麩炒白術(shù)配方顆粒HPLC指紋圖譜研究

姚 娜，黃燕明，汪 靜，李雪銀，陳桂生，王 斌，康志英，3

(1.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510663；2.寧夏隆德縣六盤山中藥資源開(kāi)發(fā)有限公司，寧夏 固原 756300；3.廣東香雪南藥發(fā)展有限公司，廣東 肇慶 526642)

麩炒白術(shù)為白術(shù)飲片經(jīng)蜜炙麩皮炮制加工制成。白術(shù)為菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖，冬季下部葉枯黃、上部葉變脆時(shí)采挖，除去泥沙，烘干或曬干，再除去須根，即得。白術(shù)具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功效，臨床上多用于脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲眩悸、水腫、自汗、胎動(dòng)不安的治療[1-2]。白術(shù)經(jīng)麩炒后，健脾消食作用得以增強(qiáng)[3]。目前，麩炒白術(shù)藥理活性的研究主要圍繞抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、利尿、調(diào)節(jié)腸胃功能以及抑制腫瘤細(xì)胞等方面展開(kāi)[4]。麩炒白術(shù)主要含有揮發(fā)油、白術(shù)多糖、內(nèi)酯類、氨基酸、微量元素和蒲公英萜醇乙酸酯等成分，其中揮發(fā)油、白術(shù)多糖和內(nèi)酯類是麩炒白術(shù)的主要有效成分[5-8]。雖然已有文獻(xiàn)[9]對(duì)麩炒白術(shù)配方顆粒的特征圖譜進(jìn)行研究并確定了8個(gè)特征峰，但是未對(duì)其特征峰進(jìn)行指認(rèn)。因此，本文采用HPLC法建立了麩炒白術(shù)指紋圖譜，確立了12個(gè)共有峰，并采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)對(duì)8個(gè)共有峰進(jìn)行指認(rèn)，從整體上評(píng)價(jià)其工藝和質(zhì)量，以提高麩炒白術(shù)配方顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)水平。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290型超高效液相色譜(UPLC)，連接6530型四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀(Q-TOF-MS)，配有兩個(gè)獨(dú)立二元泵、可控溫自動(dòng)進(jìn)樣器、可控溫柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器(DAD)和電噴霧離子源(ESI)；LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；MS204TS萬(wàn)分之一電子分析天平(瑞士Mettler toledo公司)；KQ500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

白術(shù)對(duì)照藥材(批號(hào)：120925-201611)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；咖啡酸(批號(hào)：110885-200102)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；異綠原酸A(批號(hào)：151028)、異綠原酸B(批號(hào)：150327)、異綠原酸C(批號(hào)：150724)均購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；乙腈(天津賽孚瑞公司，色譜級(jí))；甲酸(天津市光復(fù)精細(xì)化工廠，分析純)；甲醇(北京化工廠，分析純)；乙酸乙酯(北京化工廠，分析純)；水為娃哈哈純凈水。

1.3 樣品

共收集18批白術(shù)飲片，其中安徽亳州6批，浙江東陽(yáng)3批，浙江磐安2批，河北安國(guó)3批，湖南龍山2批，河南溫縣2批。樣品經(jīng)廣州市香雪制藥股份有限公司高級(jí)工程師康志英鑒定為真品。參照2015年版《中國(guó)藥典》麩炒白術(shù)炮制方法將18批白術(shù)飲片炮制成麩炒白術(shù)飲片，由本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求(征求意見(jiàn)稿)》，研究麩炒白術(shù)配方顆粒的制備工藝，并按照確定的制備工藝制成18批中試批量的麩炒白術(shù)配方顆粒。

2 方法與結(jié)果

2.1 麩炒白術(shù)配方顆粒指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Waters Symmetry?-C18色譜柱(柱長(zhǎng)為250 cm，柱內(nèi)徑為4.6 mm，粒徑為5 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.5%甲酸水溶液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為313 nm，洗脫條件見(jiàn)表1。

