沼液對(duì)河西綠洲葡萄園土壤微生物功能多樣性的影響①

郝 燕，李金霞，孫小妹，陳年來(lái)

沼液對(duì)河西綠洲葡萄園土壤微生物功能多樣性的影響①

郝 燕，李金霞，孫小妹，陳年來(lái)*

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，蘭州 730070)

在甘肅祁連葡萄觀光園進(jìn)行了增施沼液試驗(yàn)，旨在探明沼液施用量和年限對(duì)土壤質(zhì)量和土壤微生物功能多樣性的影響，試驗(yàn)設(shè)置的處理包括：對(duì)照處理(施用化肥，N 180 kg/hm2，P2O5150 kg/hm2，K2O 22.5 kg/hm2)、沼液替代化肥處理(33%、67% 和100% 化肥氮分別被沼液氮替代)及沼液增施處理(沼液氮用量分別為化肥氮的133%、167% 和200%)，采用Biolog-ECO微平板法測(cè)定土壤微生物功能多樣性。結(jié)果表明：①33% 沼液處理的土壤微生物群落代謝活性最高，連續(xù)2 a使用沼液的處理間差異大于1 a使用。②土壤微生物利用的主要碳源為碳水化合物類，使用沼液能夠顯著提高土壤微生物對(duì)氨基酸類和羧酸類碳源的利用率。連續(xù)兩年使用沼液，133% 和167% 沼液處理的效果優(yōu)于其他處理。③與對(duì)照相比，使用沼液處理僅在提高土壤微生物均一度指數(shù)方面存在優(yōu)勢(shì)，且133% 和167% 沼液處理效果優(yōu)于其他處理。④主成分分析表明，沼液使用量和使用年限對(duì)土壤微生物碳源利用水平以及代謝多樣性的影響有差異，且使用年限增加能使各處理間變異程度增大。⑤碳水化合物類和氨基酸類碳源是引起不同沼液處理土壤微生物功能群分異的主要碳源，其中碳水化合物類是沼液使用年限增加后土壤微生物群落變化的敏感碳源。⑥Pearson相關(guān)性分析表明，土壤微生物功能多樣性與土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮含量呈正相關(guān)關(guān)系，與有效磷、速效鉀含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。綜上，長(zhǎng)期使用沼液(尤其是沼液與化肥配施)有利于提高土壤微生物代謝活性和土壤微生物群落功能多樣性，且當(dāng)沼液使用量較大時(shí)可以完全取代化肥。

沼液；使用年限；Biolog-ECO微平板法；土壤微生物功能多樣性

隨著鄉(xiāng)村畜禽養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，畜禽糞便的產(chǎn)生量增長(zhǎng)加快，已占農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物的2/5以上[1]，超過(guò)220億t的年固廢產(chǎn)量使畜禽養(yǎng)殖業(yè)成為僅次于造紙廢水污染的社會(huì)公害。據(jù)推算，2020年我國(guó)畜禽糞便的產(chǎn)生量將達(dá)到28.75億t，其中羊糞占比13.25%、豬糞占比19.59%、牛糞占比33.85%；2030年我國(guó)畜禽糞便的產(chǎn)生量將進(jìn)一步提高到37.43億t，羊糞、豬糞、牛糞的占比將分別達(dá)到15.08%、15.71%、44.61%[2]。畜禽糞便的大量產(chǎn)生對(duì)我國(guó)生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重威脅，其中牛糞占比最大，增長(zhǎng)幅度較快，因此如何有效、充分利用牛糞成為畜禽養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的首要問(wèn)題。

沼液是作物秸稈和人畜糞便等原料經(jīng)過(guò)沼氣池厭氧發(fā)酵制取沼氣后的有機(jī)殘留物，是畜禽糞便資源化利用的直接途徑。厭氧發(fā)酵后產(chǎn)生的沼液除碳素?fù)p失較大外，90% 的營(yíng)養(yǎng)成分仍得以保持，是一種速效有機(jī)液體肥料[3]。大量研究表明，沼液可以改善農(nóng)田土壤肥力[4-5]、提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)[6-7]、預(yù)防和控制作物病害[8]，增加土壤微生物生物量碳氮含量[9]。因此，以畜禽糞便為原料的沼液應(yīng)用于作物生產(chǎn)既可以節(jié)約化肥的使用量，減輕其對(duì)環(huán)境的污染，又能解決養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生的糞污問(wèn)題。

