金屬硫蛋白基因多態(tài)性及其病理學(xué)意義

彭歆瑞 韋宜汝 梁旭 韋紹芳 李政霖 謝慶媛 于祥遠(yuǎn) 黃波

桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院541100

0 引 言

金屬硫蛋白（metallothionein，MT）是一種富含半胱氨酸（～30%）、低相對分子質(zhì)量（～7 ku）、可結(jié)合多種重金屬如鋅（Zn）、鎘（Cd）、銅（Cu）的蛋白質(zhì)[1-2]。自1957年在馬腎皮質(zhì)中以Cd 結(jié)合蛋白被發(fā)現(xiàn)后，MT得到了廣泛的研究。但迄今其確切的生理學(xué)功能仍未明了，其可能具有維持必需金屬（Zn、Cu 等）的代謝和穩(wěn)態(tài)、重金屬（Cd、Hg、Pb、As 等）解毒以及拮抗氧化應(yīng)激和損傷等作用，并參與調(diào)控細(xì)胞的存活、增殖、侵襲、凋亡及血管生成和炎癥反應(yīng)等病理生理學(xué)過程[1-2]。研究結(jié)果表明，MT 的異常表達(dá)與重金屬所致腎損傷、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、神經(jīng)變性和腫瘤等病變有關(guān)[2]。由于MT 基因的多態(tài)性可影響其蛋白的表達(dá)及功能，因此本文對MT 基因的多態(tài)性及其相關(guān)的病理學(xué)過程作一綜述，為進(jìn)一步了解MT的功能提供參考。

1 MT 的同分異構(gòu)體及其表達(dá)調(diào)控

哺乳動(dòng)物的MT 有4 種異構(gòu)體，分別為MT-1、MT-2、MT-3 和 MT-4。其中 MT-1 和 MT-2 廣泛存在于各種細(xì)胞和組織中，以在肝和腎組織中的含量最高；MT-3 主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)，但在胰腺和腸組織亦有少量表達(dá)；而MT-4 僅存在于皮膚和舌的鱗狀上皮細(xì)胞中[1]。人類MT 至少有11 種功能性異構(gòu)體，即 MT-1A、MT-1B、MT-1E、MT-1F、MT-1G、MT-1H、MT-1M、MT-1X、MT-2A、MT-3 和 MT-4，此外還有 7 種不表達(dá)的假基因（MT-1C、MT-1D、MT-1I、MT-1J、MT-1L、PT-1P 和MT-2B），它們均定位于染色體16q12-22區(qū)域[1-3]。MT 存在多種亞型，關(guān)于其功能性異構(gòu)體以及假基因的作用尚不明了。

在MT-1 和MT-2 基因的啟動(dòng)子中含有調(diào)控其表達(dá)的TATA 盒、GC 盒和基礎(chǔ)水平元件，此外還含有幾個(gè)特異性調(diào)控元件如金屬應(yīng)答元件（metal response element，MRE）、抗氧化物應(yīng)答元件、糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件和甲狀腺素應(yīng)答元件。一些應(yīng)激因素（金屬、激素、缺氧、炎癥等）可通過介導(dǎo)MT 表達(dá)的調(diào)控因子（如MRE 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子-1、上游刺激因子-1 和核因子-1 等）與上述MT 基因啟動(dòng)子中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)和應(yīng)答元件結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)MT 的合成[3-4]。相反，另一些蛋白如含有痘病毒和鋅指結(jié)構(gòu)序列的蛋白PZ120 可與MT-2A 基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)結(jié)合，抑制MT-2A 的表達(dá)；而蛋白Ku80、DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（Dnmt 3a）可與甲基化CpG 結(jié)合蛋白MBD3 和染色質(zhì)重塑蛋白Brg1 相互作用，通過增加MT-1 基因啟動(dòng)子的甲基化抑制MT-1 的表達(dá)[4]。雖然MT-3 基因的啟動(dòng)子也含有MRE，但其表達(dá)似乎不受Zn 等金屬的誘導(dǎo)，提示MT-3 的表達(dá)調(diào)控有別于MT-1 和MT-2[5]。相比于MT-1 和MT-2 的表達(dá)主要受Zn2+、Cd2+等二價(jià)陽離子的誘導(dǎo)，MT-4 的表達(dá)更易受Cu+的影響[6]。