2.1.2 參照物溶液制備 取白術(shù)對(duì)照藥材約1.0 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加水25 mL，煎煮30 min，放冷，濾過(guò)，用乙酸乙酯萃取4次，每次25 mL，收集乙酸乙酯部分，蒸干，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

表1 梯度洗脫條件

2.1.3 供試品溶液制備 取本品約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加水25 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)使溶解，用乙酸乙酯萃取2次，每次25 mL，收集乙酸乙酯部分，蒸干，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.2.1 專屬性試驗(yàn) 取麩炒白術(shù)配方顆粒，按照“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液的方法制備，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果12個(gè)共有色譜峰均不受溶劑因素干擾，專屬性良好。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 取上述麩炒白術(shù)配方顆粒樣品，按色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.1版)》進(jìn)行評(píng)價(jià)，相似度均大于0.90，表明該儀器的精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批麩炒白術(shù)配方顆粒樣品，平行6份，按照“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液的方法制備，依法測(cè)定，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.1版)》進(jìn)行評(píng)價(jià)，相似度均大于0.90，表明該分析方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，按色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12、24、48 h進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.1版)》進(jìn)行評(píng)價(jià)，相似度均大于0.90，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 指紋圖譜的構(gòu)建

取18批麩炒白術(shù)配方顆粒，按供試品溶液制備方法和色譜條件測(cè)定，得到18批麩炒白術(shù)配方顆粒的色譜疊加圖(見(jiàn)圖1)。根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定及各批次樣品均能檢出的原則，選擇了12個(gè)特征峰作為共有峰。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.1版)》進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果相似度均大于0.90。

2.4 共有峰的指認(rèn)

通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)對(duì)麩炒白術(shù)配方顆粒指紋圖譜中的共有峰進(jìn)行指認(rèn)。

2.4.1 供試品溶液制備 同“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。

2.4.2 色譜條件 色譜分離采用Agilent Eclipse Plus C18UPLC色譜柱(100 mm×3.0 mm，1.8 μm)，配有在線過(guò)濾器。柱溫：40 ℃，流速：0.5 mL/min，流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水，B為乙腈。梯度洗脫程序：0～3 min (5% B)，3～5 min (5%～10% B)，5～10 min (10%～15% B)，10～13 min (15%～24% B)，13～17 min (24%～30% B)，17～20 min (30%～35% B)，20～23 min (35%～41% B)，23～27 min (41% B)，27～28 min (41%～100% B)，28～32 min (100% B)，后運(yùn)行時(shí)間10 min。檢測(cè)波長(zhǎng)：313 nm，每次進(jìn)樣：3 μL。

圖1 18批麩炒白術(shù)配方顆粒HPLC疊加

2.4.3 質(zhì)譜條件 分別在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行，干燥氣溫度325 ℃，干燥氣流速6 L/min，霧化氣壓力45 psi，毛細(xì)管電壓3 500 V(正模式)和3 000 V(負(fù)模式)，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流速12 L/min。一級(jí)質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍50～1 100m/z。二級(jí)質(zhì)譜選用Target-MS/MS模式，碰撞電壓10和30 eV。所得LC-MS數(shù)據(jù)由Agilent MassHunter軟件采集。

2.4.4 質(zhì)譜分析 精密吸取麩炒白術(shù)配方顆粒供試品溶液注入LC-MS儀，按上述條件進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)麩炒白術(shù)配方顆粒供試液的UPLC-UV色譜圖和UPLC-TOF-MS總離子流圖(正、負(fù)模式)，圖中標(biāo)識(shí)的1～16號(hào)色譜峰物質(zhì)，均得到了良好的分離和檢測(cè)(見(jiàn)圖2)。

