復方甘桑洗液抗菌及止癢作用研究

侯小濤，李 聰，郝二偉，杜正彩，許翠霞，鄧家剛

（1.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530200；2.廣西中藥藥效研究重點實驗室，廣西 南寧 530200；3.廣西農(nóng)作物廢棄物功能成分研究協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530200）

甘蔗葉是禾本科植物甘蔗SaccharumOfficinarum的干燥葉，八角茴香葉為木蘭科植物八角Illicium verumHook.f.的新鮮葉子，柚葉為蕓香科植物柚Citrus grandis（L.）Osbeck 的新鮮葉子，三種均為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的農(nóng)作物廢棄物。目前，國內(nèi)外對甘蔗葉、柚葉、八角茴香葉等農(nóng)作物廢棄物的處理方法多為焚燒和丟棄，造成嚴重的資源浪費和環(huán)境污染。前期研究顯示，此3 種農(nóng)作物廢棄物均具有一定的藥用價值。中藥洗液是常見的外用制劑，臨床中常用于婦科炎癥［1-2］、皮炎［3］、濕疹［4］、痔瘡術(shù)后［5］等，具有起效快、安全、制備工藝簡單等特點。為充分利用農(nóng)作物廢棄物，變廢為寶，提高甘蔗、柚、八角茴香3 種農(nóng)作物的經(jīng)濟價值，廣西農(nóng)作物廢棄物功能成分協(xié)同創(chuàng)新中心主任鄧家剛教授結(jié)合臨床用藥經(jīng)驗，以甘蔗葉、桑白皮、柚葉、八角茴香葉、兩面針、救必應、薄荷油組成復方甘桑洗液，臨床用于婦科炎癥具有較好療效。本研究探討復方甘桑洗液的抗菌、止癢作用，為開發(fā)新制劑及其臨床應用提供科學依據(jù)。

1 實驗材料

1.1菌種 大腸埃希菌（ATCC29522）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、白色念珠菌（ATCC10231）等3 株菌種購自廣東省微生物菌種保藏中心；銅綠假單胞菌（ATCC27853）由廣西中醫(yī)藥大學微生物與免疫教研室保藏中心提供。

1.2動物 SPF級ICR種小鼠60只，雌性，體質(zhì)量20±2 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2016-002。小鼠自由攝食和飲水，溫度20～25 ℃，相對濕度55%～70%，自然光照，實驗前適應性喂養(yǎng)7 d。

1.3主要藥物與試劑 復方甘桑洗液（廣西大海陽光藥業(yè)有限公司，批號：S161201）；潔爾陰洗液（四川恩威制藥有限公司，批號：170417）；營養(yǎng)瓊脂（批號：1064851）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（批號：3105780）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號：3106001）、麥氏比濁管（批號：5105248）均由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)；4-氨基吡啶（上海麥克林生化科技公司，純度98%，批號：C10096638）；硫化鈉（分析純，天津市大茂化學試劑廠，批號：20170327）。

1.4儀器 牛津杯（規(guī)格：7.8 mm×6.0 mm×10.0 mm）；超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號：SW-CJ-2FD）；生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司，型號：LRH-150F）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠，型號：YXQ-LS-50S11）；電子數(shù)顯游標卡尺（日本Mitutoyo公司，型號：500-196）。

2 方法與結(jié)果

2.1復方甘桑洗液的制備 將甘蔗葉750 g、桑白皮300 g、救必應450 g、毛兩面針750 g 等4 味藥除去雜質(zhì)，用純凈水沖冼干凈，稍潤，切段，收集在托盤中，置烘房內(nèi)于60 ℃下干燥至含水量為8%～12%。取出，裝入潔凈的容器中備用。新鮮柚葉及八角茴香葉除去雜質(zhì)后用純凈水沖冼干凈，稍潤，取出，裝入潔凈的容器中備用。按多功能提取罐操作規(guī)程進行操作，將凈制后的八角茴香葉450 g、柚葉450 g置提取罐內(nèi)，加入6倍藥材量的水，提取揮發(fā)油，另存；藥渣加入甘蔗葉、桑白皮、救必應、毛兩面針中，每次加入8 倍藥材量的水，回流提取2次，每次1 h（煮沸開始計時），合并提取液，過濾，濃縮成稠膏狀（相對密度不低于1.10），取出置干燥潔凈的容器內(nèi)備用。將濃縮后的稠膏置離心機中離心，除去不溶性及其他大分子的雜質(zhì)，取出置潔凈容器內(nèi)備用。將離心后的稠膏加入配制罐中，加入揮發(fā)油，再加入純化水至5 L，過濾，加薄荷油10 g攪拌混合均勻，灌裝，輻射滅菌，制成含生藥量為0.62 g/ml 洗液。此制備過程由廣西大海陽光藥業(yè)有限公司制劑車間完成。