2 MT 的結(jié)構(gòu)及其與金屬的結(jié)合和抗氧化作用

金屬硫蛋白在種屬間呈高度保守，在哺乳動(dòng)物中，單個(gè) MT-1、MT-2 和 MT-4 分子均由 61～62 個(gè)氨基酸組成，而MT-3 含有68 個(gè)氨基酸，其中半胱氨酸（Cys）多達(dá) 20 個(gè)。在 MT 的肽鏈中，Cys 以 Cys-X-Cys、Cys-XX-Cys 或Cys-Cys 的方式排列（X 表示非Cys的其他氨基酸），并與賴氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）并排形成金屬結(jié)合的α-和β-結(jié)構(gòu)域。β-結(jié)構(gòu)域在MT的N-末端，由氨基酸1～30 組成，最多可結(jié)合3 個(gè)二價(jià)金屬離子（如 Zn2+、Cd2+、Hg2+或 Pb2+等）；而 α-結(jié)構(gòu)域位于C-末端邊緣，由氨基酸31～61/68 組成，可結(jié)合多達(dá)4 個(gè)二價(jià)金屬離子。α-和β-結(jié)構(gòu)域由非Cys的其他氨基酸連接或間隔（圖1）[7]。

Zn 是與MT 結(jié)合的生理性金屬離子，但其他非必需金屬離子如 Pb、Cd、Hg、Pt、Cr、Bi 和 Ag 等與MT 具有更強(qiáng)的親和力，而Fe2+相應(yīng)的親和力則較低。MT-3 與其他MT 分子的序列高度相似（約70%相同），但 MT-3 的 N-末端含有 Cys-Pro-Cys-Pro（氨基酸 6～9）序列，其他MT 則無此序列，這可能是MT-3 有別于其他MT 分子并表現(xiàn)獨(dú)特的抑制細(xì)胞生長作用的原因[7]。

MT 富含Cys 并可通過巰基與Zn2+結(jié)合的特點(diǎn)提示其具有抗氧化作用。研究結(jié)果表明，MT 正是通過氧化還原循環(huán)清除過量的活性氧（reactive oxygen species,ROS）和活性氮等氧化活性物質(zhì)。MT 與ROS發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，在清除ROS 的同時(shí)被氧化為二硫化物（MT-disulfide），Zn2+從 MT 中游離導(dǎo)致 MT-Zn 解離；在還原劑如谷胱甘肽存在的條件下，被氧化的MT 轉(zhuǎn)化為還原型MT（半胱氨酰硫醇）并促使Zn2+與MT 結(jié)合，從而使MT 恢復(fù)清除ROS 的能力[8]。在生理?xiàng)l件下ROS 是極其重要的第二信使，介導(dǎo)細(xì)胞生長、分化、周期進(jìn)展和死亡的全過程。但在病理?xiàng)l件下，過量的ROS 不僅可直接造成氧化應(yīng)激和損傷，還可通過異常激活多個(gè)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、腫瘤、神經(jīng)變性和炎癥等病理過程[9]。而MT 通過清除ROS 的抗氧化作用在上述病理過程中發(fā)揮重要作用[1,3]。

圖1 金屬硫蛋白分子中的金屬離子結(jié)合位點(diǎn)

3 MT 基因多態(tài)性及其與多種病理過程的關(guān)聯(lián)

MT 基因約1.5 kb，經(jīng)轉(zhuǎn)錄剪切后的mRNA 約含有500 個(gè)核苷酸，編碼區(qū)僅200 個(gè)核苷酸，但MT基因呈現(xiàn)豐富的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）（表 1）。其中 MT-1A、MT-1B、MT-1M、MT-2A、MT-3 和 MT-4 的 SNPs 已在多個(gè)研究中被證實(shí)與腫瘤、糖尿病、心血管疾病、慢性炎癥或重金屬的代謝及負(fù)荷等多種病理過程存在關(guān)聯(lián)[3]。