Galvez等[10]研究發(fā)現(xiàn)適量的沼液可以改善土壤質(zhì)量，使土壤中各類營(yíng)養(yǎng)元素更加均衡；Abubaker等[11]研究發(fā)現(xiàn)合理使用沼液可以提高小麥產(chǎn)量和品質(zhì)；Terhoeven-Urselmans等[12]研究發(fā)現(xiàn)沼液農(nóng)用可以進(jìn)一步提高土壤酶活性。目前關(guān)于沼液還田的研究主要集中在土壤質(zhì)量、作物產(chǎn)量和品質(zhì)、土壤酶活性等方面，但關(guān)于以牛糞為原料的沼液在農(nóng)作物上的應(yīng)用，尤其是沼液化肥配施以及使用年限對(duì)作物根際土壤微生物功能多樣性的研究鮮有報(bào)道。

土壤微生物功能多樣性是衡量土壤質(zhì)量和健康狀況的重要生物學(xué)指標(biāo)，能夠反映土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)變化[13-14]。隨著土壤微生物研究方法的進(jìn)步與革新，許多高新技術(shù)被應(yīng)用于土壤微生物功能多樣性的研究，目前使用較多的是Biolog法。Biolog法是一種通過(guò)測(cè)定土壤微生物對(duì)不同碳源利用能力及其代謝差異，進(jìn)而用以表征土壤微生物功能多樣性的方法，因其具有簡(jiǎn)便、靈敏、迅速等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛地使用[15]。

因此，本文以牛糞發(fā)酵的沼液為原料，通過(guò)連續(xù)2 a大田試驗(yàn)研究沼液替代與增施對(duì)土壤微生物功能多樣性的影響，旨在探討土壤微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)沼液使用量和使用年限的響應(yīng)，為綠洲農(nóng)田土壤質(zhì)量改善和沼液資源化利用提供理論依據(jù)和科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)于2017年5月至2018年8月在甘肅省高臺(tái)縣祁連葡萄觀光園內(nèi)進(jìn)行。該試驗(yàn)區(qū)屬大陸性干旱荒漠草原氣候，年均日照時(shí)數(shù)3 118 h，無(wú)霜期150 d，年均氣溫7.5 ℃，極端最高氣溫38.7 ℃，極端最低氣溫–31 ℃，晝夜溫差大，園區(qū)海拔1 359 m。土壤為風(fēng)沙土，0 ~ 20 cm土層有機(jī)質(zhì)含量10.96 g/kg，堿解氮含量52.73 mg/kg，有效磷含量20.14 mg/kg，速效鉀含量138.67 mg/kg，pH為7.32。

1.2 試驗(yàn)材料

供試葡萄品種為紅巴拉多，4 a生，小棚架栽培，獨(dú)龍干形整枝，種植行距4 m，株距0.9 m，密度2 775株/hm2。

供試沼液為牛糞經(jīng)正常厭氧發(fā)酵產(chǎn)生沼氣后固液分離的原沼液，采自甘肅省高臺(tái)縣方正節(jié)能科技服務(wù)有限公司。該原液含有機(jī)質(zhì)55.6 g/L、全氮2.6 g/L、全磷0.12 g/L、全鉀3.6 g/L、速效氮1.4 g/L、速效磷0.04 g/L、速效鉀2.2 g/L。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

田間試驗(yàn)采用裂區(qū)設(shè)計(jì)，主區(qū)為沼肥使用年限，設(shè)1 a和2 a兩個(gè)處理；副區(qū)為沼液用量，設(shè)置沼液替代(利用沼液替代化學(xué)肥料中33%、67% 和100% 氮素)和沼液增施(沼液氮用量相當(dāng)于對(duì)照氮素用量的133%、167% 和200%)2組處理。經(jīng)換算，沼液替代組沼液用量為35 775、72 675、100 530 kg/hm2，沼液增施組沼液用量為133 650、167 805、198 090 kg/hm2。以傳統(tǒng)施肥(化肥配施，折純養(yǎng)分量為N 180 kg/hm2、P2O5150 kg/hm2、K2O 22.5 kg/hm2)為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，共39個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積為72 m2。

沼液使用時(shí)間與當(dāng)?shù)亓?xí)慣施肥相同，即第一次5月上旬，第二次6月中旬，第三次7月中旬。試驗(yàn)期間葡萄園整枝、除草、疏穗、病蟲(chóng)害防治等農(nóng)事操作按常規(guī)方式進(jìn)行。

