circRNA在膠質(zhì)瘤中的研究進(jìn)展

吳文松 劉超 孫程圓 曾昭穆 溫稀超 鄭克彬

河北大學(xué)附屬醫(yī)院1神經(jīng)外科，2中心實(shí)驗(yàn)室（河北保定071000）

膠質(zhì)瘤是一種原發(fā)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤的48%［1］。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的惡性程度最高，患者生存期僅為15個(gè)月左右，5年生存率不足5%。將膠質(zhì)瘤完全切除并進(jìn)行放療或化療能夠在一定程度上延長(zhǎng)患者生存時(shí)間，但其具有生物學(xué)行為惡性、術(shù)后易復(fù)發(fā)、對(duì)放化療抵抗及生存期短等特點(diǎn)，因此深入探索膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及尋找新型治療方法具有重要意義。

circRNA 是一種非編碼RNAs 亞型，其是通過前體mRNA 下游的3′端與上游的5′端反向拼接位點(diǎn)共價(jià)連接生成的環(huán)狀RNA 分子，由于其不存在多聚腺苷酸尾，導(dǎo)致早期無(wú)法對(duì)circRNA 的種類和數(shù)量進(jìn)行測(cè)量［2］，近年來高通量測(cè)序、微陣列芯片以及生物信息學(xué)技術(shù)使circRNA 再次進(jìn)入人們的視線［3-4］。circRNA 在各種疾病中均發(fā)揮著重要功能，可作為基因治療的新靶點(diǎn)，此研究對(duì)circRNA在膠質(zhì)瘤中所發(fā)揮的的生物學(xué)作用進(jìn)行歸納總結(jié)，為完善膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制及尋找有效治療方案提供了理論支持。

1 circRNA 及作用機(jī)制

circRNA 是由RNA 聚合酶Ⅱ合成的［5］，并由剪接體通過反向剪接（back?splicing）的方式對(duì)前體mRNA 的外顯子進(jìn)行加工［6］。主要分為ecircRNA、ciRNA、ElciRNA。當(dāng)其全部由外顯子組成時(shí)稱為ecircRNA，僅由內(nèi)含子組成時(shí)稱為ciRNA，當(dāng)外顯子與內(nèi)含子共同存在時(shí)則稱為ElciRNA［7］。其具有多種多樣的生物學(xué)功能。如調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、海綿吸附miRNA、結(jié)合功能蛋白質(zhì)、作為多元復(fù)合物支架以及翻譯蛋白質(zhì)等功能。

circRNA能夠?qū)蜣D(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控，如circEIF3J和circPAIP2 能夠作用于其同源基因的啟動(dòng)子區(qū)域來提高轉(zhuǎn)錄EIF3J和PAIP2的表達(dá)［8］。circ?79530與轉(zhuǎn)錄因子TWIST 結(jié)合，進(jìn)而正反饋促使親本基因生成circ?79530，進(jìn)而誘發(fā)先兆子癇［9］。當(dāng)此類circRNA 的表達(dá)水平異常時(shí)可能導(dǎo)致相應(yīng)基因表達(dá)失調(diào)，從而誘發(fā)某些疾病的產(chǎn)生。

circRNA 能夠海綿吸附miRNA，其是一類微小RNA 分子，其核苷酸序列與某些mRNA 進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，從而抑制mRNA 的翻譯功能，發(fā)揮著生物控制器的作用。而circRNA 存在與miRNA 互補(bǔ)的堿基序列，兩者之間可以進(jìn)行相互結(jié)合以達(dá)到對(duì)miRNA 的海綿吸附。如cirs?7 能夠吸附miR?7，而miR?7 是多種癌癥通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)下調(diào)引起miR?7 所調(diào)節(jié)的癌癥信號(hào)通路的異常，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生成［10］。此外，胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞缺氧誘發(fā)circ?RBM39 上調(diào)，通過海綿吸附miR?5088?5p促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的自噬［11］?？梢姡?dāng)circRNA 水平異常而失去對(duì)miRNA 的調(diào)控會(huì)影響下游通路或基因表達(dá)異常，最終導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生發(fā)展。

