水曲柳松散型愈傷組織誘導(dǎo)及懸浮培養(yǎng)體系的優(yōu)化

劉 林 陳思齊,2 董宇飛 邸鑫宇 詹亞光 齊鳳慧

（1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.阜新市產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新推廣中心（阜新市產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院），遼寧 阜新 123000）

水曲柳（Fraxinus mandshurica）為木犀科（Oleaceae）白蠟樹屬，產(chǎn)于東北、華北、陜西、甘肅、湖北等省，生于海拔700～2 100 m的山坡疏林中或河谷平緩山地。朝鮮、俄羅斯、日本也有分布，落葉大喬木，通常樹干高大通直，高達(dá)30 m以上，胸徑可達(dá)2 m[1]。水曲柳材質(zhì)堅(jiān)硬，紋理通直，花紋美觀，因其生產(chǎn)出備受推崇的硬木[2]，而被廣泛用于家具和特殊建筑材料[3]，如櫥柜、運(yùn)動(dòng)器材及農(nóng)具等[4]。

有研究報(bào)道水曲柳樹皮中含有香豆素類成分[5]，在民間常將水曲柳皮用于抗炎鎮(zhèn)痛等[4]。但樹木去皮后會(huì)死亡，砍伐也會(huì)造成資源的浪費(fèi)和破壞，不利于可持續(xù)發(fā)展。因此，可以利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)水曲柳進(jìn)行繁殖。目前水曲柳的繁殖主要是種子、扦插和嫁接，而無性繁殖主要利用成熟胚的下胚軸誘導(dǎo)不定芽，子葉誘導(dǎo)體細(xì)胞胚。但這些技術(shù)中依然存在幾個(gè)關(guān)鍵問題：如不定芽的誘導(dǎo)中，雖然可以活動(dòng)不定芽，但在后期伸長培養(yǎng)中不定芽普遍發(fā)育不良，成苗率低。在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)中，大部分形成畸形胚，而且多數(shù)是在褐化的外植體上形成體胚[6]。目前也有以水曲柳葉柄或下胚軸為外植體誘導(dǎo)愈傷組織并進(jìn)行懸浮培養(yǎng)[7-8]。這些研究結(jié)果為水曲柳的無性繁殖及單細(xì)胞誘導(dǎo)奠定了基礎(chǔ)，但要進(jìn)行大規(guī)模的繁殖還需要對(duì)誘導(dǎo)體系進(jìn)一步的優(yōu)化，以達(dá)到生產(chǎn)應(yīng)用的目的。

本研究在前人研究基礎(chǔ)上，對(duì)水曲柳愈傷組織誘導(dǎo)并對(duì)懸浮培養(yǎng)體系進(jìn)一步優(yōu)化，獲得能夠長期繼代培養(yǎng)并能形成均一化的單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)體系。該體系的建立一方面可以為水曲柳次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)及研究提供材料，另一方面為利用單細(xì)胞誘導(dǎo)體細(xì)胞胚從而建立水曲柳再生體系提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

實(shí)驗(yàn)材料為水曲柳組培苗，由東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院詹亞光教授提供。

1.2 水曲柳愈傷組織誘導(dǎo)

在無菌條件下，將水曲柳組培苗葉片和葉柄切下來，葉柄切成0.5 cm左右大小，葉片復(fù)葉形式，垂直葉脈方向劃兩刀，切斷葉脈，分別接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基是以WPM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入30 g/L蔗糖，5.6 g/L瓊脂，6-BA（0，5，6，7，8 mg/L）和TDZ（6，7 mg/L）2種植物生長調(diào)節(jié)劑，培養(yǎng)基命名為WG1～WG10（表1）。

表1 水曲柳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基Table 1 Induction medium for F.mandshurica callus

1.3 松散型愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

將獲得的愈傷組織從外植體上切割下來，切割成直徑0.5 cm的球型小塊，接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（見表2）。每種濃度重復(fù)3瓶，每瓶接種9塊愈傷組織，溫度(25±1) ℃，光照周期12 h/d，光照強(qiáng)度2 000～3 000 lx，培養(yǎng)20 d后觀察愈傷組織生長情況。

