擇菌株提供了更多可能性。

2 酵母種群主要研究方法

2.1 傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法

傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法中最常見(jiàn)的是微生物平板培養(yǎng)法。該方法是利用營(yíng)養(yǎng)成分不同的固體培養(yǎng)基分離培養(yǎng)可培養(yǎng)的微生物，并根據(jù)菌落的數(shù)量和形態(tài)確定微生物的數(shù)量和類(lèi)型。分離和培養(yǎng)微生物的平板稀釋法是最普遍的操作之一，通常分為稀釋、接種、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)幾個(gè)階段。但該方法存在許多不足，比如在選擇固體培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件上都存在一定的局限性。

2.2 分子生物學(xué)技術(shù)

2.2.1 真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)研究技術(shù)

在研究微生物環(huán)境和生態(tài)學(xué)方面，微生物群落的多樣性是研究重點(diǎn)。目前，宏基因組學(xué)在微生物多樣性研究中的應(yīng)用已經(jīng)引起了更多科研人員的關(guān)注。然而，對(duì)于同樣的樣本，宏基因組學(xué)研究通常占細(xì)菌種群的大部分，而真菌和其他微生物種類(lèi)則遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后。這對(duì)某些研究區(qū)域具有局限性，例如在釀酒過(guò)程中對(duì)微生物種群每個(gè)時(shí)期的探討。細(xì)菌的作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于真菌，對(duì)酒的質(zhì)量影響更大。因此，利用真菌獨(dú)特的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列作為目標(biāo)序列是富集復(fù)雜樣品中真菌DNA 的有利措施。

復(fù)合標(biāo)簽技術(shù)及其在多樣本真菌高通量測(cè)序中的應(yīng)用，可以提高樣本流速，有效降低高通量測(cè)序的成本，有效豐富樣本中的真菌種群。真菌種群為研究真菌多樣性提供了一種高通量的分析方法。

2.2.2 PCR-DGGE 技術(shù)

在分子生物學(xué)上，PCR-DGGE 技術(shù)是運(yùn)用率最高的分析方法之一，作為研究環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的重要手段，已被廣泛用于海洋和土壤微生物的研究當(dāng)中。該技術(shù)準(zhǔn)確度高、效能高、操作簡(jiǎn)單，能清晰地說(shuō)明樣本中微生物的多樣性，對(duì)微生物動(dòng)態(tài)群落變化進(jìn)行更加深入的了解。DGGE 方法使用聚丙烯酰胺中形成變性梯度和特異性引物，經(jīng)PCR 擴(kuò)增后得到長(zhǎng)度一樣的靶片段。進(jìn)行電泳時(shí)，GC 含量較低，變性后，以不同的遷移速率分離出不同GC 含量的核酸。

PCR-DGGE 技術(shù)的原理是從環(huán)境樣本中提取出DNA，通過(guò)PCR 的擴(kuò)增獲得更多相同長(zhǎng)度、不同序列的基因片段。DNA 中4 個(gè)堿基排列方式和組成的差異會(huì)導(dǎo)致序列不一樣的雙鏈DNA 分子融化時(shí)冷熱程度有所差異，然后通過(guò)梯度凝膠電泳變性時(shí)構(gòu)成不同的條帶，并且與DGGE 指紋圖譜進(jìn)行比較，可以得到微生物的群落結(jié)構(gòu)的總體資料。

2.2.3 高通量測(cè)序技術(shù)