circRNA 亦能與具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)結(jié)合以影響細(xì)胞的生物學(xué)活性。RNA 結(jié)合蛋白能通過與RNA 特異性結(jié)合來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯等功能［12］。cia?cGAS 通過與cGAS 蛋白結(jié)合抑制cGAS 的基因的表達(dá)，進(jìn)一步抑制I 型干擾素生成，最終使骨髓中的造血干細(xì)胞保持休眠狀態(tài)［13］。此外，circE2F2能夠與HuR 蛋白質(zhì)分子進(jìn)行相互結(jié)合后使E2F2 mRNA 變得更加穩(wěn)定，從而影響了卵巢癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移以及新陳代謝［14］。

circRNA 可以作為分子支架募集多種生物分子形成多元復(fù)合物發(fā)揮作用。如circNDUFB2 能夠作為分子支架吸引TRIM25 泛素連接酶并提高其活化的效率，使IGF2BPs 癌相關(guān)蛋白水平升高，進(jìn)而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的侵襲、遷移能力大大提升［15］。當(dāng)具有分子支架功能的circRNA 含量發(fā)生改變時(shí)能對(duì)細(xì)胞的癌變及生物學(xué)特性產(chǎn)生影響。

部分circRNA 具有編碼蛋白質(zhì)功能。如circ?EGFR 能夠募集核糖體編碼rtEGFR 蛋白以維持EGFR 在細(xì)胞膜的位置，進(jìn)而持續(xù)活化EGFR 信號(hào)通路促使細(xì)胞發(fā)生癌變［16］，circ?HER2 能夠翻譯HER?103 蛋白提高三陰乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力［17］，circβ?catenin 能編碼β?catenin 蛋白亞型活化Wnt/β?catenin 信號(hào)通路導(dǎo)致肝癌的產(chǎn)生并提高肝癌細(xì)胞的增殖及遷移能力［18］。由此可以推測(cè)circRNA 的翻譯功能并不是主要功能，但細(xì)胞內(nèi)某些編碼癌相關(guān)蛋白的circRNA 異常時(shí)可能誘發(fā)癌癥的產(chǎn)生。

2 circRNA 在膠質(zhì)瘤中的生物學(xué)作用

circRNA 在多種疾病中均有重要影響，而腦組織中circRNA 的種類和含量最高，多種多樣的生物學(xué)功能使circRNA 在膠質(zhì)瘤中扮演著重要角色，某些circRNA 的異常表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成及放化療抵抗方面均有影響，因而circRNA 有可能成為基因治療的靶點(diǎn)。

2.1 circRNA 參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展circRNA可作為miRNA 海綿影響膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行調(diào)節(jié)。如膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)的circ?MAPK4 海綿吸附miR?125a?3p 使其含量下降，進(jìn)一步下調(diào)p38/MAPK 通路的磷酸化水平以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，相對(duì)促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生及進(jìn)展［19］。此外，高表達(dá)的circHECTD1 能夠吸附miR?296?3p 使其表達(dá)水平下降使SLC10A7 基因表達(dá)升高，促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展［20］。circRNA 還能通過與功能蛋白結(jié)合發(fā)揮作用。如CDR1as 與p53 蛋白結(jié)合使E3 泛素連接酶MDM2 介導(dǎo)的p53 蛋白泛素化水平升高來下調(diào)p53 蛋白的生物學(xué)活性，而p53蛋白能夠抑制腫瘤生成，最終促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展［21］。膠質(zhì)瘤中存在大量的miRNA 海綿吸附機(jī)制及蛋白質(zhì)結(jié)合機(jī)制，并且一種circRNA 可以吸附多種miRNA 和功能蛋白質(zhì)來影響相關(guān)分子通路的活化水平或致癌基因的表達(dá)異常，因此將具有重要致癌功能的circRNA 作為靶點(diǎn)是可選擇的基因治療方法。

膠質(zhì)瘤細(xì)胞中存在有編碼功能的circRNA。如circ?SHPRH 能夠翻譯SHPRH?146aa 蛋白，其能抑制親本基因表達(dá)的SHPRH 抑癌蛋白降解，circ?SHPRH 的水平下降使得SHPRH?146aa 生成減少，對(duì)SHPRH 蛋白的保護(hù)作用下降，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展［22］。不難看出，編碼癌相關(guān)蛋白的circRNA對(duì)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展起到一定作用，但目前在膠質(zhì)瘤中對(duì)編碼circRNA 的研究稀少，其編碼蛋白質(zhì)的功能仍需進(jìn)一步研究。