表2 松散型愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基Table 2 Medium for inducing loose callus mg/L

1.4 水曲柳愈傷組織形態(tài)學(xué)觀察

將誘導(dǎo)的愈傷組織浸入FAA中固定24 h。蒸餾水清洗3次以去除固定液，OTC包埋，-20 ℃冷凍30 min，用冰凍切片機(jī)切片，厚度為8～15 μm。

將切好的材料用番紅固綠雙染。先用0.1%番紅染色2～3 min，蒸餾水清洗后，用0.05%固綠染色1 min，再次水洗。制成臨時(shí)裝片，在顯微鏡下觀察。

1.5 水曲柳細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

將獲得的松散愈傷組織，稱取2 g，接種到50 mL F4液體培養(yǎng)基中，110～120 r/min振蕩培養(yǎng)。溫度(25±1) ℃，光照周期12 h/d，光照強(qiáng)度2 000～3 000 lx，培養(yǎng)2周。用100目細(xì)胞篩過濾棄去大塊愈傷組織，用F4液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得水曲柳懸浮細(xì)胞。

1.6 水曲柳細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生長量、pH值、電導(dǎo)率檢測(cè)

稱取2 g懸浮細(xì)胞，接種到50 mL編號(hào) F4的液體培養(yǎng)基中，重復(fù)30瓶，120 r/min震蕩培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)20 d。每隔2 d隨機(jī)取出其中3瓶，過篩后，稱其鮮質(zhì)量，然后60 ℃烘干2 h，稱其干質(zhì)量；以pH計(jì)測(cè)量濾液的pH值，電導(dǎo)率儀檢測(cè)電導(dǎo)率的變化，連續(xù)測(cè)定10次，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.7 水曲柳細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中蔗糖、N、P、接種量的檢測(cè)

以編號(hào)F4液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，蔗糖濃度設(shè)計(jì)為10、20、60、80 g/L，培養(yǎng)基編號(hào)為F4C1、F4C2、F4C3、F4C4； KNO3濃度為400、800、1 200 mg/L，培養(yǎng)基編號(hào)為F4N1、F4N2、F4N3；磷源KH2PO4濃度為 170、340 g/L，培養(yǎng)基編號(hào)為F4P1、F4P2；接種量設(shè)計(jì)為4、6 、8、10 g/50 mL。連續(xù)培養(yǎng)20 d，分別對(duì)培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行觀察，并稱干質(zhì)量和鮮質(zhì)量，對(duì)比不同處理?xiàng)l件下細(xì)胞增殖情況。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。愈傷組織誘導(dǎo)率、增殖率、死亡率按照以下公式計(jì)算：

或

2 結(jié)果與分析

2.1 6-BA和TDZ濃度對(duì)水曲柳愈傷組織形成的影響

以WPM為基本培養(yǎng)基，TDZ濃度為6 mg/L，葉柄為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率隨6-BA濃度增加呈現(xiàn)先增后減趨勢(shì)，6-BA濃度為5 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率最高，為90.91%；葉片為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率隨6-BA濃度增加呈現(xiàn)先降后增再降的趨勢(shì)，6 mg/L TDZ時(shí)誘導(dǎo)率最高，為87.5%。6-BA濃度為5 mg/L時(shí)，愈傷組織整體存活率最高為80%，（見表3）。

表3 不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)情況Table 3 Callus induction of different explants

以WPM為基本培養(yǎng)基，TDZ濃度為7 mg/L，葉柄為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率隨著6-BA濃度的增加而降低，葉片為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率隨6-BA濃度的增加先升高后降低（見表3）。

從表3還可以發(fā)現(xiàn)：葉柄愈傷組織的誘導(dǎo)隨TDZ濃度增加，愈傷組織誘導(dǎo)率也增加，如TDZ濃度為6 mg/L和7 mg/L時(shí)，水曲柳葉柄的愈傷組織誘導(dǎo)率分別為88.89%＜96.97%。

