結腸癌轉移相關基因1在胃癌組織和血清中的表達及相關性研究

王瑋尉 梁美霞 許慶文 徐飛鵬 林琳 黃哲 殷靜雯

1廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院胃腸外科，湛江524001；2廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，湛江524001通信作者：殷靜雯，Email：amysays＠live.cn

0 引 言

胃癌是常見的惡性腫瘤，且惡性程度高、早期診斷困難、預后較差，對人類健康構成巨大威脅[1-2]。臨床病理學分期難以在早期發(fā)現(xiàn)部分高風險的胃癌患者，如一些臨床病理分期較早，但術后腫瘤復發(fā)或發(fā)生異時轉移的胃癌患者。目前，隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制研究的深入，已證實基因的異質性對患者預后有重要影響[3]，為胃癌的診治開辟了新的方向。

結腸癌轉移相關基因1（metastasis-associated in colon cancer 1，MACC1）是與胃腸道腫瘤密切相關的基因[4]。MACC1 高度表達于結腸癌和轉移灶中[5]。研究結果表明，MACC1 基因位于罹患胃腸道腫瘤的風險區(qū)域（7p21.1），在胃腸道及消化系統(tǒng)腫瘤（如胃癌、肝癌、胰腺癌）中高表達[6-7]。臨床研究結果表明，MACC1 是決定結腸癌轉移的因子之一，遠處轉移的結腸癌患者在癌癥發(fā)生初期MACC1 的表達已經(jīng)顯著增高。因此，組織中MACC1 的表達可能預示著腫瘤生物學行為向惡性轉變，原發(fā)腫瘤可能會發(fā)生遠處轉移[7-9]。

有研究者指出，胃癌原發(fā)性病灶的MACC1 表達陽性率明顯高于癌旁黏膜，并與胃癌生存期相關[10-11]。Shirahata 等[12]發(fā)現(xiàn)MACC1 在發(fā)生腹膜散播轉移的胃癌中高表達。大量研究結果已經(jīng)證實MACC1 與胃癌存在相關性。綜上，MACC1 分子對于腫瘤患者的發(fā)病風險識別、診斷及預后預測都具有臨床應用前景。本研究中，通過檢測胃癌組織和血清中MACC1 的表達，分析血清中MACC1 水平對胃癌的診斷特征，以期為胃癌發(fā)現(xiàn)及診斷提供新的分子生物學指標。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院胃腸外科于2011年6月至 2020年11月收治的 51 例經(jīng)手術治療的胃癌患者，其中男性35 例，女性16 例，年齡59.6±11.7 歲。收集患者的血清標本、胃癌組織標本、癌旁組織標本、正常胃黏膜標本及相應臨床資料。納入標準：患者在術前及術中均未進行化學治療和放射治療；經(jīng)術前或術后病理證實為胃癌。胃癌的臨床病理分期參照國際抗癌聯(lián)盟的第5 版胃癌TNM（tumor-lymphnode-metastasis）分期法。本研究已經(jīng)過廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院機構審查倫理委員會批準，所有納入患者均知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 主要材料與儀器

MACC1（D-15）抗體（sc-163595，美國 Santa Cruz公司），MACC1 酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司），超敏即用型二步法（非生物素）檢測試劑盒（PV-9003，北京中杉金橋生物技術有限公司）。

RM2235 型石蠟切片機（德國Leica 公司），TS100-F相差倒置顯微鏡（日本Nikon 公司），Multiskan MK3酶標儀（德國Thermo Scientific 公司）。

1.3 方法

1.3.1 血樣及標本采集

用血清分離管收集納入胃癌患者的術前全血標本1 ml。血樣在室溫放置2 h 后，立即用1 000×g離心20 min，取上清放入EP 管，置于-80 ℃保存。于粵西地區(qū)臨床病例資料庫中，取40～70 歲正常人血清標本 30 例（男 15 例，女 15 例）作為陰性對照，且使用前置于-80 ℃保存。

收集胃癌患者離體0.5 h 內(nèi)的新鮮胃癌組織標本、距癌組織2～2.5 cm 的癌旁組織和距癌組織大于5 cm 的胃癌正常組織。將新鮮組織標本立即放入體積分數(shù)為10%的福爾馬林溶液中固定。