2.2 circRNA 參與膠質(zhì)瘤的侵襲轉(zhuǎn)移強(qiáng)大的侵襲轉(zhuǎn)移能力使膠質(zhì)瘤細(xì)胞擴(kuò)散到其他部位，甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，研究表明circRNA 對(duì)膠質(zhì)瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力有不菲的影響。BARBAGALLO 等［23］發(fā)現(xiàn)circ?SMARCA5 能夠與SRSF1 蛋白結(jié)合，當(dāng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)circSMARCA5 表達(dá)水平下降導(dǎo)致促癌蛋白SRF1的表達(dá)水平升高，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。由此可見，細(xì)胞中某些circRNA 能與miRNA 及蛋白質(zhì)結(jié)合提升膠質(zhì)瘤侵襲、轉(zhuǎn)移能力。通過某種方法使膠質(zhì)瘤細(xì)胞中circRNA 異常表達(dá)恢復(fù)正常來抑制侵襲轉(zhuǎn)移能力可成為一種有潛力的治療方案。

2.3 circRNA 參與膠質(zhì)瘤的血管生成膠質(zhì)瘤組織內(nèi)包含大量滋養(yǎng)血管，豐富血供為膠質(zhì)瘤提供有力的營(yíng)養(yǎng)支持以促進(jìn)增殖、遷移、侵襲能力。circRNA 能夠參與腫瘤組織的血管生成，如膠質(zhì)瘤組織中過表達(dá)的cARF1 能夠通過miRNA 海綿功能降低miR?342?3p 的表達(dá)水平來上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子ISL2的表達(dá)，而ISL2 升高能活化VEGFA 介導(dǎo)的ERK 信號(hào)通路促使腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，使膠質(zhì)瘤組織中血供豐富，從而促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展［24］。此外，過表達(dá)的circ?ATXN1 使miR?526?3p 水平下調(diào)并活化MMP2/VEGFA 通路促使膠質(zhì)瘤組織血管生成，最終促使膠質(zhì)瘤的病情進(jìn)展惡化［25］。將生成活躍的血管作為靶點(diǎn)可作為一種新穎的治療方案，而circRNA 對(duì)血管生成過程具有生物學(xué)意義，將促使膠質(zhì)瘤血管生成的circRNA 作為靶點(diǎn)進(jìn)行治療可以使瘤體的血供減少，最終延緩膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)，由此可見，circRNA 可作為與血管生成的分子靶點(diǎn)進(jìn)行探索。

2.4 circRNA參與膠質(zhì)瘤放對(duì)化療的抵抗circRNA在放化療方面也具有影響力。circNFIX 海綿吸附miR?132使其表達(dá)水平顯著降低，而ABCG2為miR?132 調(diào)節(jié)的下游分子，其與膠質(zhì)瘤的化療耐藥有關(guān)，因此高表達(dá)的circNFIX能夠間接上調(diào)ABCG2表達(dá)水平，促使膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生替莫唑胺抵抗［26］。circRNA 與膠質(zhì)瘤的放療抵抗也存在關(guān)聯(lián)。如放療抵抗膠質(zhì)瘤細(xì)胞與敏感膠質(zhì)瘤細(xì)胞相比，circ?VCAN表達(dá)水平明顯上調(diào)，其能夠負(fù)向調(diào)節(jié)miR?1183促使膠質(zhì)瘤對(duì)放療產(chǎn)生抵抗性，并且circ?VCAN 的表達(dá)過高能使接受過放療的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力顯著提升［27］。放化療為膠質(zhì)瘤術(shù)后的主要治療，放化療抵抗導(dǎo)致了膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)及患者死亡，circRNA 與膠質(zhì)瘤對(duì)放化療的抵抗性相互關(guān)聯(lián)，因此其可以作為提高放化療敏感度的靶點(diǎn)進(jìn)行基因治療，但目前對(duì)該方面有待進(jìn)一步研究。

