低濃度二甲雙胍對肝癌細(xì)胞株Huh-7遷移、侵襲能力的影響及其機(jī)制

殷威達(dá)，吳秋秋，劉一帆，劉季芳，陳紀(jì)濤

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣州510700

世界范圍內(nèi)肝癌（HCC）發(fā)病率位居惡性腫瘤的第五位，病死率高居第三位［1］。我國每年大約40萬人死于HCC，占全球HCC死亡總數(shù)的51%［2］，給社會和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。目前，HCC首選、最有效的治療方法是手術(shù)切除，但該病早期無典型癥狀，一旦確診往往處于晚期，肝功能受損嚴(yán)重，耐受性差，導(dǎo)致大部分患者失去手術(shù)機(jī)會［3］。即使HCC患者獲得根治性切除，5年內(nèi)仍有60%～70%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移［4］。此外HCC對放、化療均不敏感，總體來說患者預(yù)后仍不理想。哺乳動物中丙酮酸脫氫酶激酶（PDK）通過磷酸化丙酮酸脫氫酶復(fù)合物（PDC）的活性，進(jìn)而啟動Warburg代謝進(jìn)程促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的異常增殖，作為4種異構(gòu)體之一的PDK4在調(diào)控PDC蛋白物質(zhì)代謝中扮演著靶標(biāo)的角色［5-6］。文獻(xiàn)［7-9］報道，藥物通過調(diào)節(jié)PDK4的表達(dá)調(diào)控PDC，進(jìn)而影響糖代謝和脂代謝，HCC細(xì)胞主要利用糖酵解作為能量來源，而糖、脂代謝對于腫瘤的增殖異常重要。二甲雙胍作為一種經(jīng)典的治療Ⅱ型糖尿病藥物，前期研究發(fā)現(xiàn)低濃度二甲雙胍通過誘導(dǎo)HCC細(xì)胞衰老抑制其增殖［10-11］。最近體外研究也發(fā)現(xiàn)，PDK4表達(dá)缺失促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖、致瘤性和侵襲轉(zhuǎn)移［12］，敲低PDK4能夠上調(diào)關(guān)鍵脂肪生成酶的表達(dá)促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖和遷移［13］。但二甲雙胍能否通過調(diào)控PDK4蛋白表達(dá)抑制其增殖和遷移、侵襲目前尚未報道。2020年7—10月，我們觀察了低濃度二甲雙胍對HCC細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響，并探討其機(jī)制，旨在為HCC的治療提供新的理論基礎(chǔ)及治療靶點。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、試劑及儀器HCC細(xì)胞Huh-7購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。二甲雙胍鹽酸鹽（Sigma公司），Transwell 24孔板、Matrigel基質(zhì)膠（Corning公司），PDK4抗體（Abcam公司）。多功能酶標(biāo)儀（美國，BioTEK），細(xì)胞計數(shù)儀（美國，Countstar IC-1000）、倒置熒光顯微鏡（德國，Leica），正置熒光顯微鏡（德國，Leica）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國，ChemiDoc XRS+），Western blot系統(tǒng)（美國，Bio-Rad）。

1.2 二甲雙胍干預(yù)后的Huh-7細(xì)胞遷移率測算 采用細(xì)胞劃痕實驗。取對數(shù)生長期的Huh-7細(xì)胞，以胰酶消化，用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基終止消化，再均勻鋪到六孔板中，六孔板背面畫上5條相互平行的橫線，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。次日細(xì)胞長滿后再將培養(yǎng)基棄去，用PBS清洗3遍，用200μL槍頭沿著直尺垂直橫線分別劃各孔細(xì)胞，再用PBS清洗劃痕處漂浮的細(xì)胞，各孔分別加入1和0 mmol/L二甲雙胍（分別記為觀察組和對照組），再放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，分別于24、48 h時用倒置顯微鏡拍照，計算遷移率。

