姜黃素對急性脊髓損傷大鼠炎癥因子的干預(yù)作用

陳巖巖，周淑娟，夏玉朝，薛曉拉

(鄭州市第六人民醫(yī)院，河南 鄭州 450015)

姜黃素是從姜科、天南星科植物的根莖中提取的化學(xué)成分，是一種含有酚基和醌基的天然藥物，可應(yīng)用于心血管疾病、慢性肝病、腫瘤及自身免疫性疾病的治療。中醫(yī)認(rèn)為姜黃素有行氣活血、通經(jīng)止痛的功效，對跌打腫痛、閉經(jīng)等癥的治療有良好效果[1]。經(jīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有良好的抗炎、抑制氧化應(yīng)激、抗腫瘤等藥理作用[2]，而炎癥是機(jī)體最常見的一種病理變化，可由感染、機(jī)械損傷等誘發(fā)炎癥因子的生成或釋放導(dǎo)致，使機(jī)體功能障礙或造成器質(zhì)性損傷[3]。本實(shí)驗(yàn)采用改良的Allen’s打擊法建立大鼠急性脊髓損傷模型，觀察姜黃素對模型大鼠相關(guān)炎癥因子水平的影響，探討姜黃素對大鼠急性脊髓損傷抗炎作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

姜黃素由Sigma公司提供；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA檢測試劑盒、白介素-1β(IL-1β)ELISA檢測試劑盒、白介素-6(IL-6)ELISA檢測試劑盒、白介素-10(IL-10)ELISA檢測試劑盒由北京誠林生物科技有限公司提供；髓過氧化物試劑盒(MPO)由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，雌性，SPF級，240～260 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號SCXK(豫)2015-0001。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

SAF-680T酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技公司)；Allen’s脊髓損傷打擊器；UV1000紫外/可見分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)；恒溫水浴鍋(上海比朗儀器制造有限公司生產(chǎn))；移液器若干。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法[4]

1.4.1 動(dòng)物分組及給藥 將姜黃素溶于0.1%DMSO的PBS溶液中，取SD大鼠60只，隨機(jī)分為4個(gè)組，即假手術(shù)組、模型組、姜黃素低劑量組(40 mg/kg)、姜黃素高劑量組(100 mg/kg)，于脊髓損傷前1天進(jìn)行腹腔注射給藥，每日1次，持續(xù)7 d，假手術(shù)組和模型組給予等體積0.1% DMSO的PBS溶液。

1.4.2 動(dòng)物模型的制備 本實(shí)驗(yàn)采用改良的Allen’s打擊法建立大鼠急性脊髓損傷模型。各組大鼠用10%水合氯醛(0.35 mL /100g)腹腔注射麻醉，俯臥于鼠板上，手術(shù)將T9-T10椎板摘除并暴露脊髓，用Allen’s打擊器，質(zhì)量為10 g的擊打棍于5 cm處自由落體造脊髓急性損傷。造模后出現(xiàn)脊髓組織水腫、出血，硬脊膜呈紫紅色，雙下肢出現(xiàn)遲緩性痙攣、回縮樣撲動(dòng)，尾巴痙攣性擺動(dòng)的視為造模成功。

1.4.3 指標(biāo)檢測 (1)后肢運(yùn)動(dòng)功能評分：術(shù)后第7天，采用脊髓損傷評分標(biāo)準(zhǔn)(BBB)評分法對大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評價(jià)，觀察其后肢的關(guān)節(jié)活動(dòng)、步態(tài)等運(yùn)動(dòng)功能。評分分為3個(gè)部分：第1部分(0～7分)，評價(jià)動(dòng)物后肢各關(guān)節(jié)活動(dòng)情況；第2部分(8～13分)，評價(jià)動(dòng)物后肢協(xié)調(diào)功能及步態(tài)；第3部分(14～21分)，評價(jià)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)時(shí)爪子的精細(xì)動(dòng)作，3個(gè)部分滿分共21分。評分時(shí)采用雙盲法，每次評分別由培訓(xùn)后兩人單獨(dú)完成，數(shù)據(jù)取其平均值。(2)相關(guān)生化指標(biāo)檢測：后肢運(yùn)動(dòng)功能評分后，水合氯醛麻醉處死大鼠，取損傷處脊髓組織并精密稱重，加入9倍的冰生理鹽水勻漿制成10%的脊髓勻漿液，3 000 r/min離心10 min，取上清液，檢測IL-1β、IL-6、IL-10、MPO相關(guān)指標(biāo)，具體操作步驟詳見試劑盒內(nèi)說明書。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 19.0 for windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料采用(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，等級資料采用Radit檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對急性脊髓損傷大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能評分的影響

由表1可知，與假手術(shù)組相比，模型組后肢運(yùn)動(dòng)功能評分顯著降低(P<0.01)，提示急性脊髓損傷造模成功。與模型組相比較，姜黃素各組可有效改善急性脊髓損傷大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能，有良好的改善趨勢，其中，姜黃素大劑量組可顯著改善大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能(P<0.01)，姜黃素小劑量組可明顯改善大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能(P<0.05)。