3 circRNA 在膠質(zhì)瘤中的應(yīng)用

circRNA 在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移以及方化療抵抗方面均扮演著重要的角色。不難發(fā)現(xiàn)，circRNA 在膠質(zhì)瘤中的臨床作用十分廣泛，其在膠質(zhì)瘤的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估等方面均具有重要影響。

3.1 circRNA 參與膠質(zhì)瘤的診斷circRNA 不僅存在于細(xì)胞內(nèi)，還可分布于血液中，疾病狀態(tài)時(shí)會(huì)導(dǎo)致血液中某些circRNA 表達(dá)水平異常，可能與膠質(zhì)瘤的生成具有相關(guān)性。膠質(zhì)瘤患者血漿中circFOXO3、circ?0029426 以及circ?SHPRH 與正常人相比其表達(dá)水平存在顯著差異，其中circFOXO3的差異性最為顯著，由此可以看出circRNA 分子對(duì)于膠質(zhì)瘤的診斷是非常由幫助的。室溫下這3 種circRNAs 放置24 h后表達(dá)水平也不發(fā)生劇烈改變，將血漿凍存在-80 ℃并反復(fù)解凍5 個(gè)周期也能保持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)［28］。circRNA的穩(wěn)定性與其環(huán)狀結(jié)構(gòu)以及核酸外切酶抵抗密不可分，因此血漿中的某些特異性circRNA 可以作為膠質(zhì)瘤的診斷標(biāo)志分子，膠質(zhì)瘤患者出現(xiàn)臨床癥狀后，顱內(nèi)侵犯已十分廣泛，所以血漿中circRNA 診斷標(biāo)志分子對(duì)膠質(zhì)瘤的早期診斷具有重要意義。

3.2 circRNA 參與膠質(zhì)瘤的治療目前對(duì)于膠質(zhì)瘤的治療主要為手術(shù)聯(lián)合放、化療。通過手術(shù)切除病灶，術(shù)后對(duì)患者行放化療能夠在某種程度上消除部分殘留的癌細(xì)胞，但在接受多次對(duì)放化療后，癌細(xì)胞產(chǎn)生抵抗性并快速增殖，最終膠質(zhì)瘤患者復(fù)發(fā)死亡。研究表明circRNA 在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成以及放化療抵抗作用中均產(chǎn)生巨大的影響，將circRNA 作為基因治療的靶點(diǎn)能夠有效的抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的各種惡性生物學(xué)行為，最終達(dá)到治療的目的。LIU 等［29］將特異性靶向circ_0001836 的小型干擾RNA 轉(zhuǎn)染進(jìn)入膠質(zhì)瘤細(xì)胞后使其表達(dá)水平降低，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其水平下降促使NLRP1?GSDMD 信號(hào)通路活化，使NLPR1 表達(dá)上調(diào)并產(chǎn)生活化型caspase?1 的炎性小體，進(jìn)一步使GSDMD 蛋白活化并與磷酸肌酸結(jié)合使細(xì)胞膜產(chǎn)生小孔，最終導(dǎo)致的膠質(zhì)瘤細(xì)胞腫脹、裂解而產(chǎn)生凋亡作用。此外，CHEN 等［30］將circ?ITCH 過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入膠質(zhì)瘤細(xì)胞使circ?ITCH表達(dá)水平增高，其能夠通過海綿吸附miR?106a?5p 以上調(diào)SASH1蛋白的表達(dá)水平，而SASH1 蛋白能夠有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及侵襲能力。放化療抵抗是膠質(zhì)瘤患者最終死亡的重要原因，YIN 等［31］研究發(fā)現(xiàn)，將高表達(dá)的circHIPK3 敲低能夠通過miR?524?5p/KIF2A 介導(dǎo)的PIK3/AKT 信號(hào)通路恢復(fù)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性，通過某種方法使患者的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中circHIPK3 的表達(dá)含量下降能夠相對(duì)增強(qiáng)其對(duì)替莫唑胺的敏感性，從而延長(zhǎng)患者的生存期，改善預(yù)后，例如外泌體（exosome）可以作為circRNA 的運(yùn)載工具［32］，但如何將其運(yùn)用到臨床治療是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。因而將circRNA 作為治療的靶點(diǎn)是非常有潛力的，其對(duì)于促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡或抑制其增殖、侵襲作用非常有效，最終達(dá)到有效治療膠質(zhì)瘤的目的。與此同時(shí)，circRNA 靶向治療聯(lián)合放化療等治療方案有可能取得更好的治療效果。