1.4 土壤樣品采集及處理

土壤取樣時(shí)間為 2018年7月中旬。為使土樣具有代表性，采用五點(diǎn)法分別在每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選5個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)在距葡萄主根15 cm處，分別采集0 ~ 20 cm土層樣品，混合均勻，快速剔除植物殘?bào)w后放入冰盒并及時(shí)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，置于冷凍冰箱(溫度控制在4 ℃)保存用于測(cè)定土壤微生物功能多樣性。

1.5 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤pH采用電位法測(cè)定，土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)采用重鉻酸鉀–外加熱法測(cè)定，堿解氮(AN)采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定，有效磷(AP)采用碳酸氫鈉浸提–鉬銻抗比色法測(cè)定，速效鉀(AK)采用NH4OAc浸提–火焰光度法測(cè)定[16]。

1.6 土壤微生物功能多樣性測(cè)定

土壤微生物功能多樣性采用Biolog-ECO微平板(BIOLOG EcoPlatesTM) 法測(cè)定[17]。在超凈工作臺(tái)中稱取10 g土樣于250 ml滅菌三角瓶中，加入90 ml濃度為0.85 g/ml的NaCl溶液后封口，振蕩1 h(220 r/min)，靜置30 min，吸取5 ml上清液于裝有45 ml濃度為0.85 g/ml NaCl溶液的三角瓶中，振蕩30 min(220 r/min)后備用。用Biolog系統(tǒng)自帶加樣器將其接種到培養(yǎng)板上，每個(gè)微孔150 μl，每樣1板，3次重復(fù)，之后放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)240 h。每隔24 h用Biolog配套讀數(shù)器分別讀取ECO培養(yǎng)板在590 nm(顏色+濁度)和750 nm(濁度)波長(zhǎng)下的吸光值。

通過(guò)計(jì)算平均顏色變化率(average well color development，AWCD)來(lái)反映土壤微生物整體活性，并通過(guò)計(jì)算Shannon-Wiener多樣性指數(shù)()、McIntosh均一度指數(shù)()、Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)()以及碳源豐富度指數(shù)()來(lái)表征土壤微生物群落代謝功能多樣性[18]。

AWCD作為反映土壤微生物群落利用單一碳源的重要指標(biāo)，其隨著培養(yǎng)時(shí)間的變化曲線可以揭示土壤微生物群落的代謝強(qiáng)度。計(jì)算公式如下：

式中：C為各反應(yīng)孔在590 nm和750 nm下的吸光值之差；為對(duì)照孔在590 nm和750 nm下的吸光值之差；C–<0時(shí)記為0。

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)()：

式中：P為第孔的相對(duì)吸光值與微平板所有相對(duì)吸光值總和之比(下同)，計(jì)算公式如下：

McIntosh指數(shù)()：

式中：n為第孔的相對(duì)吸光值(n=C–)。

Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)()：

碳源利用豐富度指數(shù)()：

=被利用碳源總數(shù)(相對(duì)吸光值>0.200的反應(yīng)孔數(shù)目) (6)

1.7 數(shù)據(jù)處理

本文數(shù)據(jù)均用3次重復(fù)的平均值表示。數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2018軟件整理后，運(yùn)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析、主成分分析和Pearson相關(guān)性分析，差異顯著性分析采用Duncan新復(fù)極差法，顯著性水平<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 沼液使用量對(duì)土壤微生物整體代謝活性的影響

各處理土壤樣品AWCD值均隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)類似logestic的增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)(圖1)。0 ~ 24 h(緩慢期)各樣品AWCD值無(wú)明顯變化，24 ~ 96 h(對(duì)數(shù)期)AWCD值快速升高，96 ~ 168h(減速期)上升速度減緩，168 ~ 240 h(穩(wěn)定期)曲線基本平穩(wěn)(圖1)。

使用沼液1 a時(shí)，在對(duì)數(shù)期，133% 沼液處理AWCD值最大，100% 沼液處理AWCD值最??；在減速期至穩(wěn)定期，67%、100%、200% 沼液處理間AWCD值出現(xiàn)明顯差異，其余處理AWCD曲線發(fā)生重合。使用沼液2 a時(shí)，各處理間AWCD值差異于對(duì)數(shù)期開(kāi)始顯現(xiàn)，33% 沼液處理AWCD值最大，單施化肥的CK處理次之，67%、167%、200% 沼液處理居中，133%、100% 沼液處理最??；在減速期，67%、167%、200% 沼液處理AWCD曲線出現(xiàn)交叉現(xiàn)象；在穩(wěn)定期，67% 沼液處理AWCD值上升速度減緩，與其他處理差異明顯，167%、200% 沼液處理AWCD曲線基本重合。