表1 姜黃素對急性脊髓損傷大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能評分的影響

2.2 姜黃素對急性脊髓損傷大鼠脊髓勻漿液TNF-α、IL-1β水平的影響

由表2可見，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠脊髓勻漿液中TNF-α、IL-1β水平顯著升高(P<0.01)，與急性脊髓損傷模型指標(biāo)趨勢相一致，提示模型造模成功。與模型組相比，姜黃素各劑量組可明顯降低大鼠脊髓勻漿液中TNF-α、IL-1β水平，其中姜黃素大劑量組可顯著降低脊髓勻漿中TNF-α水平(P<0.01)，明顯降低脊髓勻漿IL-1β水平(P<0.05)；姜黃素小劑量組可明顯降低脊髓勻漿中TNF-α和IL-1β水平(P<0.05)。

表2 姜黃素對急性脊髓損傷大鼠脊髓勻漿液TNF-α、IL-1β水平的影響

2.3 姜黃素對急性脊髓損傷大鼠脊髓勻漿液IL-6、IL-10水平的影響

由表3可知，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠脊髓勻漿液中IL-6、IL-10水平顯著升高(P<0.01)，與急性脊髓損傷模型指標(biāo)趨勢相一致，提示造模成功。與模型組相比，姜黃素各劑量組可有效改善脊髓勻漿液中IL-6、IL-10水平，其中姜黃素大劑量組可明顯降低勻漿液中IL-6水平(P<0.05)，可顯著降低勻漿液中IL-10水平(P<0.01)；姜黃素小劑量組可明顯降低脊髓勻漿液中IL-6、IL-10水平(P<0.05)。

表3 姜黃素對急性脊髓損傷大鼠脊髓勻漿液IL-6、IL-10水平的影響

2.4 姜黃素對急性脊髓損傷大鼠脊髓勻漿液MPO水平的影響

由表4可知，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠脊髓勻漿液中MPO水平顯著升高(P<0.01)，與急性脊髓損傷模型指標(biāo)趨勢相一致，提示急性脊髓損傷造模成功。與模型組相比，姜黃素各劑量組可有效改善勻漿液中MPO水平，其中姜黃素大劑量組可顯著降低脊髓勻漿液中MPO水平(P<0.01)，姜黃素小劑量組可明顯降低脊髓勻漿液中MPO水平(P<0.05)。

表4 姜黃素對急性脊髓損傷大鼠脊髓勻漿液MPO水平的影響

3 結(jié)論

脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)作為一種嚴(yán)重的外科疾病，已對人們生活健康造成嚴(yán)重威脅，一旦發(fā)生，可能會(huì)對患者造成永久性損害，對家庭、社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)[5]。SCI的過程中，會(huì)伴隨相關(guān)炎癥因子的生成和釋放，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，其中相關(guān)炎性細(xì)胞及黏附分子表達(dá)會(huì)升高，在脊髓組織中浸潤、聚集，進(jìn)一步加重缺血損傷區(qū)的損傷。有研究表明，損傷局部過量的炎性因子是引起脊髓漸進(jìn)性潰變壞死的重要因素，且所引發(fā)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)會(huì)破壞神經(jīng)元，影響損傷脊髓功能恢復(fù)，進(jìn)一步加重?fù)p傷[6]。

TNF-α是機(jī)體重要的炎癥介質(zhì)和致病因子，是炎癥過程中重要的啟動(dòng)因子，誘導(dǎo)如IL-1β、IL-6等多種炎癥介質(zhì)的釋放，還可誘導(dǎo)EAA、C反應(yīng)蛋白等出現(xiàn)神經(jīng)毒性作用[7]。IL-1β和IL-6是具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，脊髓損傷早期，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌產(chǎn)生的IL-1β、IL-6能調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞生長和功能，參與中樞神經(jīng)內(nèi)的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，可能是導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)域炎癥反應(yīng)放大，造成損傷后繼發(fā)免疫損傷的重要因素[8]。IL-10通過減少抑制促炎因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)，是目前公認(rèn)的炎癥和免疫抑制因子。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，MPO也是自由基生成的另一來源[9]，因此也可以對炎性反應(yīng)的損傷進(jìn)行評估。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素有良好的抗炎作用，其抗炎活性可比擬如吲哚美辛和保泰松等甾體藥物和非甾體類的藥物，其抗炎作用主要通過抑制環(huán)氧酶(COX)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)及轉(zhuǎn)錄因子如核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)等發(fā)揮效應(yīng)[10]。實(shí)驗(yàn)表明姜黃素可明顯改善急性脊髓損傷大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能，功能評分不同程度升高，可有效降低急性脊髓損傷大鼠脊髓勻漿液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10相關(guān)炎癥因子水平，還不同程度降低勻漿液中MPO水平，提示姜黃素可通過降低急性脊髓損傷大鼠脊髓組織中炎性介質(zhì)對急性脊髓損傷發(fā)揮保護(hù)作用。