水稻生物硝化抑制劑1,9-癸二醇的定量方法優(yōu)化①

張曉楠，陸玉芳，楊 婷，施衛(wèi)明*

水稻生物硝化抑制劑1,9-癸二醇的定量方法優(yōu)化①

張曉楠1,2，陸玉芳1，楊 婷1,2，施衛(wèi)明1*

(1 土壤與農業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室(中國科學院南京土壤研究所)，南京 210008；2 中國科學院大學，北京 100049)

選取水稻生物硝化抑制劑1,9-癸二醇作為研究對象，對比旋轉蒸發(fā)法和固相萃取法對該物質的回收率(80.17% 和82.97%)及效率，確定固相萃取法為水稻根系分泌物收集液的前處理方法，且該方法具有高效省時的特點。在氣相色譜(GC)分析方法的基礎上，對衍生化試劑和衍生化條件進行了優(yōu)化，結果表明，使用N,O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)作為1,9-癸二醇的衍生化試劑時，衍生化產物具有較高的響應值；衍生化過程中加入200 μl BSTFA，在60 ℃條件下反應30 min時，1,9-癸二醇經過GC方法得到的分析效果最好；且本方法儀器的日內精密度為2.18%，日間精密度為3.01%，線性方程為= 34.77–0.90，= 0.999 3，最小檢出限為0.05 μg/ml，此方法可為水稻根系分泌物中生物硝化抑制劑1,9-癸二醇的定量研究提供參考。

硝化作用；水稻；1,9-癸二醇；生物硝化抑制劑；定量

為了維持和提高農作物的產量和品質，人類在農業(yè)生態(tài)系統中施入大量氮肥。銨態(tài)氮肥是氮肥投入的主要形式，土壤中的NH4+通過硝化作用轉化為硝酸鹽(NO– 3)，易通過淋溶等形式流失進入水體，造成水體富營養(yǎng)化、地下水硝酸鹽污染；NO– 3 還可以通過反硝化作用轉化為N2、NO和N2O等氣體排放，導致農田氮素大量損失，作物氮素利用效率下降[1-3]。為了有效抑制農田土壤硝化過程，農業(yè)生產中常使用雙氰胺(DCD)、2-氯-6-三氯甲基吡啶(Nitrapyrin)等合成硝化抑制劑[4-6]，但該類物質具有價格過高、使用繁瑣、易造成地下水污染等局限性[7-8]。

近年來研究發(fā)現，植物根系能夠分泌抑制土壤亞硝化細菌的物質，統稱為生物硝化抑制劑(biological nitrification inhibitors, BNIs)[9-12]，此類物質具有成本低、環(huán)境友好等優(yōu)點。本課題組前期從糧食作物水稻的根系分泌物中首次鑒定到脂肪醇類化合物1,9-癸二醇，該物質在亞硝化細菌培養(yǎng)與土壤培養(yǎng)試驗中均具有可觀的硝化抑制能力，并且研究發(fā)現該物質分泌量與水稻的銨吸收效率和銨態(tài)氮偏好呈正相關，在提高作物氮素利用效率、控制農田土壤硝化作用過程中具有較強的理論研究意義和實際應用價值[13-15]。

水稻根系分泌BNI 1,9-癸二醇具有品種差異性，其分泌量一般在34 ~ 477 ng/(g·d)，根系分泌物收集液中該物質含量較低，因此建立一種高效可靠的物質分離及測定方法對于1,9-癸二醇的定量十分重要，能為今后1,9-癸二醇根系釋放特征的研究和1,9-癸二醇根系分泌的遺傳位點分析提供理論支撐[13-14]。目前，植物根系BNI研究中常采用水培靜置收集體系收集植物的根系分泌物[9-13]，并且收集液體積較大(一般每個樣品體積為0.5 ~ 1 L)，在研究中面臨著大量樣品前處理的問題。常用的樣品前處理技術有旋轉蒸發(fā)[9-13]和固相萃取(SPE)[16-20]，旋轉蒸發(fā)法能夠快速高效地處理有機樣品，但對于水樣中物質的濃縮耗時較長；而固相萃取法可以高效快速富集水樣中目標物質，并且可同時處理多個大量水樣。前人的研究中主要采用旋轉蒸發(fā)法對水稻根系分泌物進行前處理，用于挖掘水稻生物硝化抑制劑及測定小批量樣品中1,9-癸二醇的含量，但該方法對于多品種、大批量根系分泌物的前處理而言存在著工作量大、耗時長等局限性，因此本研究對比了兩種方法對水樣中的1,9-癸二醇的富集效率，以期選擇一種快速、可靠的根系分泌物收集液前處理方法。Sun 等[13]采用氣相色譜對1,9-癸二醇進行定量分析，但由于1,9-癸二醇揮發(fā)性低、難于氣化，所以在氣相色譜分析之前，一般會對該類物質進行甲基硅烷化處理，從而提高此類物質的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性[21-22], 前期試驗中1,9-癸二醇的衍生化反應采用了常用的硅烷化試劑BSTFA，添加量為500 μl，在60 ℃條件下反應120 min，然而研究發(fā)現衍生化試劑的選擇[23-24]、衍生化試劑的添加量[25-26]、衍生化反應的溫度和時間[27-29]的不同都會導致衍生化方法在靈敏度和可靠性方面產生較大差異，因此本研究通過對比不同衍生化試劑的效率，選擇合適的衍生化試劑，系統優(yōu)化了衍生化反應的條件，有助于對水稻根系分泌物中1,9-癸二醇的定量分析研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑材料與儀器