高通量測(cè)序技術(shù)是可以進(jìn)行深刻而透徹測(cè)序的下一代測(cè)序方法，可以同時(shí)分析幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)個(gè)DNA 分子的序列，通常是非常短的長(zhǎng)度，允許對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行精確深入的研究。當(dāng)前這種測(cè)序技術(shù)設(shè)計(jì)出了第二代和單分子測(cè)序技術(shù)，主要是Roche 454 的GSFLX 平臺(tái)，ABI 的SOLID 測(cè)序平臺(tái)和Illumina 的SolexaGenomeAria。1yzer 測(cè)序平臺(tái)。第二代測(cè)序技術(shù)具有高通量、重復(fù)性好、精確度高、無(wú)需構(gòu)建文庫(kù)、無(wú)克隆錯(cuò)誤、最大限度地節(jié)省人力和物力等優(yōu)點(diǎn)。其中，Roche 454的原理是依靠酶級(jí)聯(lián)生物發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行DNA 序列分析。DNA 聚合酶、三磷酸腺苷、熒光素酶和二磷酸酶共同作用，聚合每個(gè)引物的dNTP 并發(fā)出熒光信號(hào)。對(duì)熒光信號(hào)的存在情況以及強(qiáng)度大小的檢測(cè)，DNA 序列可以得到確定。Solexa 測(cè)序原理是橋式PCR，合成測(cè)序和可逆終結(jié)者。dNTP 與熒光標(biāo)記的dNTP 通過(guò)酶催化串聯(lián)反應(yīng)直接連接，在合成或連接過(guò)程中形成互補(bǔ)鏈。將捕獲的光信號(hào)轉(zhuǎn)換成序列峰，得到互補(bǔ)的鏈序列信息。Abi-solid 測(cè)序的原理是根據(jù)大規(guī)模的磁珠平行克隆和DNA 連接的測(cè)序，通過(guò)連接酶檢測(cè)寡核苷酸上的熒光團(tuán)。

3 環(huán)境對(duì)酵母的影響

環(huán)境的改變會(huì)導(dǎo)致酒醅中初始微生物結(jié)構(gòu)的差異，進(jìn)而導(dǎo)致微生物種群演替差異，其中酵母的種群結(jié)構(gòu)也會(huì)受到影響。

3.1 高溫環(huán)境

對(duì)于酵母耐熱機(jī)制的研究，早期主要集中在比較生物學(xué)上。酵母質(zhì)膜的流動(dòng)性在高溫下會(huì)受到影響。當(dāng)溫度太高時(shí)會(huì)造成膜紊亂以及造成蛋白質(zhì)的變性，抑制糖酵解并增加突變。同時(shí)，質(zhì)膜的滲透性得到增加，從而質(zhì)子流增加。高溫對(duì)酵母細(xì)胞也有。溫度越高，越容易引起酵母過(guò)早衰老和死亡，從而使細(xì)菌占主導(dǎo)地位。溫度通常會(huì)導(dǎo)致酵母細(xì)胞中各種成分的變化，例如脂肪酸、磷脂、麥角固醇等。

3.2 低溫環(huán)境

在溫度較低時(shí)酵母具有更高的糖吸收能力，緩慢的糖酵解作用，使海藻糖、糖原和其他儲(chǔ)備糖的合成增加，HOG-MAPK 途徑被激活，甘油產(chǎn)量增加。溫度過(guò)低時(shí)會(huì)導(dǎo)致酵母對(duì)氮喜好程度的改變，使NCR 系統(tǒng)的效率下降，并影響可滲透酶的活性和氮的吸收。降解代謝途徑在低溫發(fā)酵中期和后期涉及到氨基酸代謝的基因表達(dá)會(huì)增強(qiáng)。低溫主要通過(guò)減少鏈長(zhǎng)和增加中鏈脂肪酸來(lái)改善膜的流動(dòng)性，從而影響酵母細(xì)胞膜的脂肪酸組成。低溫對(duì)氮代謝、酵母糖代謝和脂質(zhì)代謝的影響可以更好地改善酒的感官品質(zhì)。

3.3 耐酸環(huán)境

酯的生產(chǎn)能力是判斷酵母性能的重要指標(biāo)，特別是在低pH 值的環(huán)境中，具有優(yōu)異性能的細(xì)菌可以發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)。隨著醋酸發(fā)酵，醋醅酸度和溫度持續(xù)上升，酒精含量不斷下降。酸度阻礙酵母的生長(zhǎng)和發(fā)酵。