形態(tài)學(xué)觀察6-BA濃度增加，葉柄愈傷組織形態(tài)上變化不大（圖1a，b，c），TDZ濃度增加，愈傷組織體積也增大（圖1d，e）。葉片為外植體時(shí)，6-BA濃度增加時(shí)愈傷組織變化不明顯（圖1f，g，h），TDZ濃度增加時(shí)，葉片的所有傷口處都會(huì)長出愈傷組織（圖1i，j）。葉片誘導(dǎo)出的愈傷組織堅(jiān)硬、致密，而葉柄誘導(dǎo)出的愈傷組織疏松、淺黃色。

圖1 不同外植體形成的愈傷組織Fig.1 Callus formed by different explants

2.1.1 水曲柳松散型愈傷組織的誘導(dǎo)

將獲得的愈傷組織接種到含有TDZ、6-BA、NAA、IBA 4種植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中（F1～F9），光照培養(yǎng)20 d，通過愈傷組織形態(tài)和增殖率進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)4培養(yǎng)基的增殖率最高為462.86%（表4），并且愈傷組織疏松分生旺盛（如圖2），最適宜進(jìn)行水曲柳松散型胚性愈傷組織的增殖培養(yǎng)。

表4 增殖培養(yǎng)基的選擇與形態(tài)描述Table 4 Selection and morphological description of proliferation medium

圖2 F4培養(yǎng)基誘導(dǎo)的松散型愈傷組織Fig.2 Loose callus induction in F4 medium

對(duì)愈傷組織增殖率進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示，4種植物生長調(diào)節(jié)劑組合的培養(yǎng)對(duì)水曲柳愈傷組織增殖差異顯著（P＜0.05）。多重比較結(jié)果顯 示，F(xiàn)9、F8、F6之間，F(xiàn)7與F1之間，F(xiàn)1與F2之間，F(xiàn)2與F5、F3之間無顯著差異；F4與其他培養(yǎng)基間顯著差異。

將獲得的愈傷組織切片觀察，非胚性愈傷組織細(xì)胞大、疏松、不規(guī)則排列（圖3a）。而胚性愈傷組織會(huì)含有胚性細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)過編號(hào)F4的培養(yǎng)基培養(yǎng)1～2個(gè)繼代，通過切片觀察可以看到細(xì)胞小而緊密整齊的排列（圖3b），對(duì)球狀突起的愈傷組織切片可以觀察到類似于球胚的結(jié)構(gòu)（圖3c）。

圖3 愈傷組織切片形態(tài)觀察Fig.3 Morphological observation of callus slices

2.1.2 水曲柳胚性愈傷組織懸浮培養(yǎng)生長曲線

從細(xì)胞生長形態(tài)來看，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞數(shù)量也增多，顏色由綠色逐漸呈淡黃色（如圖4），說明培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)成分消耗導(dǎo)致細(xì)胞活力下降。取2 g胚性細(xì)胞接種于100 mL F4液體培養(yǎng)基中，每隔2 d取樣測(cè)量鮮質(zhì)量及干質(zhì)量，計(jì)算生長量，結(jié)果如圖5所示。細(xì)胞的生長符合S形生長，在第6 天開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，細(xì)胞生長量增加，到達(dá)18 d時(shí)，細(xì)胞生長達(dá)到最高值，之后開始降低。18 d時(shí)細(xì)胞生長量最高，但是細(xì)胞顏色呈黃色，也可能是細(xì)胞數(shù)量過大，培養(yǎng)基無法提供充足的營養(yǎng)，而16 d時(shí)，細(xì)胞顏色還是綠色，因此，水曲柳胚性愈傷組織懸浮細(xì)胞生長周期為16～18 d。

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間水曲柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)Fig.4 Cell morphology of suspension culture of F.mandshurica in different culture times

圖5 水曲柳細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生長曲線Fig.5 Growth curve of suspension culture of F.mandshurica