化學標準品1,9-癸二醇，定制于公司，常溫為黏稠狀液態(tài)物質；衍生化試劑N,O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA，SUPELCO)和N,O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(含1% 三甲基氯硅烷)(BSTFA+1% TMCS，SUPELCO)；有機試劑甲醇、丙酮、正己烷均為色譜純，訂購于上海安譜實驗科技股份有限公司。

供試水稻(L.)為武運粳7，選育于江蘇省常州市武進區(qū)農業(yè)科學研究所。

Agilent7890氣相色譜儀(GC，包括HP7890氣相色譜、HP7683自動進樣器)；烘箱(CIMO，DHG- 9053BS-Ⅲ)；防腐型12位氮吹儀(EFAA-DC12-RT，ANPEL)；旋轉蒸發(fā)儀(Eyela，N-1100D-WD，Japan)；12位固相萃取真空裝置(SBEQ-CG1012，CNW，Germany)。

1.2 標準溶液的配制

用HPLC甲醇準確配制10.00 μg/ml 的1,9-癸二醇標準溶液，依次取0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00 ml的標準溶液于10 ml容量瓶，最后用HPLC甲醇定容，即為0.10 ~ 5.00 μg/ml的1,9-癸二醇標準使用液。

1.3 1,9-癸二醇濃縮方法的比較

取1 ml 10.00 μg/ml 1,9-癸二醇標準溶液溶解于1 L 含有0.10 mmol/L CaCl2的Milli-Q水中，配制成10.00 μg/L樣品溶液6份；將樣品分為兩組，其中一組采用旋轉蒸發(fā)儀在40 ℃蒸干，另一組液體樣品用大容量采樣管連接至12位固相萃取裝置，用17% 含碳量的C18固相萃取小柱(1 g/ml，CNW)富集樣品中的1,9-癸二醇，將殘余物溶解于1 ml HPLC甲醇中，參照Sun等[13]研究中衍生化方法，加入500 μl衍生化試劑BSTFA，烘箱加熱60 ℃，反應120 min后，產物用200 μl正己烷溶解，GC測定。

1.4 1,9-癸二醇衍生化試劑的選擇及衍生化條件的優(yōu)化

參照Sun等[13]的方法，依次取1 ml 10.00 μg/ml 1,9-癸二醇標準溶液于不同螺口玻璃試管中，室溫下氮吹至干，加入500 μl N,O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)或者500 μl N,O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(含1% 三甲基氯硅烷) (BSTFA+1% TMCS)，在60 ℃條件下衍生化反應120 min，衍生化產物溶解于200 μl HPLC正己烷中，GC測定。

比較衍生化試劑量、反應時間和反應溫度對1,9-癸二醇衍生化效果的影響，在以下不同條件下進行衍生化反應：添加50、100、200、400、500 μl衍生化試劑BSTFA，衍生化時間烘箱加熱60 ℃，反應120 min；衍生化試劑BSTFA加入量為200 μl，烘箱加熱60 ℃時，衍生化反應時間分別為30、45、60、90、120 min；衍生化試劑BSTFA加入量為200 μl，衍生化時間為30 min時，衍生化反應溫度分別為烘箱加熱60 ℃和80 ℃。產物溶解于200 μl HPLC正己烷中，GC測定。

