兔眼藍(lán)莓幼果內(nèi)生真菌多樣性及其抑菌活性鑒定

張 林 侯 瑞 羅妮星 潘秋梅

（貴州大學(xué)林學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

藍(lán)莓又稱越橘，杜鵑花科越橘屬多年生落葉或常綠灌木，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開發(fā)前景[1-2]。同時(shí)，藍(lán)莓也是一種生物活性顯著的藥用植物，其莖葉中含有黃酮類、酚類和鞣質(zhì)類等天然的活性成分[3]。近年來，貴州省藍(lán)莓栽種面積不斷擴(kuò)大，隨之而來的病害問題也日趨突出[4]。由尖孢鐮菌（Fusarium oxysporum）引起的藍(lán)莓根腐病，蛇孢腔菌屬（Ophiobolus）真菌引起的莖枯病已成為貴州省栽培藍(lán)莓急需解決的重要問題[4-5]。

植物內(nèi)生真菌是在其生活史或生活史中某一段時(shí)間生活在植物組織內(nèi)，但不會(huì)引起植物組織明顯病害癥狀的真菌，其廣泛存在于不同地域、不同種類的植物組織內(nèi)[6]。宿主為內(nèi)生真菌提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，內(nèi)生真菌則可促進(jìn)宿主生長[7]，提高宿主對病蟲害、環(huán)境脅迫等方面的抗性[8-9]。有些植物內(nèi)生真菌還可以產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物同樣可增強(qiáng)宿主的生長、提高宿主抗干旱能力和增加宿主對病蟲害的抵抗能力[10-13]，還可以產(chǎn)生一些重要的抗人類疾病的次生代謝產(chǎn)物[14]。近年來，已經(jīng)有很多關(guān)于利用內(nèi)生真菌防治植物病害的報(bào)道。Hanada等曾報(bào)道7個(gè)內(nèi)生真菌菌株，鑒定為彎孢霉屬（Curvularia），鐮孢菌屬（Fusarium），擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）和彎頸霉屬（Tolypocladium），這7個(gè)內(nèi)生真菌菌株能夠有效的防治由Phytophthora palmivora引起的可可的黑莢病[15]。Miles等同樣篩選到對馬鈴薯晚疫病原菌（Phytophthora infestans）有防治效果的內(nèi)生真菌，屬于球毛殼屬（Chaetomium）[16]。陳肖學(xué)等從野生藍(lán)莓葉片中分離得到一株雜色曲霉（Aspergillus versicolor），對棉花枯萎菌（Fusarium oxysporiumf.sp.vasinfectum）等5種植物病原菌抑制效果較好[17]。張維瑞等[18]從杜仲（Eucommia ulmoides）葉片和果實(shí)分離得到11個(gè)菌株對4種病原菌具都有抑制作用，因此，利用植物內(nèi)生真菌進(jìn)行藍(lán)莓病害防治將成為藍(lán)莓病害生物防治的重要部分。

目前，藍(lán)莓內(nèi)生真菌研究主要集中于根部、莖部和葉部[19-20]。貴州省栽培藍(lán)莓內(nèi)生真菌研究還未見報(bào)道，果實(shí)內(nèi)生真菌的分離也未見報(bào)道。本研究從貴州栽培的兔眼藍(lán)莓（Vaccinium ashei）幼果中分離內(nèi)生真菌，篩選具有抑菌活性的菌株，為下一步篩選活性物質(zhì)，用于生物制藥和病害生防產(chǎn)業(yè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 植物材料

供試兔眼藍(lán)莓幼果采自貴陽省麻江縣有機(jī)藍(lán)莓園（東經(jīng)107°42′06″、北緯26°24′45″），選取5～7年生健康兔眼藍(lán)莓樹上的幼果，供分離內(nèi)生真菌使用。

1.1.2 植物病原真菌

6種供試植物病原真菌為禾谷鐮孢菌（小麥赤霉病病原菌Fusarium graminearum）、尖鐮孢菌（玉米莖腐病病原菌F.oxysporum）、輪枝鐮孢菌（玉米穗腐病病原菌F.verticillioide）、尖鐮孢菌（藍(lán)莓根腐病病原菌F.oxysporum）、尖孢炭疽菌（辣椒炭疽病病原菌Colletotrichum acutatum）和齊整小核菌（白絹病病原菌Sclerotium rolfsii）。病原真菌均保存于貴州大學(xué)林學(xué)院森林病理實(shí)驗(yàn)室。