表1 MT 各亞型基因區(qū)域單核苷酸多態(tài)性及功能區(qū)域分布

3.1 MT-1A 基因的 SNPs（rs8052394、rs11640851 以及rs11076161）

rs8052394 是位于MT-1A 距起始密碼子第152個(gè)核苷酸的SNP（c.152A>G），可導(dǎo)致MT-1A 的氨基酸序列改變（Lys51Arg）。在職業(yè)性 Pb 暴露者中，G 等位基因與尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（UNAG）和累積血Pb 水平的時(shí)間加權(quán)指數(shù)增高相關(guān)[10]。病例對照研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與A 等位基因攜帶者相比，G 等位基因攜帶者的血清超氧化物歧化酶活性顯著降低，2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus,T2DM）風(fēng)險(xiǎn)增加，提示rs8052394 很可能是糖尿病易感基因位點(diǎn)之一[11-12]。但A 等位基因攜帶者更易罹患口腔鱗狀細(xì)胞癌，這可能是由于體內(nèi)Zn、Cu 平衡的改變影響了與其結(jié)合的蛋白如抑癌蛋白p53 的功能[3]。此外有文獻(xiàn)報(bào)道，在G 等位基因攜帶者中，隨著甲基汞攝入量的增加，頭發(fā)中的Hg 水平降低，G 等位基因因其抗氧化作用而對較大的有髓神經(jīng)具有保護(hù)作用[12]。

rs11640851 是位于MT-1A 編碼區(qū)自外顯子始第 80 個(gè)核苷酸的 SNP（c.80C>A），可導(dǎo)致 MT-1A 第27 位的蘇氨酸改變?yōu)樘於０罚═hr27Asn）。通過Zinpyr-1 熒光探針檢測發(fā)現(xiàn)，在攜帶C 等位基因的意大利老年婦女中，MT 可釋放更多的Zn2+，血中的MT和白細(xì)胞介素-6 水平降低，罹患心血管疾病和T2DM的風(fēng)險(xiǎn)更高，而A 等位基因攜帶者則更為長壽，提示rs11640851 與Zn 代謝、炎癥發(fā)生和長壽有關(guān)[11]。此外，A 等位基因可使個(gè)體神經(jīng)毒性的敏感性增高，提示該序列還與神經(jīng)毒性的敏感性有關(guān)[12]。

rs11076161 位于MT-1A 基因的第1 個(gè)內(nèi)含子區(qū)（c.29-28A>G）。在環(huán)境Cd 高水平暴露的人群中，A 等位基因攜帶者更易出現(xiàn)血Cd 水平升高以及腎損害標(biāo)志UNAG 和尿白蛋白改變，提示rs11076161與重金屬代謝及腎毒性有關(guān)[13]。在T2DM 患者的研究中發(fā)現(xiàn)，G 等位基因攜帶者更易患糖尿病性神經(jīng)病變，這可能與機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的Zn 利用率降低導(dǎo)致血清超氧化物歧化酶活性降低有關(guān)[12]。另有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A 等位基因攜帶者患口腔鱗狀細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)降低，這可能是由于rs11076161 參與了Zn 和Cu的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，表明A 等位基因可能對口腔癌具有保護(hù)作用[14]。此外，在接觸 Cd 的中國人群中，MT-1A 中的 rs11076161 以及MT-2A 的 rs10636 與骨密度變異之間的相關(guān)性較弱。因此，MT 的遺傳變異是否與Cd 引起的骨質(zhì)流失有關(guān)尚待進(jìn)一步研究[15]。

3.2 MT-1B 基因的 SNPs（rs964372、rs7191779 以及rs8052334）

rs964372 位于MT-1B 基因的第1 個(gè)內(nèi)含子區(qū)（c.28+137C>G），rs7191779 位于 MT-1B 基因的上游（c.-1975C>G），而rs8052334 位于MT-1B 基因的第 2 個(gè)內(nèi)含子區(qū)（c.95-68T>C）。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rs964372的G 等位基因攜帶者其肝細(xì)胞癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高（風(fēng)險(xiǎn)比率比配為2.52），而同時(shí)攜帶rs8052394/rs964372/rs8052334 分別為A/G/T 等位基因的吸煙者罹患肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)更高（風(fēng)險(xiǎn)比率比配為6.72），顯示MT-1B 對吸煙所致氧化應(yīng)激具有影響[16]。在T2DM 患者中，rs964372 變異與脂肪酸利用率降低之間存在顯著相關(guān)[12]。此外，rs964372 及rs7191779的C 等位基因攜帶者的口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)均降低[比值比（odds ratio,OR）分別為 0.49 和 0.36][14]。