1.3 二甲雙胍干預(yù)后的Huh-7細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)計算 采用細(xì)胞侵襲（Transwell）實驗。用無血清DMEM培 養(yǎng) 基 將 基 質(zhì) 膠 稀 釋 至200μg/mL，將100μL基質(zhì)膠緩慢加入Transwell小室，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。將對數(shù)生長期的Huh-7細(xì)胞分別用1和0 mmol/L二甲雙胍處理24 h（分別記為觀察組和對照組），用胰酶消化后細(xì)胞計數(shù)，用無血清DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋至5×105個/mL，加200μL在各小室，再分別在下室各孔中分別加入750μL含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，十字搖勻，放細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。用無菌棉簽拭去基質(zhì)膠和小室未侵襲的細(xì)胞，各下室棄去培養(yǎng)基后用PBS清洗3次，加入4%多聚甲醛固定20 min。再棄去多聚甲醛，用PBS清洗2次，再加入1%結(jié)晶紫染色40 min。PBS洗去小室多余結(jié)晶紫后，在正置顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行拍照，計算侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.4 二甲雙胍干預(yù)后的Huh-7細(xì)胞PDK4 mRNA檢測 采用葡萄糖代謝芯片。將處于對數(shù)生長期的Huh-7細(xì)胞分別用無血清DMEM高糖培養(yǎng)基配制成的1、0 mmol/L二甲雙胍處理24 h（分別記為觀察組和對照組），送到上海康成生物科技有限公司做葡萄糖代謝芯片，通過用TRIzol法提取總RNA，經(jīng)過檢測、純化、探針雜交等步驟，對葡萄糖代謝芯片的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)和功能富集分析，評估二甲雙胍對PDK4 mRNA表達(dá)的影響。

1.5 二甲雙胍干預(yù)后的Huh-7細(xì)胞PDK4蛋白檢測 采用蛋白免疫印跡實驗。取對數(shù)生長期Huh-7細(xì)胞，分別用1、0 mmol/L二甲雙胍處理24 h，加入裂解液，裂解完轉(zhuǎn)至離心管，4℃下以12 000 r/min的速度離心20 min，取部分上清用BCA法測蛋白濃度，剩余上清加入5×Loading buffer，煮10 min蛋白變性后-20℃保存。上樣電泳：冰上操作，根據(jù)蛋白濃度上樣，上樣量為50μg，80 V電泳，條帶分開和樣品壓成直線時調(diào)為120 V，條帶跑到電泳槽底部終止電泳。轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜槽保持低溫，100 V轉(zhuǎn)膜120 min。封閉：5%脫脂牛奶中封閉2 h。敷一抗：根據(jù)蛋白分子量剪膜，加入根據(jù)抗體說明書稀釋好的一抗，4℃冰箱搖床過夜。敷二抗：回收一抗，洗膜3次后再加入BSA稀釋好的二抗，室溫?fù)u床孵育1 h。顯影：洗膜3次，打開Image Lab系統(tǒng)，加入顯影劑曝光，檢測PDK4蛋白。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞遷移率、侵襲數(shù)比較 觀察組干預(yù)24、48 h細(xì) 胞 遷 移 率 分 別 為40.14%±2.40%、84.02%±3.85%，對 照 組 分 別 為100.00%±0.00%、170.10±7.48%，兩組比較，P均＜0.05。觀察組干預(yù)24 h細(xì)胞侵襲數(shù)為（183.20±17.13）個，對照組為（403.60±17.31）個，兩組比較，P＜0.05。

2.2 兩組PDK4 mRNA、蛋白相對表達(dá)量比較 觀察組及對照組PDK4 mRNA相對表達(dá)量分別為1±0.01、1.84±0.01，兩組比較，P＜0.05。觀察組及對照組PDK4蛋白相對表達(dá)量分別為0.53±0.01、0.44 ±0.01，兩組比較，P＜0.05。

