HPLC-DAD同時測定合黃滋陰合劑中5種有效成分含量

沈 潔，萬 丹，徐 沖

(重慶市中醫(yī)院 藥劑科，重慶 400021)

合黃滋陰方由百合、生地黃、黃連、黃芩、白芍、阿膠、甘草、大棗、浮小麥加工而成，用于治療陰虛發(fā)熱、津傷便秘、心神不寧、神志恍惚、虛煩心悸、失眠多夢等病癥。方中百合、生地黃為君藥，為張仲景的百合地黃湯，百合滋陰清熱，白色入肺經，可養(yǎng)肺陰；生地黃清熱滋陰，生津止渴，黑色入腎，可滋腎陰[1]；阿膠滋養(yǎng)腎陰，使腎水上濟于心，交通心腎[2]；黃連、黃芩清熱瀉火而固護腎陰[3-4]。白芍斂陰止汗，平抑肝陽，白芍味酸，甘草味甘，白芍、甘草酸甘化陰[5-7]；大棗、浮小麥養(yǎng)心陰，除煩熱[8]。全方共奏養(yǎng)陰瀉火、益腎寧心之功效。

合黃滋陰方為我院婦科擬開發(fā)的院內制劑，尚無質量標準等相關研究。通過對百合、地黃等藥材的文獻調研[9-15]及相關實驗，本研究制定了HPLC同時測定其有效成分芍藥苷、王百合苷、毛蕊花糖苷、黃芩苷、黃芩素含量的方法，現(xiàn)報道如下。

1 材料與試劑

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜(DAD二極管陣列檢測器)；Waters Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；QUINTIX65-1CN型電子天平(十萬分之一，德國 Sartorius集團)；JA3003J型電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；KQ3200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TGL-18C-C型臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；AXLM1820-2型超純水機(重慶阿修羅科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試藥

王百合苷 (成都德斯特生物技術有限公司，批號：DST190601-071，純度：98.0%)；芍藥苷(上海安譜實驗科技股份有限公司，批號：G3160010，純度：98.0%)；毛蕊花糖苷(批號：中國食品藥品檢定研究院，111530-201713，純度：92.5%)；黃芩苷(中國食品藥品檢定研究院，批號：110715-201821，純度：95.4%)；黃芩素(中國食品藥品檢定研究院，批號：111595-201607，純度：98.5%)；乙腈(色譜純，上海霍尼韋爾貿易有限公司)；磷酸(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；其余試劑為分析純，水為超純水；合黃滋陰合劑(批次20200113、20200115、20200121、20200122)，規(guī)格：200 mL/瓶；陰性樣品自制。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫：0～20 min，16% A；20～30 min，16%～22% A；30～55 min，22～50% A；55～60 min，50% A，后運行2 min；檢測波長：0～20 min，230 nm；20～26 min，334 nm；26～35 min，310 nm；35～60 min，280 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

對照品溶液制備：分別精密稱取芍藥苷、毛蕊花糖苷、王百合苷、黃芩苷、黃芩素適量，加70%甲醇配制成混合對照品溶液，其中芍藥苷、毛蕊花糖苷、王百合苷、黃芩苷、黃芩素的質量濃度分別為360.10、125.60、72.00、91.20、71.60 μg/mL。

供試品溶液制備：取合黃滋陰合劑(20200113) 5 mL，加入70%甲醇定容，超聲(功率：500 W，頻率：40 kHz) 30 min，冷卻后用70%甲醇補足損失的質量，搖勻，離心(5 000 r，5 min)，取上清液，濾過，即得。

陰性溶液制備：根據合黃滋陰處方組成制備陰性樣品，按照供試品溶液的配制方法制備缺百合、生地黃、白芍、黃芩的陰性供試品溶液，備用。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件測定。在該色譜條件下，各待測成分色譜峰均可以達到基線分離，理論塔板數均>5 000。供試品與對照品相應位置上，保留時間一致，陰性樣品無干擾。色譜見圖1。

1：芍藥苷；2：毛蕊花糖苷；3：王百合苷；4：黃芩苷；5：黃芩素

2.3.2 線性關系考察 分別精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液1、2、3、5、8、10 mL，置于10 mL容量瓶中，用70%甲醇定容，搖勻，按照“2.1”項下色譜條件進行測定，以峰面積為縱坐標(Y)，各對照品濃度為橫坐標(X)，進行線性回歸，得到線性關系，見表1。

表1 合黃滋陰合劑中各成分的線性關系考察

2.3.3 檢測限和定量限考察 取“2.2”項下對照品溶液，逐級稀釋，按照“2.1”項下色譜條件，分別進樣6次，記錄色譜圖。以信噪比(S/N)=3∶1時計算檢測限，以S/N=10∶1時計算定量限。結果芍藥苷、毛蕊花糖苷、王百合苷、黃芩苷、黃芩素的檢測限分別為0.02 μg /mL、0.06 μg/mL、0.07 μg/mL、0.05 μg/mL、0.04 μg/mL，定量限分別為0.07 μg/mL、0.20 μg/mL、0.22 μg/mL、0.16 μg/mL、0.12 μg/mL。