3.3 circRNA 參與膠質(zhì)瘤的預(yù)后評(píng)估circRNA對(duì)于膠質(zhì)瘤的預(yù)后具有重要的影響。膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后與瘤組織的大小、WHO 病理分級(jí)、生存時(shí)間等方面相關(guān)。CHEN 等［33］發(fā)現(xiàn)circ_0079586 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤組織的WHO 分級(jí)、腫瘤大小具有明顯的相關(guān)性，但與患者的年齡、性別、腫瘤部位無(wú)關(guān)，Kaplan Meier 生存分析提示circ_0079586 高表達(dá)患者的總體生存率比低表達(dá)患者明顯降低，因此其具有作為膠質(zhì)瘤患者預(yù)后評(píng)判指標(biāo)的潛力。同樣的，CHEN 等［34］發(fā)現(xiàn)circ_0074026 分子也可以作為膠質(zhì)瘤患者預(yù)后評(píng)判的一個(gè)指標(biāo)，circ_0074026 高水平表達(dá)的膠質(zhì)瘤患者5年總生存率比低表達(dá)患者相比明顯升高，其表達(dá)含量的異常升高預(yù)示著患者的預(yù)后較差并且容易導(dǎo)致膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展。除了作為直接預(yù)后評(píng)估分子外，其調(diào)控的表達(dá)產(chǎn)物也可間接反映膠質(zhì)瘤的預(yù)后。如circCPA4 能夠與let?7 進(jìn)行結(jié)合調(diào)節(jié)親本基因CPA4 的表達(dá)水平，而CPA4 表達(dá)產(chǎn)物可以對(duì)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后進(jìn)行評(píng)價(jià)［35］。由此可見，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中某些特異性circRNA 的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后評(píng)價(jià)具有緊密的相關(guān)性，其異常表達(dá)水平的程度可能與膠質(zhì)瘤的生存時(shí)間、WHO 病理級(jí)別、腫瘤大小等方面具有相關(guān)性，所以circRNA 可以作為指導(dǎo)臨床診治的分子指向標(biāo)，但其靈敏性及可靠性有待進(jìn)一步研究。

4 總結(jié)與展望

課題組前期通過對(duì)膠質(zhì)瘤組織及癌旁正常腦組織的表達(dá)譜進(jìn)行分析，通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)circPIP5K1A 在膠質(zhì)瘤中表達(dá)升高，其能夠通過海綿吸附miR?515?5p 分子調(diào)控癌相關(guān)蛋白TCF12 的生成增多，而表達(dá)水平升高的TCF12 蛋白能夠進(jìn)一步激活PI3K/AKT 信號(hào)通路，最終抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡以及促進(jìn)其增殖、侵襲轉(zhuǎn)移以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等生物學(xué)功能，并且可以作為一種評(píng)判膠質(zhì)瘤預(yù)后的分子標(biāo)志［36］。前期研究結(jié)果有助于深入理解膠質(zhì)瘤凋亡及發(fā)生發(fā)展等機(jī)制，同時(shí)也為膠質(zhì)瘤的基因治療提供了堅(jiān)定可靠的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，由于其對(duì)于放化療的抵抗及極差的預(yù)后使得膠質(zhì)瘤成為了亟待解決的世界性難題。近年來研究發(fā)現(xiàn)circRNA 具有十分廣泛的生物學(xué)功能，其在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展以及放化療抵抗機(jī)制方面均有重要的現(xiàn)實(shí)意義，以circRNA 作為靶點(diǎn)進(jìn)行深入研究為膠質(zhì)瘤的診治提供有力的理論支持，但目前人們對(duì)circRNA 的認(rèn)知仍較淺，其生物學(xué)作用機(jī)制以及作為基因治療的靶點(diǎn)在膠質(zhì)瘤中的臨床應(yīng)用還需大量基礎(chǔ)及臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索驗(yàn)證，相信circRNA 能夠成為治療膠質(zhì)瘤的一把新利器。