對(duì)比沼液使用不同年限土壤樣品AWCD變化曲線發(fā)現(xiàn)，33% 沼液處理土壤微生物代謝活性始終較高，100% 沼液處理土壤微生物代謝活性始終最低。使用沼液2 a的土壤樣品AWCD平均值(0.584)略低于使用沼液1 a土壤樣品(0.631)，但各處理間差異較第1年更明顯。

(圖例中CK為單施化肥處理，33%、67%、100% 分別表示沼液替代33%、67%、100% 化肥氮量處理，133%、167%、200% 分別表示沼液氮用量為化肥氮的133%、167%、200% 處理；下同)

2.2 沼液使用量對(duì)土壤微生物群落碳源利用強(qiáng)度的影響

總體來(lái)看，試驗(yàn)區(qū)土壤微生物利用的主要碳源是碳水化合物類，其次是氨基酸類、聚合物類、羧酸類，分別占總碳源利用量的41.36%、20.41%、14.68%、14.16%，對(duì)酚酸類和胺類碳源的利用率不足總碳源的10%(圖2)。使用沼液能夠明顯提高土壤微生物對(duì)除碳水化合物外其他碳源的利用能力，使用沼液1a時(shí)的提高幅度大于使用沼液2 a時(shí)(圖2)。

使用沼液1 a時(shí)，200% 沼液處理土壤微生物對(duì)碳水化合物類碳源利用率與CK間無(wú)顯著差異，其余沼液處理均使土壤微生物對(duì)其他碳源的利用率提高，其中67% 沼液處理對(duì)氨基酸類碳源的利用率最高，比CK顯著提高34.0%；33% 和167% 沼液處理對(duì)羧酸類碳源利用率最高，分別比CK顯著提高46.7% 和38.1%；對(duì)聚合物類、酚酸類、胺類碳源利用率最高的是67%、133%、67% 沼液處理，與CK相比分別提高7.1%、103.4%、70.2%，但無(wú)顯著差異。

使用沼液2 a時(shí)，各沼液處理使土壤微生物對(duì)除碳水化合物外其他碳源的利用率均有所提高，其中，33% 和133% 沼液處理使土壤微生物對(duì)氨基酸類和羧酸類碳源的利用率顯著提高12.8%、33.2% 和41.8%、22.9%，其余處理碳源利用率與CK無(wú)顯著差異。對(duì)聚合物類、酚酸類、胺類碳源利用率最高的是100%、167%、133% 沼液處理，與CK相比分別提高13.8%、40.5%、48.2%，但無(wú)顯著差異。

綜上，使用沼液能顯著提高氨基酸類和羧酸類碳源的利用率，同時(shí)酚酸類和胺類碳源的利用率也得到大幅度提高，說(shuō)明使用沼液改變了土壤微生物的適宜性，從而影響其對(duì)碳源的選擇性利用。

2.3 沼液使用量對(duì)土壤微生物群落功能多樣性的影響

沼液用量對(duì)供試葡萄園土壤微生物McIntosh均一度指數(shù)U產(chǎn)生明顯影響，但對(duì)Shannon-Wiener多樣性指數(shù)H′、碳源豐富度指數(shù)和Simpon優(yōu)勢(shì)度指數(shù)影響不大(表1)，連續(xù)2 a使用沼液，100% 沼液處理的McIntosh均一度指數(shù)顯著低于33% 沼液處理。無(wú)論是Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和McIntosh均一度指數(shù)，還是Simpon優(yōu)勢(shì)度指數(shù)和碳源豐富度指數(shù)均為100% 沼液處理最低，說(shuō)明沼液完全替代化肥遠(yuǎn)不如沼液化肥配施亦或使用高量沼液效果理想。