2.2體外抑菌實驗

2.2.1菌種復蘇及傳代 按說明書分別配制營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，熱溶解后倒入90 mm 玻璃平板，鋪板厚度為4～5 mm，放涼凝固后備用。取出菌種后將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等3種細菌劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，白色念珠菌則接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，之后將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌各含細菌平板置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，白色念珠菌置于25 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。菌種復蘇后傳代2次以上備用。

2.2.2牛津杯法體外抑菌實驗［6-7］取活化后的菌種，用接種環(huán)挑取少量菌落，放置裝有適量無菌生理鹽水中，充分震搖后用0.5 麥氏比濁管進行比濁，再將菌懸液濃度調(diào)整至1×106～6×106CFU/ml，用無菌一次性拭子蘸取菌懸液均勻涂抹于營養(yǎng)瓊脂平板或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，將3 個牛津杯等距離放置于含菌平板上，按每個0.2 ml的量依次加入復方甘桑洗液、無菌生理鹽水、潔爾陰洗液，設3個平行實驗。將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌含細菌平板置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，白色念珠菌含細菌平板置于25 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。用游標卡尺測量抑菌圈直徑，試驗重復3次，結(jié)果以均數(shù)±標準差（±s）表示。抑菌圈直徑＜6 mm 為耐藥；抑菌圈直徑6～9 mm為輕度敏感；抑菌圈直徑10～14 mm 為中度敏感；抑菌圈直徑15～20 mm 為高度敏感；抑菌圈直徑＞20 mm 為極度敏感。結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，復方甘桑洗液對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌均為輕度敏感，對金黃色葡萄球菌為極度敏感，其抑制效果略優(yōu)于陽性藥潔爾陰洗液。

表1 牛津杯法測定藥物抑菌圈直徑的結(jié)果 （mm，±s）

表1 牛津杯法測定藥物抑菌圈直徑的結(jié)果 （mm，±s）

藥物復方甘桑洗液潔爾陰洗液生理鹽水大腸埃希菌6.59±0.42 22.35±0.49 0金黃色葡萄菌23.05±1.47 21.04±0.51 0銅綠假單胞菌6.89±0.36 32.84±0.87 0白色念珠菌6.47±0.69 17.45±1.35 0

2.2.3最小抑菌濃度測定（minimal inhibitory concentration，MIC）［8］取滅菌后營養(yǎng)瓊脂及沙氏葡萄糖瓊脂，趁熱按二倍稀釋法［9］配制成復方甘桑洗液藥物濃度為620 mg/ml、310 mg/ml、155 mg/ml、77.5 mg/ml、38.75 mg/ml、19.38 mg/ml、9.69 mg/ml、4.84 mg/ml、2.42 mg/ml、1.21 mg/ml 共10 個梯度的含藥培養(yǎng)基，每梯度分3 份并按梯度順序標記1～10 后傾入培養(yǎng)皿中冷卻凝固后備用。另取1∶1配制的含潔爾陰洗液藥液瓊脂平板3 個作陽性對照組，無藥物瓊脂培養(yǎng)基3 個作陰性對照組。同樣制備方法制備2 份，分別用于檢測藥物對細菌及白色念珠菌的MIC。取活化后的菌種，配制濃度為1.0×108CFU/ ml 菌懸液。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌3 種細菌等距離“之”字劃線接種于含藥營養(yǎng)瓊脂平板中，白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖瓊脂平板中，將接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌菌種后的平板置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，接種白色念珠菌菌種后的平板置于25 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后取出，2名研究者同時在光線充足的地方觀察，以完全無菌落生長的平板為復方甘桑洗液對該菌的最小抑制濃度（MIC），實驗重復3 次。結(jié)果顯示，復方甘桑洗液對白色念珠菌和大腸埃希菌的MIC為620 mg/ml，對銅綠假單胞菌的MIC值為155 mg/ml，對金黃色葡萄球菌MIC值為38.75 mg/ml。結(jié)果見表2。

表2 瓊脂稀釋法體外抑菌實驗結(jié)果

2.3對4-氨基吡啶（4-Aminopyridine，4-AP）致癢小鼠的影響［10-11］取ICR 雌性小鼠50 只，適應性喂養(yǎng)后，用10%硫化鈉（新鮮制備的純水配制）對每只小鼠頸背部脫毛，脫毛區(qū)域面積約為2 cm×2 cm。24 h 后選取脫毛區(qū)域無創(chuàng)口的小鼠40 只，隨機分為4 組：復方甘桑洗液高劑量組、復方甘桑洗液低劑量組、潔爾陰對照組及模型組。將小鼠稱重后，按照小鼠面積0.2 ml/cm2劑量用棉簽涂抹給藥，復方甘桑洗液高劑量組予100%濃度的復方甘桑洗劑，復方甘桑洗液低劑量組予50%濃度的復方甘桑洗液，潔爾陰對照組予100%濃度的潔爾陰洗液，模型組予純水，每間隔2 h給藥1次，每天5次，給藥2 d，末次藥后1 h按10 mg/kg（用生理鹽水配制成0.1 mg/ml）劑量給每只小鼠背部給藥區(qū)域中心皮下注射4-AP，注射后觀察10 min 內(nèi)小鼠舔背部的次數(shù)，以連續(xù)舔體后出現(xiàn)短暫的間隔為1 次，各組舔體次數(shù)以均值±標準差（±s）表示。結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，背部涂抹復方甘桑洗液藥液后的小鼠舔體次數(shù)顯著減少，給藥濃度對小鼠舔體次數(shù)影響較小，高劑量組小鼠舔體次數(shù)略低于低劑量組，復方甘桑洗液高、低劑量組的止癢作用均顯著優(yōu)于潔爾陰對照組（P＜0.01）。