3.4 無(wú)機(jī)鹽和礦物質(zhì)對(duì)酵母的影響

在生長(zhǎng)過(guò)程中，微生物需要無(wú)機(jī)鹽來(lái)保持細(xì)胞的滲透壓，各種礦物質(zhì)元素，如鈣、鐵、鋅、錳等對(duì)酶的功能和酶活性也有重要影響。華艷艷等研究表明，向種子培養(yǎng)基中加入錳可以改變細(xì)胞的形態(tài)，可以提高紅發(fā)夫酵母中D-葡萄糖苷酶的活性；向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.1 g/L Mn2+可顯著促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和蝦青素合成。吳澤柱等試驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)化培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分可以有效提高酵母的發(fā)酵能力。邊芙蓉等研究表明，添加一定量金屬離子對(duì)增加谷胱甘肽產(chǎn)量有很好的作用。

3.5 培養(yǎng)基中各營(yíng)養(yǎng)組分對(duì)酵母發(fā)酵的影響

邢建宇等研究表明，蛋白胨和酵母膏顯著提高了釀酒酵母細(xì)胞密度、乙醇耐受性和發(fā)酵能力，其中酵母提取物的作用更大。最終，在培養(yǎng)時(shí)通過(guò)乙醇沖擊試驗(yàn)，得出酵母提取物含量高的培養(yǎng)基能夠有效復(fù)原酵母對(duì)乙醇沖擊的生長(zhǎng)和繁殖能力，有效適應(yīng)高濃度酒精環(huán)境。

4 不同酵母之間的相互作用

4.1 釀酒酵母和異常漢遜酵母兩者之間的相互作用

顏兵等通過(guò)研究證明釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物抑制了異常漢遜酵母的生長(zhǎng)發(fā)育。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在與釀酒酵母混合培養(yǎng)期間，異常漢遜酵母被顯著抑制。通過(guò)對(duì)營(yíng)養(yǎng)液、酒精、pH 等因素的研究，得出在無(wú)細(xì)胞濾液中，異常漢遜酵母的生長(zhǎng)發(fā)育被顯著抑制，但是釀酒酵母的生長(zhǎng)一切正常，這說(shuō)明異常漢遜酵母的生長(zhǎng)和發(fā)育會(huì)受到釀酒酵母代謝產(chǎn)物的抑制作用，而不受其他因素的影響。

4.2 釀酒酵母和地衣芽孢桿菌二者作用

凌杰等研究結(jié)果表明，釀酒酵母對(duì)地衣芽孢桿菌的生長(zhǎng)存在一定的抑制性，而高溫會(huì)削弱釀酒酵母的抑制作用。原因如下：首先，地衣芽孢桿菌的生長(zhǎng)會(huì)受到釀酒酵母產(chǎn)生的一些大分子蛋白質(zhì)的影響。其次，因?yàn)獒劸平湍冈谏L(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生酸，從而降低了環(huán)境的pH 值，對(duì)地衣芽孢桿菌的生長(zhǎng)有一定抑制。當(dāng)沒(méi)有酵母細(xì)胞在環(huán)境中存活時(shí)，地衣芽孢桿菌會(huì)讓這種抑制作用逐漸減弱并趨于正常生長(zhǎng)狀態(tài)。這一發(fā)現(xiàn)在有效控制白酒的產(chǎn)量和質(zhì)量方面起著重要作用。

4.3 乳酸菌與酵母菌之間的作用

熊君燕等研究結(jié)果表明，以還原糖消耗率作為酵母菌產(chǎn)乙醇和乳酸菌產(chǎn)有機(jī)酸的主要指標(biāo)，在乳酸菌和酵母菌的共培養(yǎng)條件下，乳酸菌對(duì)3 種酵母菌生長(zhǎng)有不同程度的抑制，對(duì)S.Cerevisiae YJ1 產(chǎn)乙醇抑制作用最大，對(duì)C.aaseriMJ7 和P.kudriavzeviiMJ14 產(chǎn)乙醇影響很小。對(duì)乳酸菌而言，P.KiavzeviiMJ14 對(duì)乳酸菌具有抑制作用，而對(duì)P.sp.JYA1 和L.Plantarum JMRS4 產(chǎn)乙酸起促進(jìn)作用。就代謝產(chǎn)物而言，L.1actisJMRS1-2 和L.plantarum JMRS4 分別是產(chǎn)乙酸和乳酸的主要菌株。