通過(guò)高分辨TOF-MS的精確質(zhì)量數(shù)測(cè)定，對(duì)上圖中1-16號(hào)峰物質(zhì)進(jìn)行了鑒定，結(jié)合在正模式下生成[M+H]+、[M+Na]+、[M+NH4]+等加合離子，和負(fù)模式下生成 [M-H]-加合離子的情況，推斷出化合物的精確分子量和分子式，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 麩炒白術(shù)配方顆粒UPLC-Q-TOF-MS分析

續(xù)表2

通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果結(jié)合參考文獻(xiàn)比對(duì)分析，共推斷出13個(gè)色譜峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)。由于液質(zhì)聯(lián)用儀的液相部分為UPLC，其色譜圖與HPLC的色譜行為有些差異。通過(guò)對(duì)照品比對(duì)4個(gè)已知成分咖啡酸、異綠原酸A、B、C，分析結(jié)果與質(zhì)譜結(jié)果一致。12個(gè)HPLC共有峰中指認(rèn)了其中8個(gè)已知成分。質(zhì)譜分析結(jié)果與共有峰指認(rèn)結(jié)果對(duì)應(yīng)關(guān)系見(jiàn)表3。

2.4.4 對(duì)照?qǐng)D譜的建立 取18批麩炒白術(shù)配方顆粒，按供試品溶液制備方法和色譜條件測(cè)定，通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)和對(duì)照品比對(duì)，生成的對(duì)照指紋圖譜見(jiàn)圖3。

表3 質(zhì)譜分析結(jié)果與共有峰指認(rèn)結(jié)果對(duì)應(yīng)關(guān)系

峰1：對(duì)羥基苯甲酸；峰2：咖啡酸；峰5：東莨菪內(nèi)酯；峰6：異綠原酸B ；峰7：異綠原酸A ；峰8：異綠原酸C ；峰9：刺五加酮；峰10：洋薊素

3 討論

采用光電二極管陣列檢測(cè)器考察麩炒白術(shù)配方顆粒供試品溶液在不同波長(zhǎng)下色譜圖情況。供試品溶液在190～400 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行掃描，通過(guò)3D視圖和等吸收?qǐng)D譜進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在250～330 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，基線平穩(wěn)，信息量較大。選取其中常見(jiàn)波長(zhǎng)進(jìn)行分析，313 nm下各色譜峰響應(yīng)值適中，分離度良好，故最終確定以313 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

供試品提取溶媒考察對(duì)比了水提取與乙酸乙酯萃取的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)乙酸乙酯萃取富集后，色譜圖中信息量較大，故采用乙酸乙酯萃取的方法制備樣品。

考慮到指紋圖譜多成分、整體質(zhì)量控制，選擇白術(shù)對(duì)照藥材作為隨行對(duì)照，為與顆粒提取工藝保持基本一致，將白術(shù)對(duì)照藥材進(jìn)行水煎煮。結(jié)果對(duì)照藥材與顆粒色譜峰基本一致，故選擇白術(shù)對(duì)照藥材作為麩炒白術(shù)配方顆粒指紋圖譜的參照物。

經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)，在25.585 min的色譜峰為咖啡酸的色譜峰，在44.497 min的色譜峰為異綠原酸B的色譜峰，在45.128 min的色譜峰為異綠原酸A的色譜峰，在46.935 min的色譜峰為異綠原酸C色譜峰，其中峰9響應(yīng)穩(wěn)定，達(dá)到基線分離，故選擇峰9作為對(duì)照品參照峰，并將其標(biāo)記為峰S。

本文采用HPLC建立了麩炒白術(shù)配方顆粒指紋圖譜，對(duì)其相似度進(jìn)行評(píng)估，采用UPLC-Q-TOF-MS分析技術(shù)指認(rèn)了8個(gè)共有峰，分別為對(duì)羥基苯甲酸、咖啡酸、東莨菪內(nèi)酯、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、刺五加酮、洋薊素，可為麩炒白術(shù)配方顆粒的大批量生產(chǎn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立及全過(guò)程質(zhì)量監(jiān)控提供參考。