1.5 水稻根系分泌物中1,9-癸二醇的測定

參照Sun等[13]的根系分泌物收集方法，將30株6周苗齡的水稻置于裝有1 L 0.10 mmol/L CaCl2收集液的玻璃燒杯，將另外30株6周苗齡的水稻置于裝有1 L 1 mmol/L NH4Cl 和0.10 mmol/L CaCl2收集液的玻璃燒杯，每個處理3個重復，靜置收集24 h后，采用12位固相萃取裝置富集根系分泌物收集液中的1,9-癸二醇，將殘余物溶解于甲醇中，按照上述優(yōu)化后的衍生化方法處理根系分泌物的甲醇提取物，GC測定。

1.6 氣相色譜儀測定條件

氣相色譜儀采用裝備FID檢測器的Agilent 7890工作站，主要運行參數如下：毛細管色譜柱HP-5 (25 m×0.2 mm×0.33 μm)；進樣口溫度250 ℃，不分流進樣；初始柱溫為80 ℃，以20 ℃/min的速率升至250 ℃，然后以6 ℃/min的速率升至300 ℃；載氣為氦氣，流速為1.0 ml/min；進樣量為2 μl。

1.7 數據處理

GC數據計算通過Agilent ChemStation B.04.03完成；實驗數據通過 Microsoft Excel 2010 和 SPSS 18.0 進行處理和統計分析(<0.05)；利用單因素方差分析(One-way ANOVA)對不同處理間差異顯著性進行檢驗，然后用Duncan法進行多重比較(<0.05)；使用Origin 8.1繪制圖表，圖表中數據均為平均值± 標準誤。

2 結果與討論

2.1 1,9-癸二醇濃縮方法的選擇

目前常用的植物根系分泌物收集液的前處理方法是旋轉蒸發(fā)法去除樣品中的水分[9-13]，為了進一步去除樣品中的有可能影響后續(xù)GC測定分析的無機鹽離子，也有學者將旋轉蒸發(fā)得到的甲醇樣品重新用水稀釋，然后用C18固相萃取小柱進行去離子鹽處理[30]。本研究將1,9-癸二醇標準溶液稀釋至1 L水溶液中，然后按照根系分泌物樣品前處理過程進行過濾和濃縮，比較旋轉蒸發(fā)法和固相萃取法兩種前處理方法對1,9-癸二醇富集效率的影響。表1 結果表明，旋轉蒸發(fā)法和C18小柱固相萃取法都能有效保留目標物質1,9-癸二醇，二者的回收效率分別為80.17% 和82.97%，相對標準偏差分別為3.15% 和4.02%，兩種前處理方法對于1,9-癸二醇的富集效果并無顯著性差異。然而對于水相收集液而言，旋轉蒸發(fā)法將樣品蒸干耗時較長，而固相萃取法能夠同時處理多個大容量液體樣品，大大縮短了樣品前處理過程，同時能夠減少樣品長時間儲存導致的實驗誤差[16-20]。以1 L根系分泌物樣品為例，旋轉蒸發(fā)法處理1個樣品需要大概6 h，而在同樣的時間，用12位固相萃取裝置可以同時處理12個樣品。因此對于樣品中目標物質1,9-癸二醇的純化濃縮，選用C18固相萃取法替代旋轉蒸發(fā)法能加快實驗的進度，可有效加大實驗室檢測樣品的樣品量，提高實驗效率[31]。

表1 10 μg/ml 1,9-癸二醇標準溶液在不同預處理方法下的回收率比較(n = 3)

注：SPE：固相萃取，采用C18小柱 (17% 含碳量，1 g/6 ml，CNW)。

2.2 1,9-癸二醇衍生化條件的優(yōu)化

由于根系分泌物中1,9-癸二醇在測定時影響因素多種多樣，故主要從以下幾個方面來對其進行優(yōu)化。

2.2.1 衍生化試劑的選擇 水稻源硝化抑制物質1,9-癸二醇是一種脂肪醇類物質，具有兩個羥基官能團，直接進行GC分析會導致檢測靈敏度和結果的可靠性降低[32-33]。而衍生化反應能夠用較少極性的三甲基硅烷(TMS)取代活性羥基中的氫原子，從而降低分析物的極性，提高其揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性[21-22, 27-28]。在1,9-癸二醇的衍生化過程中，常用的衍生化試劑為N,O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)[13-14]，但有報道指出將BSTFA與TMCS按照99:1混合能夠提高反應產率[26-27]；因此本試驗中采用BSTFA和BSTFA+ 1% TMCS兩種衍生化試劑對1,9-癸二醇進行甲基硅烷化處理，GC測定發(fā)現該物質在6.92 min出峰，圖1結果表明，分別用BSTFA和BSTFA+1% TMCS兩種衍生化試劑對1,9-癸二醇進行衍生化后，用BSTFA作為衍生化試劑時的產物峰面積顯著高于用BSTFA+1% TMCS作為衍生化試劑時的產物響應值。說明對于1,9-癸二醇的衍生化，TMCS的添加并不能提高其衍生化效率，故在1,9-癸二醇的定量分析時選擇BSTFA作為衍生化試劑。

