自體富血小板血漿促糖尿病足潰瘍愈合機(jī)制研究進(jìn)展

金路，左蕊，劉麗，包樹明，諾布央卓，向小燕

1川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川南充637000；2川北醫(yī)學(xué)院

糖尿病是全身性慢性疾病，伴有多組織器官損傷。糖尿病足是糖尿病常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，其截肢、致殘、致死率高，嚴(yán)重影響人類健康。糖尿病足潰瘍（DFU）因長(zhǎng)期高糖環(huán)境導(dǎo)致局部微環(huán)境改變，創(chuàng)面難以愈合，其治療難度大、時(shí)間長(zhǎng)、費(fèi)用高，給患者個(gè)人和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。自體富血小板血漿（PRP）是指利用血液中各成分沉降系數(shù)不同，通過離心自體全血而獲得的富含血小板的血漿。PRP中含有大量生長(zhǎng)因子，如血小板源性生長(zhǎng)因子AB（PDGF-AB）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）等［1］，可促進(jìn)細(xì)胞增殖分化和血管重塑新生，具有良好的促組織修復(fù)和再生能力。作為新型創(chuàng)面修復(fù)材料，PRP具有制作簡(jiǎn)易、價(jià)格低廉、臨床實(shí)用性高、安全性好等優(yōu)點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用于口腔科、皮膚科、骨科、整形科等領(lǐng)域，是治療難愈性創(chuàng)面的一種有效方法。研究表明，PRP具有抗炎、促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)、減少細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生、修復(fù)周圍神經(jīng)、穩(wěn)定血管內(nèi)皮、重建微循環(huán)、抗菌等作用，可有效促進(jìn)DFU的創(chuàng)面愈合?，F(xiàn)將PRP促進(jìn)DFU愈合的作用機(jī)制綜述如下。

1 抗炎作用

炎癥反應(yīng)延遲和失調(diào)是DFU難以愈合的原因之一。巨噬細(xì)胞是機(jī)體中主要的炎癥細(xì)胞，其作用主要是釋放細(xì)胞因子、招募其他細(xì)胞及刺激血管新生。在炎癥早期，巨噬細(xì)胞在趨化因子的作用下向創(chuàng)面發(fā)生遷移，隨即血小板釋放的生長(zhǎng)因子激活巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞分為M1型（促炎癥型）和M2型（促血管型）兩種狀態(tài)，創(chuàng)面形成早期M1型巨噬細(xì)胞出現(xiàn)，增強(qiáng)創(chuàng)面炎性反應(yīng)，清除壞死物質(zhì)；進(jìn)入創(chuàng)面形成后期時(shí)，M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量減少，并向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生抗炎因子，使局部炎性反應(yīng)減輕，促進(jìn)創(chuàng)面細(xì)胞增殖和血管化［2］。激活的巨噬細(xì)胞不僅能夠吞噬壞死物質(zhì)減少炎癥反應(yīng)，還能釋放細(xì)胞因子進(jìn)一步促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)。長(zhǎng)期處于高糖狀態(tài)下，巨噬細(xì)胞的表型和功能可發(fā)生變化，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失調(diào)。高血糖和胰島素缺乏可通過Akt-mTOR和ERK通路以及對(duì)巨噬細(xì)胞前體的表觀遺傳調(diào)控來改變巨噬細(xì)胞的功能［3］。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，PRP能有效募集糖尿病創(chuàng)面的巨噬細(xì)胞趨化浸潤(rùn)，并促進(jìn)其向M2型分化，抑制創(chuàng)面炎癥因子表達(dá)，促進(jìn)抗炎癥因子表達(dá)，加速糖尿病創(chuàng)面愈合［4］。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明，PRP在體外可促進(jìn)大鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2型巨噬細(xì)胞，其作用機(jī)制可能與JAK1/3-STAT6通路有關(guān)［5］。糖尿病患者體內(nèi)NLRP3炎性復(fù)合物被激活，導(dǎo)致IL-1β表達(dá)上調(diào)；而PRP可抑制NLRP3/IL-1β信號(hào)通路，促進(jìn)DFU愈合［6］。此外，PRP中的HGF和TNF-α能夠干擾NF-κB的轉(zhuǎn)移活性［7］，通過降低NF-κB轉(zhuǎn)移活性抑制NLRP3的激活，從而減少IL-3β分泌，起到抗炎作用。體外實(shí)驗(yàn)表明，APRC可上調(diào)miR-21表達(dá)，mi R-21可負(fù)性調(diào)控PDCD4，抑制NF-κB活性，從而參與抗炎作用［8］。因此認(rèn)為，PRP可通過調(diào)控局部炎癥反應(yīng)促進(jìn)DFU愈合，且PRP的抗炎效果與其白細(xì)胞含量有關(guān)，白細(xì)胞含量越高，PRP的抗炎癥性越強(qiáng)［9］。