3 討論

2020中國臨床腫瘤學(xué)會（CSCO）HCC治療指南數(shù)據(jù)顯示，全球每年HCC新發(fā)病例一半以上來自中國；在中國范圍內(nèi)，HCC位居惡性腫瘤的第四位，致死率高居第二位，嚴(yán)重威脅著國民的健康，給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。HCC的治療手段主要有手術(shù)、放化療、介入、免疫和靶向治療，雖然取得了很大的進(jìn)步，極大地改善了患者的預(yù)后，但5年生存率仍不盡人意［14-15］。目前，治療HCC療效最好的治療手段是手術(shù)切除和肝移植，但早期無明顯癥狀體征、疾病進(jìn)展快、易肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移、癌栓侵犯大血管等因素嚴(yán)重制約手術(shù)開展［16］。如果能抑制HCC細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，對于增加手術(shù)切除機(jī)會提高患者生存率具有重要意義［17］。臨床工作中我們發(fā)現(xiàn)，慢性肝炎極易損傷肝臟組織，導(dǎo)致患者肝功代謝異常引起肝硬化，嚴(yán)重時可使肝細(xì)胞發(fā)生癌變，導(dǎo)致HCC的發(fā)生。能量代謝異常是實體瘤細(xì)胞的基本特征之一，因此從逆轉(zhuǎn)HCC代謝重編程的角度去探討，對于HCC的治療具有十分重要的意義。

代謝方式的改變對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要，丙酮酸脫氫酶激酶家族在腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用。PDK4作為4種丙酮酸脫氫酶激酶亞型之一，是糖酵解和氧化磷酸化途徑的關(guān)鍵酶，調(diào)控整個代謝網(wǎng)絡(luò)使其適合腫瘤的生長［18］。最新研究發(fā)現(xiàn)，PDK4基因敲除可以增強(qiáng)HCC細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)HCC細(xì)胞遷移、侵襲［12］。YANG等［13］亦發(fā)現(xiàn)，敲低PDK4明顯增加脂肪合成關(guān)鍵酶如脂肪酸合成酶（FASN）和硬脂酰輔酶A去飽和酶（SCD）的表達(dá)，最終誘導(dǎo)脂肪生成，同時促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖和侵襲遷移，據(jù)此推測PDK4可能通過下調(diào)脂肪生成來抑制HCC細(xì)胞的增殖和遷移侵襲能力。在接受多模式治療的轉(zhuǎn)移性HCC患者中，上調(diào)PDK4表達(dá)可降低肝化療誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，并與術(shù)后肝功能改善相關(guān)［19］。這些發(fā)現(xiàn)表明，PDK4表達(dá)缺失可促進(jìn)HCC的惡性進(jìn)展從而影響臨床預(yù)后，上調(diào)PDK4則有助于改善HCC患者預(yù)后，而PDK4也被發(fā)現(xiàn)在肺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌中起到抑癌作用［20-22］。腫瘤抑制因子在癌癥中經(jīng)常被下調(diào)，我們進(jìn)一步查詢The Human Protein Atlas和Gepia Cancer兩個數(shù)據(jù)庫，體內(nèi)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCC組織中PDK4蛋白低表達(dá)，HCC中PDK4表達(dá)升高的患者，5年生存率顯著提高。以上體內(nèi)外實驗結(jié)果提示，PDK4蛋白表達(dá)可能與HCC肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

本課題組前期研究中葡萄糖代謝芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度二甲雙胍處理HCC Huh-7細(xì)胞后，與對照組相比，PDK4 mRNA的表達(dá)明顯升高。而PDK4蛋白表達(dá)又和HCC細(xì)胞遷移、侵襲密切相關(guān)，那是否低濃度二甲雙胍能夠通過上調(diào)該蛋白的表達(dá)抑制其轉(zhuǎn)移能力？我們分別采用細(xì)胞劃痕和Transwell兩種經(jīng)典實驗方法驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度二甲雙胍確實抑制HCC細(xì)胞的遷移、侵襲。為進(jìn)一步驗證二甲雙胍通過調(diào)控PDK4抑制HCC細(xì)胞遷移、侵襲能力，接下來我們采用1 mmol/L二甲雙胍處理HCC細(xì)胞，實驗結(jié)果證實其能夠顯著上調(diào)PDK4蛋白表達(dá)。但在HCC中，二甲雙胍通過調(diào)控PDK4蛋白抑制其侵襲的具體機(jī)制，目前還需進(jìn)一步闡明。

總之，二甲雙胍能抑制HCC Huh-7細(xì)胞的遷移和侵襲，機(jī)制可能與其可調(diào)控PDK4蛋白表達(dá)有關(guān)。PDK4有望成為抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的新靶點，為肝癌的靶向治療提供新的研究方向。