2.1.3 水曲柳細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液的pH和電導(dǎo)率

隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，培養(yǎng)液中的pH值先升高后降低，但基本維持在5左右。這也說明植物細(xì)胞自身對(duì)pH值具有較強(qiáng)的調(diào)控能力，使其達(dá)到適合生長的范圍。培養(yǎng)液中的電導(dǎo)率處于一個(gè)上下波動(dòng)的狀態(tài)，說明細(xì)胞在調(diào)節(jié)pH值時(shí)，所釋放的物質(zhì)也會(huì)影響培養(yǎng)液中的電導(dǎo)率變化（如圖6）。

圖6 懸浮培養(yǎng)液中pH及電導(dǎo)率Fig.6 pH and conductivity in suspension culture

2.1.4 蔗糖濃度對(duì)水曲柳懸浮細(xì)胞的影響

蔗糖作為碳源為植物細(xì)胞提供能量來源，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基內(nèi)的滲透壓。通過增加培養(yǎng)基中蔗糖含量，水曲柳細(xì)胞的增長率先升高后降低，當(dāng)蔗糖濃度為10 g/L時(shí)，由于滲透壓過小，不利于細(xì)胞生長，蔗糖濃度為20 g/L時(shí)滲透壓平衡，細(xì)胞增長提高，當(dāng)蔗糖濃度為30 g/L時(shí)，生長量達(dá)到最大，其中鮮質(zhì)量為400%，干質(zhì)量為500%，高于30 g/L時(shí)，滲透壓過高，細(xì)胞增長率明顯降低（如圖7）。通過細(xì)胞生長狀態(tài)的觀察，在蔗糖濃度為10～30 g/L時(shí)，細(xì)胞呈淺黃綠色，細(xì)胞的密度也隨著蔗糖濃度的增加而增加，當(dāng)蔗糖濃度為60～80 g/L時(shí)，細(xì)胞的密度沒有明顯增加，而且細(xì)胞顏色為淺褐色（如圖8）。

圖7 不同蔗糖濃度下細(xì)胞的增長率Fig.7 Cell growth rate at different sucrose concentrations

圖8 不同蔗糖濃度下培養(yǎng)20 d細(xì)胞生長狀態(tài)Fig.8 Growth state of cells cultured for 20 days under different sucrose concentrations

對(duì)不同蔗糖濃度下懸浮細(xì)胞增長率進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示不同蔗糖濃度對(duì)水曲柳懸浮細(xì)胞生長干質(zhì)量、鮮質(zhì)量差異均顯著（P＜0.05），多重比較結(jié)果顯示，干質(zhì)量中30 g/L蔗糖與其他濃度有顯著差異；鮮質(zhì)量中，糖濃度為60、80 g/L時(shí)與10、20 g/L無顯著差異，與30 g/L差異顯著；糖濃度為10 、20 g/L時(shí)與30 g/L無顯著差異（如圖7）。

2.1.5 氮、磷含量對(duì)水曲柳懸浮細(xì)胞的影響

氮是植物每個(gè)活細(xì)胞的組成部分，是生長的必需養(yǎng)分，當(dāng)?shù)爻渥銜r(shí)，植物可合成較多的蛋白質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的分裂和增長。通過添加KNO3來增加氮的含量，添加量為400 mg/L時(shí)，細(xì)胞鮮質(zhì)量的增長率為30%，干質(zhì)量增長率為95%（如圖9），細(xì)胞顏色為淺黃色（圖10a）。隨著氮的含量進(jìn)一步增加，細(xì)胞的增長率降低，氮含量增加1 200 mg/L時(shí)，細(xì)胞鮮質(zhì)量增長率10%左右，干質(zhì)量50%左右，細(xì)胞顏色由淺黃色變?yōu)榘咨▓D10c）。對(duì)愈傷組織增殖情況 進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示，說明增加氮的含量對(duì)細(xì)胞生長差異不顯著。多重比較結(jié)果顯示不同濃度氮源對(duì)細(xì)胞增殖情況無顯著差異。