(圖中小寫字母不同表示不同處理間差異達P<0.05顯著水平，下同)

2.2.2 1,9-癸二醇衍生化反應條件的優(yōu)化 除衍生化試劑的種類，衍生化反應的效果還受到衍生化試劑量、反應時間以及反應溫度等方面因素的影響[23-29]。比較加入50、100、200、400、500 μl BSTFA對1,9-癸二醇衍生效果的影響，結果如圖2所示，添加不同體積衍生化試劑BSTFA，1,9-癸二醇的衍生化產物的響應值有顯著差異。其中添加200 μl BSTFA時，產物的峰面積最大；添加50和100 μl時，響應值較低，可能是由于衍生化試劑量不足導致了衍生化反應不完全；而添加400和500 μl BSTFA時，衍生化產物的響應值反而降低，可能是由于衍生化試劑過多，結束反應后氮吹除去多余衍生化試劑的時間過長，造成了產物部分損失；同時，樣品量過大時，成本也是考慮因素之一，降低衍生化試劑的添加量，能夠直接降低衍生化成本，并且可以獲得較好的衍生化效果，因此，衍生化反應過程中添加200 μl BSTFA較合適。

圖2 不同衍生化試劑BSTFA添加量對1,9-癸二醇衍生化產物響應值的影響(n = 3)

分別向裝有標準物質1,9-癸二醇的螺口試管中加入200 μl BSTFA衍生化反應30、45、60、90、120 min，比較5個不同的衍生時間對衍生效果的影響。結果如圖3所示，1,9-癸二醇的衍生化產物在反應30 min 時已經有較高的響應值，而隨著反應時間(45、60、90、120 min)的增加，產物的峰面積并無顯著變化。該結果與雌激素類物質、煙草中的游離糖類、藥用植物長春花中的五環(huán)三萜類化合物的衍生化時間一致[21, 27, 34-35]，說明衍生化反應進行迅速，在30 min時已經反應完全，增加反應時間并不能提高衍生化產物的響應值。因此，1,9-癸二醇衍生化反應中衍生化時間控制在30 min即可。

圖3 不同衍生化時間對1,9-癸二醇衍生化產物響應值的影響(n = 3)

調節(jié)烘箱溫度分別至60 ℃、80 ℃，比較兩個衍生化溫度對1,9-癸二醇標樣衍生化效果的影響，圖4結果表明當反應溫度設定為60 ℃時，1,9-癸二醇衍生化產物的響應值約為390，而升高反應溫度至80 ℃時，衍生化產物的響應值顯著降低至260左右，這說明80 ℃衍生反應可能不完全，產物響應值低，并且導致柱流失嚴重，因此過高的溫度對于檢測效果的提升并沒有太大的效果[22]，該結論與王欣等[21]的研究一致；此外，值得注意的是本研究中選擇烘箱加熱的方法，因為硅烷化試劑及其衍生化產物對濕度極其敏感，常需要采取密封措施以防止水蒸氣致其失活[36]，而相比于傳統的水浴方法，采用烘箱加熱的方式能夠有效避免水蒸氣的干擾，同時能夠提供穩(wěn)定的熱源，精確調節(jié)溫度[37]。因此，經過對1,9-癸二醇衍生化過程的優(yōu)化，最終確定其衍生化條件為200 μl BSTFA，干燥烘箱60 ℃加熱30 min。

2.3 儀器的精密度及準確度

校準曲線：依次取0 ~ 10.00 μg/ml 的標準樣品，按最優(yōu)化條件測定，以1,9-癸二醇峰面積為縱坐標()，以1,9-癸二醇濃度為橫坐標()，進行線性回歸，方程為= 34.77– 0.90，= 0.999 3。說明1,9-癸二醇在所取的濃度范圍內其濃度和目標峰面積呈良好線性關系(表2)。