2 促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生

細(xì)胞外基質(zhì)合成是創(chuàng)面愈合過程中必不可少的環(huán)節(jié)。DFU患者創(chuàng)面中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）水平增高，細(xì)胞外基質(zhì)生成降解失衡，從而導(dǎo)致創(chuàng)面愈合困難。

成纖維細(xì)胞能夠促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成及分泌，在傷口愈合過程中起重要作用。PRP可通過多種生長(zhǎng)因子激活成纖維細(xì)胞，合成膠原蛋白及其他胞外成分，并分泌促傷口愈合生長(zhǎng)因子。EGF可刺激上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，可促進(jìn)糖尿病足慢性創(chuàng)面的愈合［7］。TGF-β對(duì)間充質(zhì)起源的細(xì)胞具有刺激作用，可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和分化，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，廣泛參與創(chuàng)面愈合的各個(gè)階段［12］。研究顯示，慢性創(chuàng)面中TGF-β表達(dá)明顯低于正常水平，而PRP可提高其表達(dá)量。CHO等［13］采用PRP體外干預(yù)成纖維細(xì)胞，結(jié)果顯示，PRP可刺激皮膚成纖維細(xì)胞增殖及遷移，且誘導(dǎo)Ⅰ型膠原、彈性蛋白、MMP-1和MMP-2的表達(dá)增加，從而加速傷口愈合。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，PRP可有效促進(jìn)糖尿病大鼠背部創(chuàng)面的愈合，PRP治療組創(chuàng)面組織內(nèi)Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)水平高于非PRP治療組，且Ⅰ型/Ⅲ型膠原比值也明顯增高［14］。這表明PRP促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合可能與其增強(qiáng)創(chuàng)面膠原合成的作用有關(guān)。

PRP強(qiáng)有效的修復(fù)能力，離不開其促細(xì)胞增殖及促基質(zhì)生成能力。此外，細(xì)胞凋亡增加也是DFU遷延不愈重要原因之一，糖尿病足創(chuàng)面皮膚細(xì)胞凋亡水平較非糖尿病創(chuàng)面明顯升高［15］。PRP可降低凋亡相關(guān)基因Bad和Caspase-3表達(dá)，提高Bcl-2表達(dá)，從而減少細(xì)胞凋亡［16］。

3 修復(fù)周圍神經(jīng)

糖尿病足發(fā)病隱匿，糖尿病患者周圍感覺、運(yùn)動(dòng)、自主神經(jīng)損傷，引起觸覺、痛覺等感知能力降低，肌肉力量、平衡能力減退，從而導(dǎo)致DFU形成。

HASSANIEN等［17］采用PRP注射治療糖尿病周圍神經(jīng)病變，觀察其臨床療效，結(jié)果顯示PRP可減輕糖尿病神經(jīng)病變的疼痛、麻木癥狀，改善周圍神經(jīng)功能。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，添加5%PRP可顯著促進(jìn)施萬細(xì)胞增殖、遷移及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的產(chǎn)生，PDGF-BB和IGF-1參與PRP對(duì)施萬細(xì)胞細(xì)胞的促有絲分裂作用，PDGF-BB也可能參與PRP的遷移誘導(dǎo)作用，進(jìn)而促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷處的軸突再生［18］。隨著研究的深入，PRP在神經(jīng)修復(fù)方面的機(jī)制將逐步明確。

4 穩(wěn)定血管內(nèi)皮，重建微循環(huán)

在組織修復(fù)過程中，循環(huán)重建至關(guān)重要，充足的血供是創(chuàng)面愈合的前提。DFU患者機(jī)體長(zhǎng)期處于高糖環(huán)境，可導(dǎo)致外周血管病變、微循環(huán)障礙，下肢血流明顯減少，使足遠(yuǎn)端組織缺血損傷，進(jìn)而潰瘍形成，且損傷后修復(fù)困難。