圖9 不同濃度氮源下細(xì)胞增長率Fig.9 Cell growth rate under different concentrations of nitrogen source

磷是植物體內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)和酶等多種重要化合物的組成元素，磷對(duì)植物營養(yǎng)有重要的作用。增加磷的含量細(xì)胞增長率也增加，增加170 mg/L KH2PO4時(shí)，細(xì)胞鮮質(zhì)量增殖率為12%，干質(zhì)量的增殖率為36%。繼續(xù)增加340 mg/L KH2PO4時(shí)，細(xì)胞干鮮質(zhì)量增殖率都比增加170 mg/L KH2PO4時(shí)低（如圖11）。觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞均為白色（如圖12）。對(duì)細(xì)胞增殖情況做方差分析，結(jié)果顯示增加磷的濃度，細(xì)胞增殖率差異不顯著。

圖10 不同濃度氮源下細(xì)胞狀態(tài)Fig.10 Cell state under different concentrations of nitrogen source

圖11 不同濃度磷源下細(xì)胞增長率Fig.11 Cell growth rate under different concentrations of phosphorus source

圖12 不同濃度磷源下細(xì)胞狀態(tài)Fig.12 Cell status under different concentrations of phosphorus source

2.1.6 細(xì)胞接種量對(duì)水曲柳懸浮培養(yǎng)的影響

在50 mL F4液體培養(yǎng)基中，分別添加4、6、8、10 g胚性細(xì)胞，培養(yǎng)20 d后觀察，結(jié)果顯示，隨接種量增加，細(xì)胞生長率也再增加。接種量為10 g時(shí)，生長率最高，其中鮮質(zhì)量增長率為1 000%，而干質(zhì)量增長率為1 150%（如圖13）。觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，培養(yǎng)20 d時(shí)細(xì)胞均有不同程度的褐化，褐化程度隨接種量增加而增大（圖14）。因此，相同培養(yǎng)條件下，增加接種量可以提升細(xì)胞生長率，但培養(yǎng)時(shí)間不能超過細(xì)胞的生長周期，否則細(xì)胞會(huì)褐化。對(duì)不同接種量的懸浮細(xì)胞增長率進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示接種量對(duì)細(xì)胞增長差異顯著（P＜0.05），多重比較結(jié)果顯示，接種量2 g與4 g時(shí)無顯著差異，4 g與6 g無顯著差異，6 g與8 g無顯著差異，10 g與其他接種量差異顯著（如圖13）。

圖13 接種量對(duì)懸浮細(xì)胞增長量的影響Fig.13 Effect of inoculation amount on the growth of suspended cells

圖14 不同接種量下細(xì)胞生長狀態(tài)Fig.14 Cell growth status under different inoculation amounts

3 結(jié)論與討論

TDZ是一種人造植物生長調(diào)節(jié)劑，廣泛用于植物組織培養(yǎng)。 TDZ可以替代植物生長素和細(xì)胞分裂素[9-10]，但更廣泛地用于體外植物組織培養(yǎng)中以誘導(dǎo)枝條生長[11]，體細(xì)胞胚胎[12-13]，原生質(zhì)體分裂[14]和原球莖狀體[15]。在本研究中發(fā)現(xiàn)水曲柳愈傷組織的形成主要依賴于TDZ，TDZ濃度增加，愈傷組織也增加，如TDZ濃度為6 mg/L和7 mg/L時(shí)，水曲柳葉柄的愈傷組織誘導(dǎo)率最高分別為88.89%和96.97%，而6-BA濃度的增高或降低對(duì)水曲柳愈傷組織誘導(dǎo)影響較小，但在松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)中和增殖培養(yǎng)中，TDZ需要和6-BA、NAA和IBA聯(lián)合處理。