1.3.2 雙抗體夾心ELISA 法檢測血清MACC1 表達

采用雙抗體夾心法檢測血清中MACC1 的表達。測試前，將ELISA 試劑盒中的所有試劑、血清標本緩慢均衡至室溫，所有標本均標上序號。稀釋標準品（凍干品），按濃度高到低加入500 μl 標準品稀釋液，依次稀釋成 20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 ng/ml 標準液。稀釋A、B 工作液，分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔。標準孔有7 孔，依次加入100 μl 不同濃度的標準品；空白孔加 100 μl 標準品稀釋液；分別將100 μl 腫瘤患者血清及陰性對照組血清加入待測樣品孔中。酶標板加上覆膜，37 ℃溫育2 h。棄去孔內(nèi)液體，洗滌液洗滌，加B 工作液，棄去孔內(nèi)液體。每孔加底物溶液50 μl，酶標板加上覆膜，37 ℃避光顯色25 min。在確保酶標板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標儀在450 nm 波長下檢測各孔的光密度值。

1.3.3 免疫組織化學染色

取正常黏膜組織、癌旁組織、胃癌組織，大小均約 1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm，以 1∶10 的體積比置于體積分數(shù)為10%的中性甲醛固定液中固定。用梯度乙醇溶液脫水后，用石蠟包埋。在石蠟切片機上，將組織蠟塊切成4 μm 的薄片，用漂浮法將切片置于干凈的載玻片上，將其放入烤片盒中，于60 ℃恒溫箱內(nèi)烤片25 min。然后用常規(guī)方法進行蘇木素-伊紅染色。

將正常黏膜、癌旁組織、胃癌組織石蠟切片進行水化。將切片浸入pH=6.0，0.01 M 的枸櫞酸修復液中，微波爐加熱進行抗原修復。用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌 3 次。滴加正常羊血清封閉液50 μl（A 液）封閉。滴加一抗稀釋液（用 PBS 按 1∶50 稀釋）后，4 ℃過夜。滴加辣根過氧化物標記山羊抗驢 IgG（B 液）50 μl，37 ℃ 孵育30 min。滴加辣根過氧化物酶標記鏈酶卵白素（C 液）50 μl。用二氨聯(lián)苯胺（diamio benzidine，DAB）顯色，蘇木素復染，藍化，無水乙醇脫水。滴加中性樹脂，封片后用相差倒置顯微鏡觀察并拍照，拍照時保證顯微鏡光源亮度穩(wěn)定、曝光時間一致。

應用 Image-Pro Plus（V6.0.0.260）圖像處理分析軟件對胃癌組織免疫組化圖片進行定量分析，統(tǒng)計陽性表達的累積光密度（integrated optical density，IOD）和平均光密度（mean density）。對細胞膜、細胞核、胞漿中的棕色顆粒細胞進行分析，MACC1 蛋白陽性部位主要在胞漿。判斷標準：低倍鏡下選取MACC1 蛋白陽性細胞最密集區(qū)，再于100 倍鏡下計數(shù)2～3 個視野中的細胞，在組織切片中顯示胞漿染色為淡黃色至棕褐色為陽性標志，以陽性細胞占視野中細胞的百分數(shù)（%）來表示，陽性百分率≥20%為陽性表達。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS18.0 統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料采用均值±標準差（Mean±SD）表示，兩組比較采用獨立樣本t 檢驗，三組比較采用方差分析，組間多重比較采用LSD-t（least significant difference-t）檢驗。計數(shù)資料用卡方檢驗，相關分析采用Pearson 相關性分析。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

采用受試者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線評價診斷效力，采用約登指數(shù)（即敏感性+特異性-1）評估最佳臨界值。

2 結 果

2.1 MACC1 在正常胃黏膜組織、癌旁組織、胃癌組織中的表達

正常胃黏膜組織、癌旁組織、胃癌組織的免疫組化染色圖片如圖1 所示。癌旁組織、胃癌組織的蘇木素-伊紅染色圖片如圖2 所示。MACC1 定位在胞漿。在正常胃黏膜組織中，MACC1 呈陰性表達或弱陽性表達，且在弱陽性表達組織中，陽性瘤細胞呈不規(guī)則小灶型分布。在癌旁組織中，MACC1 呈陰性表達或中陽性表達，且在中陽性表達組織中，陽性細胞呈腺管型分布。在胃癌組織中，MACC1 呈中陽性或強陽性表達，陽性細胞呈彌漫型。