1.2 研究方法

1.2.1 藍(lán)莓幼果內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)

利用組織分離法，選取表面健康無病斑的兔眼藍(lán)莓幼果，清水洗去表面污垢后晾干。在超凈工作臺中，用75%乙醇中浸2～3 s，無菌水沖洗3～5次，然后轉(zhuǎn)入體積分?jǐn)?shù)為3%NaClO溶液消毒3 min，無菌水沖洗3～5次，75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗5～8次，用無菌濾紙吸干水分后放置于PDA培養(yǎng)基中，每皿放置5顆藍(lán)莓幼果，重復(fù)20個(gè)皿，25 ℃進(jìn)行黑暗培養(yǎng)3～5 d；同時(shí)，采用植物組織印記法，將表面消毒的藍(lán)莓幼果直接在培養(yǎng)基表面輕抹，相同條件下培養(yǎng)5個(gè)皿作為對照。利用真菌菌落邊緣挑取法，挑取PDA平板培養(yǎng)基中生長形態(tài)差異典型的真菌菌株轉(zhuǎn)接至新的PDA培養(yǎng)基，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，純化3～5次。

1.2.2 內(nèi)生真菌鑒定

內(nèi)生真菌DNA的提取采用CTAB提取法[21]。利用通用擴(kuò)增引物ITS1和ITS4鑒定內(nèi)生真菌，擴(kuò)增菌株核糖體DNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔序列。內(nèi)生真菌rDNA-ITS區(qū)段的PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化參考王娜等[22]的方法。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接送測試公司切膠、純化和測序。內(nèi)生真菌的測序片段修正后利用NCBI數(shù)據(jù)庫中blastn對測序序列進(jìn)行對比分析。內(nèi)生真菌分離率（IR）、多樣性指數(shù)Shannon-Wiener diversity index（H）、真菌均勻度指數(shù)Pielou’s index（J）和豐富度指數(shù)Margalef’s index（R）分析藍(lán)莓幼果真菌多樣性[23]。

式中：F為分離總菌株數(shù)；Z為培養(yǎng)組織塊數(shù)；Pi=Ni/N，Ni為屬i的單菌落數(shù)量，N為菌株數(shù)量之和；S為分類單元，為屬（種）i所在所有內(nèi)生真菌中屬（種）的數(shù)目[23]。

1.2.3 抑菌活性鑒定

采用平板對峙法測定各分離內(nèi)生真菌菌株對6種植物病原真菌的抑菌活性。在無菌條件下，利用打孔器（6 mm）選取活化于PDA平板中的內(nèi)生真菌菌株和病原菌菌落邊緣打菌餅，分別接種于90 mm PDA平板兩側(cè)，使得分離菌株和病原菌接種點(diǎn)直徑相距50 mm，只在平板右側(cè)接種病原菌為對照（CK）。設(shè)置3個(gè)重復(fù)，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。測量CK病原菌菌落直徑和處理組病原菌菌落直徑，計(jì)算抑制率。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

藍(lán)莓幼果內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)H、J、R采用Excel 2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。抑菌率采用Excel 2010和DPSv 17.10軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓幼果內(nèi)生真菌種類鑒定

由表1可知，利用組織分離法共分離獲得具有明顯菌落形態(tài)差異的真菌25株。通過菌株rDNA-ITS序列進(jìn)行blastn比對，將25株菌株劃分為12個(gè)屬19個(gè)種，相似度為97%～100%，同源性非常高（表1）。其中，間座殼屬（Diaporthe）5種、擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）2種、裂褶菌屬（Schizophyllum）2種、煙管菌屬（Bjerkandera）2種，葉點(diǎn)霉屬（Phyllosticta）、籃狀菌屬（Talaromyces）、擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）、多節(jié)孢屬（Nodulisporium）、葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria）、青霉屬（Penicillium）、炭墊菌屬（Nemania）和蠟孔菌屬（Ceriporia）各1種（圖1）。25株藍(lán)莓幼果內(nèi)生真菌中，間座殼屬分離得到的菌株數(shù)量最多，為藍(lán)莓幼果內(nèi)生真菌群落的優(yōu)勢屬，占菌株總數(shù)的20.0%。擬盤多毛孢屬和葉點(diǎn)霉屬次之，均占菌株總數(shù)的16.0%?；@狀菌屬、裂褶菌屬和煙管菌屬均占菌株總數(shù)的8.0%。擬莖點(diǎn)霉屬、多節(jié)孢屬、葡萄座腔菌屬、青霉屬、炭墊菌屬和蠟孔菌屬只分離得到1株，各占總菌株數(shù)的4.0%（表1）。