有研究報(bào)道，培養(yǎng)基中氮的種類和濃度會(huì)影響生物量的積累[16-18]，硝銨離子對(duì)植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)中生物活性化合物的積累有不同程度的影響，NH4+濃度較低和NO3-濃度較高時(shí)，不但有利于最佳生物量積累，而且也有利于多糖、多酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)的積累[19]。本研究中，增加NO3-濃度（400 mg/L），細(xì)胞鮮質(zhì)量的增長率提高30%，細(xì)胞顏色為淺黃色。但是不能一直增加，當(dāng)增加NO3-濃度1 200 mg/L時(shí)細(xì)胞鮮質(zhì)量增長率10%左右，細(xì)胞顏色由淺黃色變?yōu)榘咨?/p>

相對(duì)較高的蔗糖濃度有利于細(xì)胞生物量的積累，而較低的濃度影響次生代謝產(chǎn)物的積累[20-21]。在Bacopa monnieri的培養(yǎng)中，2%的蔗糖有利于生物量的積累，而無蔗糖的培養(yǎng)基有利于Bacopa含量的積累[22]。同樣，在Gymnema sylvestre細(xì)胞培養(yǎng)中，3%蔗糖濃度可以獲得較高的生物量積累，而4%的蔗糖濃度更適合代謝產(chǎn)物的積累[23]。在鐵皮石斛（Dendrobium officinale）原球莖懸浮培養(yǎng)中，5.0%蔗糖更適合生物質(zhì)的積累，而2.5%蔗糖更適合多糖、多酚和類黃酮的積累[19]。本研究中，蔗糖濃度為3%時(shí)，水曲柳細(xì)胞的增長率最高，隨著蔗糖濃度的增加，細(xì)胞的增長率也降低。這說明蔗糖濃度對(duì)細(xì)胞生長有著重要的作用，但較高的蔗糖濃度會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長產(chǎn)生抑制作用。

關(guān)于水曲柳的組織培養(yǎng)多年來也有研究報(bào)道。通過下胚軸誘導(dǎo)不定芽，但不定芽經(jīng)過繼代之后逐漸褐化死亡，最后存活率只有48.7%[24]。黃劍[25]也用水曲柳下胚軸為外植體，不定芽誘導(dǎo)率為83.3%，不定芽伸長培養(yǎng)一個(gè)月全部死亡。這說明水曲柳不定芽再生體系并不成熟，不定芽發(fā)育普遍不良，組培苗形成率低[6]。也有通過體細(xì)胞胚誘導(dǎo)繁殖水曲柳的報(bào)道，水曲柳體胚萌發(fā)率為60%，成熟率70%，但其中有59.9%為畸形胚，不能形成完整的植株[26]。張麗杰等[27]在1/2MS （MS 所有成分均減半）培養(yǎng)基中誘導(dǎo)水曲柳體胚發(fā)生，誘導(dǎo)率只有19.5%。以子葉為外植體誘導(dǎo)體胚誘導(dǎo)率為67%，其中約82%的體細(xì)胞胚是在褐化的子葉上出現(xiàn)[28]。這說明體細(xì)胞胚途徑繁殖水曲柳培養(yǎng)體系也有待進(jìn)一步優(yōu)化。以水曲柳葉柄和下胚軸為外植體，都可以誘導(dǎo)愈傷組織并進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，但從文章中的細(xì)胞形態(tài)觀察，懸浮細(xì)胞多為細(xì)胞團(tuán)，并不能獲得單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)的懸浮細(xì)胞[7-8]。而本研究通過對(duì)胚性愈傷組織的篩選和懸浮培養(yǎng)條件的優(yōu)化，利用WPM+0.3 mg/L TDZ+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/LIBA+3%蔗糖的液體培養(yǎng)基，可使水曲柳愈傷組織形成均一化的單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)，生長迅速并可以長期繼代培養(yǎng)。這一培養(yǎng)體系的建立，一方面為單細(xì)胞誘導(dǎo)水曲柳體細(xì)胞胚途徑再生水曲柳植株提供了技術(shù)和材料；另一方面為水曲柳次生代謝產(chǎn)物的調(diào)控機(jī)理研究提供了可能；第三為水曲柳單細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化或功能基因的瞬時(shí)表達(dá)提供了材料和技術(shù)。