表3 各組10 min內(nèi)小鼠舔體次數(shù)比較 （±s）

表3 各組10 min內(nèi)小鼠舔體次數(shù)比較 （±s）

注：與模型組比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與潔爾陰對照組比較，③P＜0.01

組 別模型組復方甘桑洗液高劑量組復方甘桑洗液低劑量組潔爾陰對照組n 10 10 10 10濃度（%）—100 50 100舔體次數(shù)（次）22.60±6.48 6.30±2.94②③8.00±3.20②③15.50±5.28①

3 討 論

復方甘桑洗液由甘蔗葉、桑白皮、柚葉、八角茴香葉、兩面針、救必應、薄荷油組成，其中甘蔗葉具有抗菌［12］、抗炎［13］、降血糖［14］、肝損傷保護［15］等作用，桑白皮具有抗炎鎮(zhèn)痛、降血糖、抗病毒等作用［16］，在方中與甘蔗葉共為君藥，提升甘蔗葉的抗炎效果。救必應為冬青科植物鐵冬青的樹皮，具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用［17］；兩面針為蕓香科植物兩面針的根和葉，具有抗菌、抗炎等作用［18］；兩味中藥均具有抗多種細菌及白色念珠菌的作用，在方中為臣藥。八角茴香葉具有揮發(fā)油成分，其水提物具有一定的抗菌作用［19-20］；柚葉中的柚皮苷具有較好的抑制多種細菌生長的作用［21-23］，廣西壯族民間常用于婦女產(chǎn)后康復；此兩味藥物具有一定的抗菌作用，且其揮發(fā)油氣味芳香，與薄荷油共同起佐助作用，提升抑菌抗炎能力；并通過促進透皮吸收，使洗液具有較好的抑菌止癢能力。

陰道炎是常見的婦科疾病之一，其病因主要由于多種細菌（如大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等）、白色念珠菌及滴蟲等病原體在陰道中過度增殖，使陰道內(nèi)環(huán)境失衡而引起炎癥，往往會伴隨著外陰瘙癢。西醫(yī)多用抗生素抑制病原體的增殖，中醫(yī)多采用內(nèi)服外治辨證治療［24-25］。目前，測定藥物對細菌的敏感性多采用抑菌圈法，其中包含了牛津杯法、K-B 法、打孔法，牛津杯法因其獲得的抑菌圈質(zhì)量高，重復性好及方法規(guī)范等優(yōu)點而優(yōu)于K-B 法及打孔法［26］。測定藥物對菌種的MIC 時多采用瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法、微量稀釋法3種，而復方甘桑洗液為棕褐色液體，使用瓊脂稀釋法可排除干擾，獲得比較準確的實驗結(jié)果，故而本研究使用牛津杯法檢測復方甘桑洗液對4 株標準菌株的藥物敏感性，以及使用瓊脂稀釋法測定MIC。結(jié)果顯示，復方甘桑洗液對4 種標準菌株均有一定的抑制作用，對大腸埃希菌及白色念珠菌效果較差，對金黃色葡萄球菌效果最好，與市售陽性藥（潔爾陰洗液）比較具有一定的優(yōu)勢。

瘙癢是一種能引起抓撓沖動的主觀感覺，是神經(jīng)反射導致的結(jié)果，由多種因素（蚊蟲叮咬、炎癥刺激等）導致。4-AP 是一種具有促進肥大細胞釋放瘙癢介質(zhì)組胺的化合物，被廣泛應用于建立瘙癢動物模型中［27］。本研究采用皮下注射4-AP 于小鼠頸后部的方法建立瘙癢模型，給藥后通過觀察各組小鼠舔體次數(shù)測定復方甘桑洗液的止癢作用，結(jié)果顯示復方甘桑洗液具有顯著的止癢作用，且效果優(yōu)于市售陽性藥。

綜上，本研究充分利用了農(nóng)作物廢棄物的藥用功能，以傳統(tǒng)抗菌中藥組方，起到了顯著的抗菌、止癢的作用，為將農(nóng)作物廢棄物開發(fā)成藥用產(chǎn)品并應用于臨床提供了科學依據(jù)，能為促進農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的發(fā)展提供支持。