4.4 釀酒酵母和畢赤酵母之間的作用

陳景樺等研究成果表明，在混合發(fā)酵過(guò)程中，釀酒酵母和畢赤酵母的酯酶活性得到適當(dāng)提高。當(dāng)白酒中酯類(lèi)的含量增加時(shí)，白酒的香氣會(huì)增強(qiáng)。當(dāng)巴斯德畢赤酵母和釀酒酵母在混合酒精發(fā)酵過(guò)程中，琥珀酸、乙酸、甘油和揮發(fā)性酸的產(chǎn)生與酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)呈正相關(guān)。當(dāng)酒精發(fā)酵過(guò)程中的酵母數(shù)達(dá)到平衡階段時(shí)（6 d～10 d），混合發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的甘油、琥珀酸、乙酸和揮發(fā)酸含量最高。與釀酒酵母相比，混合發(fā)酵過(guò)程中的乳酸和琥珀酸含量基本保持不變，揮發(fā)酸含量呈下降趨勢(shì)，但甘油含量明顯增加，這表明釀酒酵母和發(fā)酵畢赤酵母混合發(fā)酵對(duì)酒的酸度沒(méi)有顯著影響，但混合過(guò)程中提高酒的質(zhì)量可以通過(guò)增加甘油含量來(lái)實(shí)現(xiàn)。

5 酵母菌演替規(guī)律

楊建剛等研究，得出的結(jié)論是，第0 天，酒窖中的主要酵母類(lèi)型為C.rugopelliculosa、S.termentans、N.castellii、T.delbrueckii 和S.cerevisiae；在第4 天，酒窖中的酵母數(shù)量非常豐富，其中占優(yōu)勢(shì)的酵母為T(mén).delbrueckii，N.castellii，S.cerevisiae 和P.membranifaciens。在第8 天，酵母數(shù)量增多，但是酵母的種類(lèi)逐漸減少。酵母的主要類(lèi)型是釀酒酵母，而C.humilis 和K.exigua 是主要的酵母。經(jīng)過(guò)12 d 的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)隨著酒窖環(huán)境的變化，酵母菌的數(shù)量和類(lèi)型同時(shí)減少。在此階段，酒窖中的酵母主要是卡氏酵母和釀酒酵母。到20 d～30 d，隨著酒窖pH 值的降低和乙醇含量的增加，釀酒酵母已成為酒窖中的主要菌株。在第44 d，發(fā)酵已經(jīng)結(jié)束，但酒窖中的酵母數(shù)量很少，酵母種類(lèi)趨于多樣化。

6 結(jié)論

目前，白酒的生產(chǎn)仍采用傳統(tǒng)發(fā)酵工藝，這種生產(chǎn)方法具有很強(qiáng)的不確定性和經(jīng)驗(yàn)性，不能準(zhǔn)確地控制白酒的生產(chǎn)。如何在傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝的基礎(chǔ)上建立穩(wěn)定的生產(chǎn)安全保證體系，并且要維持“手工創(chuàng)造的高貴品質(zhì)”，建立完整穩(wěn)定的質(zhì)量安全體系，是目前所有白酒生產(chǎn)企業(yè)面臨的困難和機(jī)遇。因此，研究固態(tài)發(fā)酵白酒中酵母菌種群結(jié)構(gòu)和多樣性的變化規(guī)律，利用酵母菌種群的優(yōu)勢(shì)對(duì)提高白酒的質(zhì)量和品質(zhì)，提高低濃度白酒的穩(wěn)定性以及確定白酒酒齡等具有重要意義。