2.4 土壤微生物群落功能主成分分析

根據(jù)主成分分析法(PCA)，在使用沼液1 a和2 a試驗(yàn)樣品中各自提取9個(gè)主成分(特征根>1)，累積貢獻(xiàn)率分別達(dá)84.38% 和86.44%，第1主成分(PC1)貢獻(xiàn)率分別是25.12% 和35.12%，第2主成分(PC2)貢獻(xiàn)率分別是14.45% 和10.93%。因第3至第9主成分方差貢獻(xiàn)率較小，本文選取第1主成分和第2主成分作圖來(lái)表征土壤微生物群落碳源代謝特征(圖3)。

使用沼液1 a時(shí)，133%、200% 沼液處理主要分布在第二象限，100% 沼液處理主要分布在第三象限，33%、67% 和167% 沼液處理主要分布在第四象限，CK(單施化肥)主要分布在PC1和PC2軸上，表明133%、200% 沼液處理碳源利用方式相似，33%、67% 和167% 沼液處理碳源利用方式相似，而單施化肥、100% 沼液處理與上述兩類土壤微生物群落代謝結(jié)構(gòu)存在明顯差異。

(圖中不同小寫(xiě)字母表示同一年限下各處理間差異顯著(P<0.05)，ns表示差異不顯著；下同)

表1 不同沼液處理下土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)變化

注：表中同列不同小寫(xiě)字母表示處理間差異在<0.05水平顯著。

使用沼液2 a時(shí)，33%、167% 沼液處理主要分布在第一象限，200% 沼液處理主要分布在第二象限，67% 沼液處理主要分布在第三象限，CK、100%、133% 沼液處理主要分布在第四象限，表明33%、167%沼液處理碳源利用方式相似，CK、100% 和133% 沼液處理碳源利用方式相似，而67%、200% 沼液處理與上述兩類土壤微生物群落代謝結(jié)構(gòu)具有明顯差異。此外，可以推測(cè)沼液和化肥對(duì)土壤微生物群落代謝存在交互影響，但沼液對(duì)土壤微生物群落代謝結(jié)構(gòu)的影響更大，這可能與使用沼液后土壤養(yǎng)分發(fā)生變化有關(guān)。

使用沼液1 a時(shí)，決定PC1變異的碳源主要有13種，其中碳水化合物1種(D-甘露醇)，羧酸2種(γ-羥丁酸、衣康酸)，氨基酸4種(L-精氨酸、L-天門冬酰胺、L-絲氨酸、L-蘇氨酸)，聚合物2種(吐溫40、吐溫80)，酚酸2種(2-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸)，胺2種(苯乙胺、腐胺)；決定PC2變異的碳源主要有5種，其中碳水化合物4種(D-纖維二糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、N-乙酰-D-葡萄糖胺、D-半乳糖酸-γ-內(nèi)脂)，胺1種(腐胺)(表2)。

圖3 不同沼液處理下土壤微生物群落功能主成分分析

使用沼液2 a時(shí)，決定PC1變異的碳源主要有22種，其中碳水化合物8種(D-纖維二糖、α-D-乳糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-木糖、D-甘露醇、N-乙酰-D-葡萄糖胺、D,L-α-磷酸甘油、D-半乳糖酸-γ-內(nèi)脂)，羧酸3種(丙酮酸甲酯、衣康酸、D-蘋(píng)果酸)，氨基酸4種(L-天門冬酰胺、L-苯基丙氨酸、L-絲氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸)，聚合物3種(吐溫40、α-環(huán)式糊精、肝糖)，酚酸2種(2-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸)，胺2種(苯乙胺、腐胺)；決定PC2變異的碳源主要有5種，其中碳水化合物2種(D-葡萄糖胺酸、D-半乳糖醛酸)，羧酸1種(γ-羥丁酸)，氨基酸2種(L-精氨酸、L-天門冬酰胺)(表2)。

表2 31種碳源在第1、2主成分上的載荷值

結(jié)合表2可以發(fā)現(xiàn)，使用沼液2a顯著提高了7種碳水化合物(D-纖維二糖、α-D-乳糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-木糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺、D,L-α-磷酸甘油、D-半乳糖酸-γ-內(nèi)脂)、2種羧酸(丙酮酸甲酯、D-蘋(píng)果酸)、2種氨基酸(L-苯基丙氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸)和2種聚合物(α-環(huán)式糊精、肝糖)等共13種碳源的代謝能力。