圖1 正常胃黏膜組織、癌旁組織、胃癌組織中結腸癌轉移相關基因1（MACC1）的免疫組化染色圖片（×400）

圖2 癌旁組織、胃癌組織的蘇木素-伊紅染色圖片（×400）

在所有51 例患者的組織標本中：正常胃黏膜組織中10 例MACC1 蛋白陽性表達，陽性率19.61%；癌旁組織中13 例陽性表達，陽性率25.49%；胃癌組織中26 例陽性表達，陽性率50.92%。（表1）

表1 結腸癌轉移相關基因1（MACC1）在胃癌組織、癌旁組織、正常胃黏膜組織中的表達情況

2.2 MACC1 在胃癌患者血清中的表達

在30 例正常對照中，MACC1 的表達水平為（0．12±0．08）ng/ml，51 例胃癌患者中，MACC1 的表達水平為（0．20±0．13）ng/ml，兩者差異有統(tǒng)計學意義（t＝3．18，P＝0．002）（圖 3）。診斷測試 ROC 曲線表明，血清MACC1 對胃癌具有診斷效力，其曲線下面積（area under curve，AUC） 為 0.717，最佳臨界值為0.38，相應的靈敏度為0.55，特異度為0.83（圖4）。

圖3 胃癌患者血清結腸癌轉移相關基因1（MACC1）表達水平

圖4 血清血清結腸癌轉移相關基因1（MACC1）對胃癌的診斷測試ROC 曲線

2.3 MACC1 在胃癌組織及血清中表達的關系

在胃癌組織MACC1 陰性表達組中，患者血清MACC1 表達水平為（0.16±0.12）ng/ml；在胃癌組織MACC1 陽性表達組中，患者血清MACC1 表達水平為（0.24±0.13）ng/ml，兩者差異有統(tǒng)計學意義（t=2.35，P=0.023）。進一步結合分析免疫組化結果，證實MACC1 在胃癌患者血清和胃癌組織中表達水平呈正相關關系（r=0.52，P＜0.01），如圖 5 所示。

圖5 胃癌患者組織與血清中結腸癌轉移相關基因1（MACC1）水平的相關性分析

2.4 胃癌組織及血清MACC1 的表達與臨床病理參數(shù)的關系

2.4.1 胃癌組織MACC1 低表達和高表達組患者的臨床病理參數(shù)分析

對比分析了胃癌組織MACC1 低表達和高表達組患者的臨床病理參數(shù)。臨床病理參數(shù)包括：性別（男、女）、年齡（＜55 歲、≥55 歲）、腫瘤發(fā)生部位（賁門底部、胃體部、幽門中部）、病理類型（腺癌、非腺癌）、胃壁浸潤深度（T1～T4）、局部淋巴結轉移情況（N0～N3）、遠處轉移情況（是、否）、TNM 分期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）、腫瘤最大直徑（＜4.5 cm、≥4.5 cm）。結果表明，胃癌組織MACC1 低表達和高表達組在上述病理參數(shù)方面的差異均無統(tǒng)計學意義，統(tǒng)計指標分別為：性別（χ2=0.49，P=0.49）、年齡（t=0.40，P=0.69）、腫瘤發(fā)生部位（χ2=1.08，P=0.58）、病理類型（χ2=0.27，P=0.61）、胃壁浸潤深度（χ2=0.25，P=0.97）、局部淋巴結轉移（χ2=1.21，P=0.75）、遠處轉移（χ2=0.18，P=0.52）、TNM 分期（χ2=1.08，P=0.78）、腫瘤最大直徑（t=0.38，P=0.71）。

2.4.2 胃癌患者血清MACC1 低表達和高表達組患者的臨床病理參數(shù)分析

對比分析了胃癌患者血清MACC1 低表達和高表達組患者的臨床病理參數(shù)。臨床病理參數(shù)包括：性別（男、女）、年齡（＜60 歲、≥60 歲）、腫瘤發(fā)生部位（賁門底部、胃體部、幽門中部）、病理類型（腺癌、非腺癌）、胃壁浸潤深度（T1～T4）、局部淋巴結轉移情況（N0～N3）、遠處轉移情況（是、否）、TNM 分期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）、腫瘤最大直徑（＜4.5 cm、≥4.5 cm）。