圖4 不同衍生化溫度對1,9-癸二醇衍生化產物響應值的影響(n = 3)

儀器精密度：加標濃度為10.00 μg/ml，日內和日間平行測定6次加標樣[38-39]，目標物質1,9-癸二醇響應面積的相對標準偏差(RSD)分別為2.18% 和3.01%，RSD < 5%，結果表明該方法精密度良好(表2)。

儀器檢出限：3倍信號噪聲比所對應的樣品濃度，并與較低的相近濃度的標樣信號值相比較，算得儀器的檢出限為0.05 μg/ml(表2)。

表2 儀器精密度、檢出限及回收率(n = 6)

樣品加標回收率：加標量為10.00 μg/ml，連續(xù)測定6 個加標樣，按上述線性方程算得相應目標物的測定濃度，得回收率為94.42%(表2)，符合有機樣品的分析要求。

2.4 水稻根系分泌物樣品中1,9-癸二醇的測定

采用以上試驗中優(yōu)化后的條件富集和測定水稻根系分泌物中的1,9-癸二醇的含量，C18固相萃取柱可以有效凈化和濃縮水稻根系分泌物收集液中的生物硝化抑制劑1,9-癸二醇，并且該物質經過BSTFA衍生化后在6.92 min 出現明顯響應峰，通過標準曲線可計算出不加氮處理的樣品提取物中1,9-癸二醇的濃度約為0.10 μg/ml，加氮處理的樣品提取物中1,9-癸二醇的濃度約為0.32 μg/ml，兩者之間差異顯著，說明添加1 mmol/L NH4Cl能夠顯著增強根系1,9-癸二醇的分泌。該測定結果重復性好, RSD < 5%，說明該方法適用于測定水稻根系分泌物樣品中1,9-癸二醇的含量。

3 結論

由上述1,9-癸二醇衍生化優(yōu)化的試驗以及樣品測定結果，確定使用固相萃取法純化、富集根系分泌物中的目標物質1,9-癸二醇，并使用BSTFA作為衍生化試劑，在烘箱60 ℃加熱30 min進行衍生化反應，樣品經過氣相色譜法分析得到的分析效果最好。本方法的校準曲線、儀器的精密度及檢出限均可達到有機分析的要求，并且該方法操作簡便、靈敏度高，為水稻根系分泌物中1,9-癸二醇的定量分析提供了參考。

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Optimized Determination of Biological Nitrification Inhibitor 1,9-decanediol in Rice Root Exudates

ZHANG Xiaonan1,2, LU Yufang1, YANG Ting1,2, SHI Weiming1*

(1 State key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 2University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

The optimized pre-treatment and derivatization methods were developed in this study for the determination of 1,9-decanediol by gas chromatograph in the rice root exudates. Results showed that the C18SPE column could retain 1,9-decanediol efficiently and its relative recovery rate (82.97%) had no significant difference with that of the rotary evaporation (80.17%). This method is time-saving and fit for concentrating the identified hydrophobic BNI-compound, 1,9-decanediol, in large amount of root exudates solutions. In addition, the use of N,O-bis (trimethylsily) trifluoroacetamide (BSTFA, 200 μl) as derivatization reagent, together with 30 min heating in the oven at 60 ℃, was found to be the most efficient method for stable derivatives and high sensitivity. The linear equation was=34.77-0.90 (= 0.999 3); the 1,9-decanediol detection limit of the method was 0.05 μg/ml; and the method exhibited good accuracy (recoveries of 94.42%) and precision (within-day precision of 2.18% and day-to-day precision of 3.01%) which could provide reference for the subsequent analysis of 1,9-decanediol in rice root exudates.

Nitrification; Rice; 1,9-decanediol; Biological nitrification inhibitors; Quantification

S145.9

A

10.13758/j.cnki.tr.2020.06.008

張曉楠, 陸玉芳, 楊婷, 等. 水稻生物硝化抑制劑1,9-癸二醇的定量方法優(yōu)化. 土壤, 2020, 52(6): 1152–1157.

國家自然科學基金重點項目(31761143015), 江蘇省優(yōu)秀青年基金項目(Bk20190108)和南京土壤研究所“一三五”計劃和領域前沿項目(ISSASIP1606)資助。

(wmshi@issas.ac.cn)

張曉楠(1990—)，女，河南開封人，博士研究生，主要從事水稻根系分泌物中硝化抑制物質的鑒定和作用機制研究。E-mail: xnzhang@issas.ac.cn