2.5 土壤微生物功能多樣性與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性

將土壤微生物功能多樣性指數(shù)與土壤pH、有機(jī)質(zhì)以及速效養(yǎng)分進(jìn)行相關(guān)性分析，由表3可以看出，使用沼液1 a時(shí)，McIntosh均一度指數(shù)與有效磷含量呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05)；碳源豐富度指數(shù)與pH呈顯著正相關(guān)(<0.05)；Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)與土壤理化因子間的相關(guān)性系數(shù)不顯著。使用沼液2a時(shí)，Shannon-Wiener多樣性指數(shù)與有機(jī)質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)(<0.05)，與堿解氮含量呈極顯著正相關(guān)(<0.01)；McIntosh均一度指數(shù)與pH、速效鉀含量呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05)，與有機(jī)質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)(<0.05)；Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)與有機(jī)質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)(<0.05)，與堿解氮含量呈極顯著正相關(guān)(<0.01)；碳源豐富度指數(shù)與有機(jī)質(zhì)、堿解氮含量呈極顯著正相關(guān)(<0.01)。因此，該試驗(yàn)地土壤微生物功能多樣性與土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮含量呈正相關(guān)關(guān)系，與有效磷、速效鉀含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

表3 微生物群落功能多樣性指數(shù)與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性

注：*表示顯著相關(guān)(<0.05)；**表示極顯著相關(guān)(<0.01)。

3 討論

3.1 沼液使用量對(duì)土壤微生物整體代謝活性的影響

通常細(xì)菌板在590 nm波長(zhǎng)下讀數(shù)表征顏色變化，真菌板在750 nm波長(zhǎng)下讀數(shù)表征濁度變化，由于細(xì)菌板(26 ~ 37℃)和真菌板(26℃)培養(yǎng)溫度相近[19-20]，故本文采用雙波長(zhǎng)檢測(cè)，用590 nm與750 nm吸光值之差來(lái)表征細(xì)菌板的顏色變化，可以排除氣泡、真菌引起的濁度變化等干擾。

平均顏色變化率(AWCD)能夠有效反映土壤微生物群落利用碳源的能力(整體代謝活性)，AWCD值越大，表明土壤微生物整體代謝活性越高[21]。唐海明等[22]研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)肥與化肥配施能顯著提高土壤微生物利用碳源的整體能力，使土壤微生物的代謝活性得到顯著增強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)，33% 沼液處理的土壤微生物代謝活性最高，可能是因?yàn)樵撎娲壤梢詷O大改善土壤微生物群落的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，進(jìn)而提高土壤微生物群落代謝能力。經(jīng)過(guò)2 a沼液使用，100% 沼液處理土壤微生物代謝活性始終最低(與對(duì)照差異顯著)，說(shuō)明沼液完全替代化肥(等氮量)會(huì)顯著降低土壤微生物群落整體代謝活性。

本研究還發(fā)現(xiàn)，除33%、200% 沼液處理土壤微生物代謝活性于2 a后略有提高外，其余處理土壤微生物代謝活性均降低，這與李娟等[23]、孫瑞蓮等[24]研究結(jié)果不一致，可能是因?yàn)殚L(zhǎng)期使用沼液有利于植物根系的生長(zhǎng)，而植物根系與土壤微生物競(jìng)爭(zhēng)養(yǎng)分，以致根系分泌大量化學(xué)物質(zhì)抑制土壤微生物的活性[25-26]。

3.2 沼液使用量對(duì)土壤微生物群落利用強(qiáng)度的影響

有機(jī)氮是土壤中有效氮的源和庫(kù)，氨基酸類物質(zhì)是有機(jī)氮的重要組成部分，土壤微生物可利用氨基酸合成植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑以促進(jìn)植物生長(zhǎng)[27]。此外，氨基酸類物質(zhì)對(duì)有機(jī)質(zhì)有正激發(fā)效應(yīng)，能夠加快土壤有機(jī)質(zhì)的分解，降低土壤中有機(jī)質(zhì)的含量[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，使用沼液2 a各處理對(duì)氨基酸類碳源的利用率均顯著提高，這是因?yàn)殚L(zhǎng)期使用沼液使得碳源趨于穩(wěn)定，促進(jìn)了以氨基酸類物質(zhì)為碳源的微生物群落的發(fā)育，能夠加速土壤中有機(jī)質(zhì)的分解。