結果表明，胃癌患者血清MACC1 低表達和高表達組在上述病理參數(shù)方面的差異均無統(tǒng)計學意義，統(tǒng)計指標分別為：性別（t=0.88，P=0.38）、年齡（t=0.43，P=0.67）、腫瘤發(fā)生部位（F=0.45，P=0.64）、腫瘤類型（t=0.65，P=0.52）、胃壁浸潤深度（F=0.74，P=0.54）、局部淋巴結轉移（F=1.15，P=0.34）、遠處轉移（t=1.02，P=0.31）、TNM 分期（F=0.57，P=0.64）、腫瘤最大直徑（t=1.62，P=0.11）。

3 討論與結論

本研究結果表明，胃癌患者的血清MACC1 表達水平為（0.20±0.13）μg/ml，而正常對照組為（0.12±0.08），二者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；對比癌旁組織和正常組織，胃癌組織中MACC1 表達明顯升高（P＜0.01）；胃癌患者血清及胃癌組織中的MACC1表達水平呈正相關；胃癌患者MACC1 的表達水平與其臨床病理參數(shù)（性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位、腫瘤大小、病理分型、胃壁浸潤深度、局部淋巴結轉移、遠處轉移、TNM 分期）的關系均無統(tǒng)計學意義（均 P ＞0.05）。但胃癌患者血清和胃癌組織中MACC1 呈高表達，提示MACC1 與胃癌的發(fā)生關系密切，該結果與國內(nèi)外其他研究結果相一致[13-14]。

MACC1 已被證明與腫瘤發(fā)生和腫瘤進展高度相關，并對胃癌患者的臨床結局產(chǎn)生不利影響。關于MACC1 在胃癌中的作用機理，研究結果表明MACC1 可促進上皮向間充質轉化并加速癌癥轉移。此外，MACC1 還參與了許多胃癌標志物的調(diào)控。MACC1 可能通過與MET 啟動子結合后增強MET表達，從而調(diào)控HGF/MET 通路[4]。MET 蛋白是由原癌基因c-met 編碼的人肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）的細胞膜特異性受體。HGF 是肝細胞內(nèi)皮細胞分泌的多效生長因子。人胃癌細胞株中HGF 的表達在腫瘤細胞從G0、G1 期進入S 期時逐漸增高。HGF 與特異性MET 受體結合誘導下游信號系統(tǒng)，引起細胞增殖、黏膜上皮轉化，促進血管生成，增強細胞運動，加強腫瘤細胞侵襲轉移等。而MACC1 siRNA 能抑制細胞增殖和移動，減少體內(nèi)轉移，并使MET mRNA 和其蛋白的表達大大減少，抑制細胞移動和增殖[15]。MACC1 通過調(diào)控TWIST1/2促進血管生成，增加腫瘤的血液供應[16]。MACC1 還可通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子C/D（vascularendothelial growth factor C/D，VEGF-C/D）的細胞外分泌來促進胃癌淋巴管生成，這表明MACC1 可能參與胃癌的淋巴傳播調(diào)控途徑[17]。此外，MACC1 通過增強Warburg效應來支持代謝應激下的胃癌生長[18]。綜上，MACC1參與胃癌細胞內(nèi)部和外部的多個生物學過程，使其成為腫瘤微環(huán)境調(diào)控的重要因子。

本研究中，檢測并對比正常人及胃癌患者血清中的MACC1 表達情況，發(fā)現(xiàn)MACC1 水平在胃癌患者血清中明顯增高，這一發(fā)現(xiàn)有助于胃癌的輔助診斷及普查。本研究結果顯示，胃癌患者血清及胃癌組織中的MACC1 表達水平呈正相關關系。因此，推測血清中的MACC1 的表達水平可能與胃癌患者發(fā)病、癌癥的發(fā)展及預后有關。血清標本易于搜集，因此可能為胃癌患者診斷及預后判斷提供生物學參考。血清及胃癌組織的MACC1 表達與患者的各項臨床病理參數(shù)無關，這可能使MACC1 成為獨立于TNM 的臨床病理分期指標及預后的預測指標。因此，對MACC1 的研究能為胃癌的基因治療提供了良好的前景。

綜上所述，MACC1 水平與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及預后存在高相關性，其可以作為胃癌診斷預測的參數(shù)，且有望成為胃癌治療的新分子靶標。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突