表1 分離麻江兔眼藍(lán)莓幼果期內(nèi)生真菌的rDNA-ITS序列相似性分析Table 1 Similarity analysis of partial rDNA-ITS sequences from endophytic fungal isolates from the young fruit of V.ashei in Majiang

圖1 藍(lán)莓幼果內(nèi)生真菌不同屬的菌落形態(tài)Fig.1 The colony morphology of endophytic fungi of different genera of the young fruit of V.ashei

2.2 藍(lán)莓幼果內(nèi)生真菌多樣性

根據(jù)分離結(jié)果，從麻江縣有機(jī)藍(lán)莓園幼果共分離得到12屬共25株內(nèi)生真菌，分離頻率為25%，H為2.287 0，R為3.417 3，J指數(shù)為0.920 3。

2.3 藍(lán)莓幼果內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

藍(lán)莓幼果內(nèi)生真菌分為3個(gè)分支（圖2）：子囊菌門為一個(gè)分支，擔(dān)子菌門有兩個(gè)分支。擔(dān)子菌門共有3屬，Schizophyllum2株，Bjerkandera2株 和Ceriporia1株。Ceriporia lacerate（KY7 80653.1）與Bjerkandera adusta（KJ668570.1） 和Bjerkanderasp.PAB-2014（KM099498.1）支持率為69%，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。子囊菌門有9屬，其中，Diaporthe5個(gè)種和Phomopsissp.XZ-26（DQ 272500.1）親緣關(guān)系較近，同為一個(gè)分支。Nemania、Nodulisporium、Pestalotiopsis3個(gè)屬為同一分支，但Nodulisporiumsp.MF6246（AF201755.1）與Pestalotiopsis microspora（LC412112.1）和Pestalotiopsissp.LH62（HQ832806.1）支持率為58%，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。Botryosphaeria、Phyllosticta、Talaromyces、Penicillium為同一分支，且Talaromycessp.DI16-143（LT558965.1）和Penicillium brefeldianum（KM013443.1）親緣關(guān)系較近，支持率為100%。

2.4 內(nèi)生真菌對6種植物病原真菌的抑制效果

藍(lán)莓幼果內(nèi)生真菌菌株G3、G4、G5、G6等25個(gè)菌株與6種植物病原真菌在PDA平板中對峙培養(yǎng)7 d后，抑制率如表2所示，25株菌株對6種植物病原真菌都有一定程度的抑制作用。其中，菌株G6對5種病原菌抑制率在40%以上，G18對4種病原菌抑制率在45%以上。菌株G6和G18均屬于裂褶菌屬真菌。對玉米莖腐病病原菌尖鐮孢菌抑制效果最好的內(nèi)生真菌為菌株G6和G4，抑制率達(dá)到48%；對玉米穗腐病病原菌輪枝鐮孢菌抑制效果最好的為菌株G18和G6，抑制率達(dá)到54%；對小麥赤霉病病原菌禾谷鐮刀菌抑制效果最好的為菌株G5和G13，抑制率達(dá)到40%；對藍(lán)莓根腐病病原菌尖鐮孢菌抑制效果最好的為菌株G18和G17，抑制率達(dá)到46%；對辣椒炭疽病病原菌尖孢炭疽菌抑制效果最好的為菌株G18和G6，抑制率達(dá)到56%；對白絹病病原菌齊整小核菌抑制效果最好的為菌株G6和G18，抑制率達(dá)到76%；其中，菌株G4為間座殼屬真菌，G5和G17為擬盤多毛孢屬真菌，G13為多節(jié)孢屬真菌。