3.3 MT-1M 基因的 SNPs（rs2270836 和 rs9936741）

rs2270836 位于MT-1M 基因的第2 個(gè)內(nèi)含子區(qū)（c.95-49G>A），rs9936741 位于 MT-1M mRNA 的第327 個(gè)核苷酸（c.*31T>C）。研究結(jié)果表明，rs2270836的AA 基因型攜帶者其尿Hg 水平明顯低于GG 基因型攜帶者，提示rs2270836 可能通過改變MT 的結(jié)構(gòu)來影響蛋白與Hg 離子的結(jié)合；rs9936741 的TT基因型攜帶者其頭發(fā)中的Hg 含量低于TC 或CC基因型攜帶者[17]。

3.4 MT-2A 基因的 SNPs（rs10636、rs1610216 以及rs28366003）

rs10636 位于 MT-2A 基因的 3′非翻譯區(qū)域（c.*77G＞C）。研究者發(fā)現(xiàn)，在 T2DM 患者中，rs10636與高脂血癥和T2DM 并發(fā)神經(jīng)病變顯著相關(guān)[3]。在Pb 暴露工人中，rs10636 的CC 基因型會提高手部的神經(jīng)毒性敏感性，但對腳部影響不大[12]。病例對照研究結(jié)果顯示，rs10636 在共顯性和隱性模式下與乳腺癌高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)（C/C 比 G/G：OR=1.86，95%CI：1.17～2.94，P=0.008；C/C 比 G/G+G/C：OR=1.96，95%CI：1.26～3.05，P=0.003）[18]。在頸動(dòng)脈狹窄患者中，rs10636的G 等位基因攜帶者更易形成頸動(dòng)脈斑塊，血液中的單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）含量升高，自然殺傷細(xì)胞毒性和細(xì)胞內(nèi)的Zn2+利用度降低，血紅細(xì)胞中的Zn、Cu 和Mg水平下降，而血漿中的Fe 水平升高，提示微量元素內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡[19]。推斷MCP-1 含量升高和自然殺傷細(xì)胞毒性降低可能是Zn2+水平下降所致，而MCP-1 與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系已在人體和動(dòng)物模型上得以驗(yàn)證[19]。此外，rs10636 的CC 基因型攜帶者其尿Hg水平低于GG 基因型攜帶者[17]。在奧地利學(xué)生中，rs10636 變異與血Pb 濃度呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)也與尿中Cd、Cu 和Zn 的濃度較低有關(guān)，其似乎是調(diào)節(jié)尿Cd、Cu、Zn 的“熱點(diǎn)”[20-21]。

rs1610216 位于 MT-2A 基因的啟動(dòng)子區(qū)域（c.-209A＞G）。在非吸煙人群中，rs1610216 與糖尿病無關(guān)聯(lián)；但在吸煙人群中，A 等位基因攜帶者罹患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高（OR=3.96）；而在吸煙的冠心病患者中，糖尿病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步升高（OR=5.50）[3]。有病例對照研究結(jié)果顯示，rs1610216 中CC 基因型與TT基因型相比，群體罹患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)增加了3.8 倍[21]。