酚酸類物質(zhì)含量過(guò)高是農(nóng)作物產(chǎn)生自毒作用的主要原因，前人研究表明使用有機(jī)肥能夠降低土壤中酚酸類物質(zhì)的含量[29]。也有研究發(fā)現(xiàn)，使用生物有機(jī)肥可顯著提高微生物對(duì)酚酸類碳源的利用能力[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，增施氮量處理(133%、167% 沼液處理)能夠大量消耗土壤中的酚酸類物質(zhì)，降低其在土壤中的積累，從而在一定程度上抑制有害微生物的繁殖，對(duì)減輕葡萄連作障礙有積極作用。

3.3 沼液使用量對(duì)土壤微生物群落功能多樣性的影響

土壤微生物群落是土壤生態(tài)功能的基礎(chǔ)，一般來(lái)說(shuō)，使用沼液能夠提高土壤微生物功能多樣性指數(shù)[31-32]，但本研究發(fā)現(xiàn)，除McIntosh均一度指數(shù)外，各沼液處理的土壤微生物Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和碳源豐富度指數(shù)均低于單施化肥對(duì)照，可能是因?yàn)槭褂谜右耗芴岣咂咸阎仓戢@取土壤養(yǎng)分的能力，抑制土壤微生物的生長(zhǎng)繁殖，以致土壤微生物多樣性明顯降低[33]。本研究還發(fā)現(xiàn)，單施化肥處理Shannon-Wiener多樣性指數(shù)較高，而McIntosh均一度指數(shù)較低，這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間使用化肥極大促進(jìn)了某些微生物種群的生長(zhǎng)代謝，而他種微生物種群的生長(zhǎng)代謝被抑制，以致單施化肥處理下土壤微生物種類增加而均勻度下降[34]。此外不同沼液使用年限土壤微生物多樣性對(duì)沼液使用量的響應(yīng)不一致，說(shuō)明沼液使用年限也是影響微生物多樣性的一個(gè)重要因子，可能是土壤間養(yǎng)分含量差異導(dǎo)致。

3.4 土壤微生物群落功能主成分分析

主成分分析表明，不同沼液用量處理土壤微生物群落在碳源利用上存在較大差異，長(zhǎng)期使用沼液加劇了各處理間的變異程度，增加了根際土壤微生物群落的變異性。這可能是因?yàn)檎右褐胸S富的營(yíng)養(yǎng)成分使得土壤有機(jī)物質(zhì)的含量和組成發(fā)生變化，導(dǎo)致土壤中可提供的碳源種類及含量發(fā)生變化，區(qū)分了不同碳源微生物，最終產(chǎn)生了微生物功能多樣性。此外，使用沼液2 a較使用沼液1 a土壤微生物群落離散度大，這是因?yàn)橥寥牢⑸锒唐趦?nèi)會(huì)維持相對(duì)穩(wěn)定，只有長(zhǎng)期使用沼液才會(huì)使土壤微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使用年限間差異主要是由碳水化合物類碳源引起。

3.5 土壤微生物功能多樣性與土壤養(yǎng)分的關(guān)系

土壤養(yǎng)分含量的高低對(duì)微生物功能多樣性有重要影響[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，土壤有機(jī)質(zhì)和速效養(yǎng)分是影響土壤微生物功能多樣性的重要因子。土壤微生物功能多樣性與土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮含量呈正相關(guān)，與有效磷、速效鉀含量呈負(fù)相關(guān)，這與郝曉暉等[36]、Dalmonech等[37]研究結(jié)果一致。鐘芳等[38]研究得出土壤微生物功能多樣性與速效鉀含量呈顯著正相關(guān)，與本研究結(jié)果不一致，可能與本試驗(yàn)地土壤鉀元素較豐富有關(guān)。

本試驗(yàn)僅針對(duì)連續(xù)使用2 a沼液的土壤微生物群落代謝活性及多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果表明沼液和化肥配施有利于提高土壤微生物代謝活性和土壤微生物群落功能多樣性，且當(dāng)沼液使用量較大時(shí)能達(dá)到完全取代化肥的效果。而關(guān)于長(zhǎng)期沼液農(nóng)用對(duì)土壤微生物群落活性和多樣性的影響以及是否對(duì)土壤質(zhì)量帶來(lái)負(fù)面影響等方面有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

1)沼液替代100% 化肥氮處理對(duì)土壤微生物群落代謝活性影響最小，沼液替代33% 化肥氮處理對(duì)土壤微生物群落代謝活性影響最大。

2)供試葡萄園土壤微生物主要利用碳水化合物類碳源，其次是氨基酸類碳源。使用沼液能夠改變土壤微生物的代謝結(jié)構(gòu)，顯著提高土壤微生物對(duì)氨基酸類、羧酸類碳源的利用能力，且隨沼液使用年限增加，增施氮量處理(133%、167% 沼液處理)在提高土壤微生物碳源利用能力方面較沼液部分替代化肥氮處理更具優(yōu)勢(shì)。