PRP中含有多種促血管生成細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)血管生成，而內(nèi)皮細(xì)胞的增殖則有利于微循環(huán)的重建。其中VEGF、PDGF等起重要作用，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和趨化，有利于血管新生［19］。袁園等［20］的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，PRP組中新生血管更多，且CD31、a-SMA、VEGF-A及PDGF-BB表達(dá)高于對(duì)照組，表明PRP可促進(jìn)血管的形成及成熟穩(wěn)定。GUO等［21］研究表明，PRP來源的外泌體可誘導(dǎo)糖尿病大鼠創(chuàng)面內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，從而促進(jìn)血管生成和再上皮化。最新研究顯示，血小板激活后，線粒體可通過胞吞作用傳遞至間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）內(nèi)，具有呼吸功能的線粒體能夠提高M(jìn)SCs胞質(zhì)中的檸檬酸水平，增強(qiáng)脂肪酸合成，激活MSCs分泌促血管生成因子，進(jìn)而加強(qiáng)其促血管生成能力［22］。

5 抗菌

感染是影響DFU愈合的重要因素，發(fā)生損傷后細(xì)菌易于定殖，細(xì)菌可通過釋放毒素導(dǎo)致細(xì)胞壞死，或侵入細(xì)胞引起細(xì)胞凋亡。糖尿病患者血糖調(diào)節(jié)紊亂、機(jī)體免疫受損，使感染更難以控制。

研究證實(shí)，PRP具有抗細(xì)菌感染作用。PRP中含有較高濃度的白細(xì)胞，中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞具有一定程度的抗菌作用，血小板釋放的α顆粒、趨化因子、抗菌肽、免疫球蛋白、過氧化物等物質(zhì)也具有抗菌作用。與傳統(tǒng)抗生素相比，PRP不引起細(xì)菌耐藥，且與抗生素具有協(xié)同作用［23］。AHAMED等［24］報(bào)道，PRP可顯著提高糖尿病足的治愈率，且傷口感染率降低。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PRP可有效抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)［25］。金黃色葡萄菌感染可使人角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)PDCD4表達(dá)上調(diào)，激活NF-κB信號(hào)通路，增加促炎細(xì)胞因子IL-6及TNF-α的表達(dá)，抑制抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)。APRC可減輕金黃色葡萄球菌對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT的刺激，抑制NF-κB信號(hào)通路［26］。

6 調(diào)節(jié)自噬

自噬在創(chuàng)面修復(fù)中發(fā)揮重要作用。自噬是機(jī)體的一種自我保護(hù)機(jī)制，自噬水平增加可促進(jìn)損傷組織細(xì)胞的再生及修復(fù)；但另一方面，過度的自噬可導(dǎo)致自噬介導(dǎo)的細(xì)胞死亡［27-28］。糖尿病足創(chuàng)面肉芽組織中的炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞等均發(fā)生了自噬水平的改變。糖尿病足創(chuàng)面合并銅綠假單胞菌感染時(shí)，患者創(chuàng)面肉芽組織內(nèi)細(xì)胞自噬水平降低，且合并缺血時(shí)，創(chuàng)面肉芽組織內(nèi)細(xì)胞自噬水平降低更加明顯。

對(duì)伴銅綠假單胞菌感染的DFU患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)感染控制后自噬水平升高。采用自噬抑制劑3-MA干預(yù)后，糖尿病動(dòng)物模型創(chuàng)面愈合減慢，而PRP能上調(diào)創(chuàng)面組織自噬水平，進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合［29］。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于糖尿病創(chuàng)面與自噬的研究還較少，其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

目前治療DFU的標(biāo)準(zhǔn)治療方案包括清創(chuàng)術(shù)、血管再造術(shù)、抗感染治療、皮瓣移植等，但這些方法都缺乏促進(jìn)組織生長(zhǎng)的細(xì)胞因子。PRP的應(yīng)用很好的解決了此類問題。臨床治療結(jié)果顯示，PRP聯(lián)合負(fù)壓封閉引流（VSD）治療難愈性創(chuàng)面較單純VSD效果更佳，愈合時(shí)間縮短，抑菌率提高［30］。PRP現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于糖尿病創(chuàng)面的治療，然而其相對(duì)較短的半衰期限制了其臨床應(yīng)用，且糖尿病創(chuàng)面微環(huán)境中存在大量蛋白酶，導(dǎo)致PRP中細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子的降解，進(jìn)而阻礙血管生成和糖尿病創(chuàng)面愈合。有研究者將殼聚糖、絲素蛋白和PRP制作成CBPGCTSSF@PRP凝膠，通過體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分析其特性，結(jié)果顯示該水凝膠結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，降解速率可調(diào)，既能保護(hù)PRP的生物活性，又能維持生物活性分子在創(chuàng)面表面的穩(wěn)定釋放［31］。近年來PRP制備技術(shù)雖不斷改進(jìn)，但仍缺乏標(biāo)準(zhǔn)化制備方法及臨床應(yīng)用方案，有待進(jìn)一步深入研究。