圖2 基于rDNA-ITS序列同源性的藍(lán)莓幼果內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of fungal isolates from the young fruit of V.ashei based on rDNA-ITS sequences

表2 麻江藍(lán)莓幼果期內(nèi)生真菌對6種病原真菌抑制效果Table 2 The inhibition effects of endophytic fungi on 6 pathogenic fungi from the young fruit of V.ashei in Majiang

3 結(jié)論與討論

有關(guān)藍(lán)莓內(nèi)生真菌、藍(lán)莓果實(shí)內(nèi)生真菌的報(bào)道較少。了解藍(lán)莓幼果內(nèi)生真菌多樣性對貯藏期病害的早期防控和豐富藍(lán)莓內(nèi)生真菌多樣性具有重要意義。

本研究從健康兔眼藍(lán)莓幼果期分離得到的內(nèi)生真菌，主要隸屬于子囊菌門和擔(dān)子菌門，包括間座殼屬真菌（20.0%），擬盤多毛孢屬（16.0%），裂褶菌屬（8.0%）、青霉屬（4.0%）、炭墊菌屬（4.0%）和蠟孔菌屬（4.0%）等。其中，間座殼屬（Diaporthe）、擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)和葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria）真菌為藍(lán)莓葉部和莖部常見的植物病原真菌[24-26]。煙管菌屬（Bjerkandera）目前在生防中應(yīng)用較多，對柑橘炭疽病和油菜核盤菌都有很好的生防效果[27-28]?；@狀菌屬對桃褐腐病有抑制作用[29]。蠟孔菌屬（Ceriporia）防治茄子棉疫病具有較好效果，且有一定的促生效果[30]。Li等分離云南省樟葉藍(lán)莓的莖、葉和果實(shí)內(nèi)生真菌，共得到25屬內(nèi)生真菌，果實(shí)組織中共分離得到7個(gè)屬，全部為子囊菌門真菌，包括附球菌屬（Epicoccum）、刺盤孢屬（Colletotrichum）、擬盤多毛孢、枝孢屬（Cladosporium）、Coleophoma、Ceuthospora和Coleophoma[31-32]。刺盤孢屬能夠侵染越橘屬果實(shí)[33]。兔眼藍(lán)莓和樟葉藍(lán)莓果實(shí)內(nèi)生真菌都分離得到了擬盤多毛孢屬，樟葉藍(lán)莓果實(shí)中并沒有分離得到擔(dān)子菌門真菌，但有報(bào)道發(fā)現(xiàn)擔(dān)子菌門真菌可以通過降低營養(yǎng)物的釋放來增加越橘屬植物的生長[34]。本研究分離得到擔(dān)子菌門共有3屬，其對藍(lán)莓果實(shí)的功能需后期進(jìn)一步研究。

本研究利用平板對峙法檢測了藍(lán)莓內(nèi)生真菌對6種植物病原真菌的抑菌活性，目的是篩選抑菌效果明顯的真菌，豐富生防真菌資源。結(jié)果顯示菌株G6對5種病原菌抑制率在40%以上，G18對4種病原菌抑制率在45%以上。菌株G4和G6對玉米莖腐病病原菌尖鐮孢菌抑制效果；菌株G6和G18對輪枝鐮孢菌、尖孢炭疽菌和齊整小核菌抑制效果最好；菌株G5和G13對禾谷鐮孢菌抑制效果最好；G18和G17對藍(lán)莓根腐病原菌尖鐮孢菌抑制效果最好。其中，G6和G18為裂褶菌菌，菌株G4為間座殼屬真菌，G5和G17為擬盤多毛孢屬真菌，G13為多節(jié)孢屬真菌。裂褶菌屬通常可以分泌木質(zhì)素降解酶，常用于工業(yè)廢水脫色[35]，間座殼屬和擬盤多毛孢屬真菌為常見的植物內(nèi)生真菌和病原真菌[36-37]，多節(jié)孢屬真菌多見于內(nèi)生真菌[38]。后期將進(jìn)一步研究生防效果較好的內(nèi)生菌株次生代謝產(chǎn)物及其對病原真菌的抑制作用，為篩選具有生物防治功能的內(nèi)生真菌提供參考。