2.3.4 精密度試驗 精密吸取同一份混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，計算得芍藥苷、毛蕊花糖苷、王百合苷、黃芩苷、黃芩素的峰面積RSD(n=6)分別為1.06%、0.63%、0.65%、0.47%、0.44%，結果表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復性試驗 取同一批次(20200113)的合黃滋陰合劑，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，平行6份，計算得芍藥苷、毛蕊花糖苷、王百合苷、黃芩苷、黃芩素RSD(n=6)分別為3.20%、2.37%、1.61%、0.72%、1.89%，結果表明該方法重復性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 取該批次(20200113)合黃滋陰合劑制成樣品溶液，于室溫下放置0、2、4、6、12、24 h后進樣，計算得芍藥苷、毛蕊花糖苷、王百合苷、黃芩苷、黃芩素的峰面積RSD(n=6)分別為2.91%、0.72%、0.55%、3.68%、2.25%，結果表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.7 加樣回收試驗 取適量的合黃滋陰合劑 (20200113)樣品約2.5 mL，共6份。分別加入含芍藥苷360.10 μg/mL、毛蕊花糖苷12.56 μg/mL、王百合苷72.00 μg/mL、黃芩苷91.20 μg/mL、黃芩素35.80 μg/mL對照品混合溶液50 mL，按照“2.2”項下的方法制備供試品溶液，測定峰面積，計算得芍藥苷、毛蕊花糖苷、王百合苷、黃芩苷、黃芩素平均回收率分別為98.30%、97.21%、96.11%、98.53%、95.34%，RSD分別為1.73%、1.83%、1.94%、1.50%、2.46%。

表2 合黃滋陰合劑中各成分的加樣回收率試驗

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，按照上述色譜條件，進行芍藥苷、毛蕊花糖苷、王百合苷、黃芩苷、黃芩素的含量測定(n=3)，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果 (n=3)

3 討論

3.1 有效成分的選擇

本研究中百合、地黃為君藥，通過文獻[16]調研并結合實驗結果表明王百合苷為所用百合(百合科)主要有效成分。由于合黃滋陰合劑采用水煎煮，地黃中梓醇穩(wěn)定性差[12，14-15]，結合《中國藥典》(2015年版)規(guī)定，選擇地黃毛蕊花糖苷為檢測指標之一；白芍、黃芩為臣藥，結合《中國藥典》(2015年版)規(guī)定，分別選擇芍藥苷、黃芩苷為檢測指標，文獻表明黃芩中亦含有大量黃芩素[17-19]，故選擇黃芩素為指標性成分之一。方劑中阿膠雖為臣藥，但由于阿膠為烊化后加入濃縮煎液中再定容，且其有效成分在本實驗條件中不易被測得，故不考慮將其納入考察，黃連、大棗、浮小麥、甘草等飲片為佐使藥，從方劑組成及飲片本身的有效成分考慮，均不適宜納入考察。綜上所述，本研究將芍藥苷、王百合苷、毛蕊花糖苷、黃芩苷、黃芩素5種有效成分作為合黃滋陰合劑含量測定的考察指標。

3.2 流動相的選擇

本研究對乙腈-水、乙腈-0.1%冰醋酸、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液四種流動相進行梯度洗脫考察。研究發(fā)現(xiàn)，乙腈-0.1%、乙腈-0.2%磷酸溶液在梯度洗脫下各組分分離效果較好，從儀器維護的角度考慮，本實驗選擇乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相。

3.3 檢測波長的選擇

結合文獻[16]，并通過DAD全波長掃描得知，芍藥苷、王百合苷、毛蕊花糖苷、黃芩苷、黃芩素的最大吸收波長分別為230 nm、310 nm、334 nm、280 nm、280 nm，故本研究設定檢測波長分別為230 nm、310 nm、334 nm、280 nm、280 nm，可以滿足各指標成分含量測定的要求，保障實驗結果的準確性。

3.4 樣品提取工藝的選擇

本研究對提取溶劑、提取方式、提取時間分別進行優(yōu)化考察。提取溶劑：在水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇，甲醇、70%乙醇溶液中，70%甲醇提取各組分含量最高，且各組分分離情況最為理想。提取方式：對回流提取與超聲提取效果分別進行考察，研究發(fā)現(xiàn)回流提取的各組分含量稍高于超聲提取，但差異并不明顯，從實驗的便捷性、安全性及環(huán)保性角度綜合考慮，采用超聲提取方式進行提取。提取時間：本研究分別對超聲提取時間20、30、40 min進行考察，結果表明30、40 min時各組分含量差異不明顯，而20 min超聲所得各組分含量明顯低于30 min和40 min所測結果，因此，本實驗制備供試品提取時間為30 min。綜上，本研究采用70%甲醇超聲提取30 min，制備供試品溶液。

4 結論

本研究采用HPLC-DAD同時測定合黃滋陰合劑中芍藥苷、王百合苷、毛蕊花糖苷、黃芩苷、黃芩素5種成分的含量，專屬性強，結果準確，使得該合劑質量控制標準更嚴謹完善，使其生產實踐中的多指標質量控制和評價成為可能。