3)各施肥處理土壤微生物Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)變化不明顯，Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、McIntosh均一度指數(shù)和碳源豐富度指數(shù)均以沼液替代100% 化肥氮處理最低。與單施化肥的對(duì)照相比，使用沼液處理僅在提高土壤微生物McIntosh均一度指數(shù)方面存在優(yōu)勢(shì)，增施氮量處理提高效果較好，能使土壤生態(tài)系統(tǒng)更加穩(wěn)定。

4)結(jié)合主成分分析得出，沼液處理下土壤微生物群落被劃分為3 ~ 4個(gè)功能群，碳水化合物類、氨基酸類是引起微生物類群分異的主要碳源，其中碳水化合物類是沼液使用年限增加后土壤微生物群落發(fā)生變化的敏感碳源。

5)Pearson相關(guān)性分析表明，土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷和速效鉀對(duì)土壤微生物功能多樣性影響較大，供試土壤微生物功能多樣性與土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮含量呈正相關(guān)關(guān)系，與有效磷、速效鉀含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

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Effects of Biogas Slurry on Soil Microbial Functional Diversity of Vineyard in Hexi Oasis

HAO Yan, LI Jingxia, SUN Xiaomei, CHEN Nianlai*

(College of Resources and Environment, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

A 2 a field experiment was conducted in Qilian Grape Sightseeing Garden of Gansu Province in order to investigate the effects of biogas slurry application amount and year on soil quality and soil microbial functional diversity. The designed treatments included CK treatment (pure chemical fertilizer, N 180 kg/hm2, P2O5150 kg/hm2, K2O 22.5 kg/hm2), biogas slurry replacing chemical fertilizer treatments (biogas slurry nitrogen replaced 33%, 67% and 100% of chemical fertilizer nitrogen), and increasing biogas slurry treatments (biogas slurry nitrogen were 133%, 167% and 200% of chemical fertilizer nitrogen). Soil microbial functional diversity was determined by Biolog method. The results showed that metabolic activity of soil microbial community was the lowest in 100% biogas slurry treatment but the highest in 33% biogas slurry treatment. Meanwhile the differences in metabolic activity between the treatments with 2 a application biogas slurry were greater than those of 1a. The main carbon sources used by soil microbes were carbohydrates, biogas slurry application significantly increased the utilization rates of amino acids and carboxylic acids. Under the condition of applying biogas slurry for 2 a, the effects of 133% and 167% biogas slurry treatments were better than those of other treatments. Compared with CK, biogas slurry application only had obvious advantage in promoting the McIntosh index, and the effects of 133% and 167% biogas slurry treatments were better than those of other treatments. Principal component analysis (PCA) showed that biogas slurry applying amount and year had different effects on soil microbial carbon source utilization rate and metabolic diversity, and the variation degree among treatments increased with increasing applying year of biogas slurry. Carbohydrates and amino acids were the main carbon sources that caused the differentiation of soil microbial functional groups treated with different amounts of biogas slurry, and carbohydrates were the sensitive carbon sources for soil microbial community changes after the increase of applying year of biogas slurry. Pearson correlation analysis showed that soil microbial community functional diversity had positive correlation with soil organic matter and available N, and negative correlation with available P and K. In conclusion, biogas slurry application (particularly combined with chemical fertilizer) is beneficial to improve soil microbial metabolic activity and soil microbial community functional diversity, and it can completely replace chemical fertilizer when enough amount is applied.

Biogas slurry; Application years; Biolog-ECO microplate method; Soil microbial functional diversity

S154.1

A

10.13758/j.cnki.tr.2020.06.015

郝燕, 李金霞, 孫小妹, 等. 沼液對(duì)河西綠洲葡萄園土壤微生物功能多樣性的影響. 土壤, 2020, 52(6): 1203–1211.

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)盛彤笙科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(31270472)和沼液綜合利用研究項(xiàng)目(037036235)資助。

(chennl@gsau.edu.cn)

郝燕(1992—)，女，江蘇揚(yáng)州人，碩士研究生，主要從事植物生態(tài)學(xué)研究。E-mail: 1447397812@qq.com