rs28366003 位于 MT-2A 基因 TATA 盒與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之間，在核心啟動(dòng)子的共有序列TGCACTC中（c.-77A＞G），該遺傳變異可改變轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的親和力，從而影響MT-2A 的轉(zhuǎn)錄[21]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 As 暴露人群中，rs28366003 的 G 等位基因可導(dǎo)致MT-2A 表達(dá)下調(diào)，從而使結(jié)合并運(yùn)輸至肝臟進(jìn)行生物代謝的As 減少，尿樣分析結(jié)果可見As 甲基化減少，亞砷酸鹽[As(Ⅲ)]排泌增加[22]。在Pb 暴露工人中，G 等位基因使Pb 神經(jīng)毒性的敏感性有所提高，GG 基因型攜帶者血液樣本中的Pb 濃度高于AA 或AG 基因型攜帶者[12]。在西班牙北部人群中，AG 基因型攜帶者罹患干性年齡相關(guān)性黃斑變性的風(fēng)險(xiǎn)是 AA 基因型攜帶者的 9 倍以上（OR=9.39）[23]，而同時(shí)攜帶rs10636 GC 和rs28366003 AA 基因型則可降低Pb 暴露所致高密度脂蛋白膽固醇水平下降的風(fēng)險(xiǎn)[24]。另有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rs28366003 A/G 等位基因攜帶者罹患喉癌的風(fēng)險(xiǎn)約增加1.6 倍（OR=2.63，95%CI：1.41～2.85，P＜0.001）[25]。-5A/G 可影響鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤組織中MT-2A 的表達(dá)及Cd、Cu 的含量[26]。與AA 基因型攜帶者相比，GG 基因型攜帶者罹患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)增加了4 倍[21]。此外，rs28366003可影響前列腺組織中MT-2A 的表達(dá)，這可能與細(xì)胞缺乏對某些重金屬（Cd、Pb）毒性作用的保護(hù)以及必需金屬穩(wěn)態(tài)的失常有關(guān)，但該特殊作用還有待進(jìn)一步研究[26]。

3.5 MT-3 基因的 SNPs（rs45570941）

MT-3 亞型是腦特異性MT，故其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展中的作用備受關(guān)注。rs45570941 位于MT-3 基因的第 2 個(gè)內(nèi)含子區(qū)（c.97+377G＞C）。此基因型和等位基因頻率在中國自閉癥兒童與對照之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），提示自閉癥可能與金屬代謝障礙有關(guān)[27]。但在另一項(xiàng)更大樣本量的研究中（132 例病患比132 例對照），未能證實(shí)MT-3 表達(dá)水平和MT-3 遺傳變異與自閉癥存在關(guān)聯(lián)[28]。因此，MT-3 的基因多態(tài)性與神經(jīng)疾病的關(guān)系尚有待作進(jìn)一步探討。

3.6 MT-4 基因的 SNPs（rs396230）

rs396230 位于MT-4 基因的第2 個(gè)內(nèi)含子區(qū)域（c．98-137A＞G）。研究結(jié)果顯示，與 rs396230 AA 基因型相比，GG 基因型攜帶者的收縮壓升高10 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）；GG 和 GA 型攜帶者間血清肌酐、尿素氮和尿酸等腎功能指標(biāo)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），提示 G 等位基因攜帶者對 Pb 具有更大的易感性，應(yīng)避免Pb 暴露[29]。該結(jié)果可能對Pb 暴露工人的就業(yè)前體檢具有一定的指導(dǎo)性意義。

4 展 望

MT 基因具有多種功能亞型和假基因形式，各MT 亞型蛋白通過拮抗過量ROS 等造成的氧化應(yīng)激和損傷，參與人體動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、腫瘤、神經(jīng)變性等重要病理生理學(xué)過程，但MT 各亞型間的結(jié)構(gòu)差異及生理學(xué)功能仍有待進(jìn)一步闡明。

MT 基因的 5′非翻譯區(qū)、3′非翻譯區(qū)、剪切位點(diǎn)等多種功能區(qū)域均存在SNPs，這些SNPs 可能參與調(diào)控MT 基因轉(zhuǎn)錄及蛋白結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而影響其生理學(xué)功能。雖已證實(shí)MT 的部分SNPs 與多種腫瘤、糖尿病等疾病存在顯著關(guān)聯(lián)，但仍難以全面反映MT 基因的SNPs 在病理生理學(xué)過程中的遺傳效應(yīng)以及可能存在的遺傳-環(huán)境交互作用。此外，與疾病顯著關(guān)聯(lián)的SNPs 是否可作為生物學(xué)標(biāo)志用于預(yù)測疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后，為疾病的個(gè)體化防治提供作用靶點(diǎn)，仍有待進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突