煙草黃瓜花葉病毒亞組Ⅰ分離物生物學(xué)特性

申莉莉 宋麗云 龔明月 何青云 宋青松 王寶劍 劉文濤 李斌 王玉潔 藺忠龍

摘 要：對引起花葉狹長及皰斑畸形重癥的煙草黃瓜花葉病毒，采用生物學(xué)接種、CP基因擴增測序、電鏡觀察、免疫印跡、熒光定量等方法，研究病毒分離物的株系、粒體形態(tài)、致病力、稀釋限點、傳導(dǎo)路徑以及在抗感煙草上的癥狀。結(jié)果顯示，分離物外殼蛋白基因長度為657 bp，其核苷酸序列與亞組Ⅱ的代表Q株系同源性為69.83%，與亞組Ⅰ的代表Fny株系同源性為93.00%，介于ⅠA與ⅠB株系之間。病毒粒體球形，直徑28～30 nm，對煙草致病力強。病汁液稀釋限點為10-5，質(zhì)量濃度40倍稀釋接種后病毒由接種葉移動到主莖后，先向下至根、向上至心葉，再擴散布滿全株，最后集中在上部葉。亮黃和G28對其表現(xiàn)高感，病葉狹窄、黃化斑駁、變薄革質(zhì)化及皰斑畸形;Ti245和鐵耙子表現(xiàn)中抗，病葉輕微脈明斑駁。

關(guān)鍵詞：煙草;黃瓜花葉病毒;亞組Ⅰ;生物學(xué)特性

Abstract： Cucumber mosaic virus （CMV） showing heavy narrow mosaic and enation deformity on tobacco leaf was isolated. The strain， viral morphology， pathogenicity， dilution limit concentration， transmission route and symptoms on resistant and susceptible tobacco were studied via biological inoculation， CP gene sequencing， electron microscopy， western blot and qRT-PCR. The results showed that the 657 bp coat protein gene shared 69.83% homology to CMV group Ⅱof Q strain， 93.00% identity to CMV groupⅠof Fny strain， which were between ⅠA andⅠB strains. The virus particles were spherical， about 28-30 nm in diameter. It showed strong pathogenicity to tobacco. The dilution limit concentration of disease juice was 10-5 in vitro. After inoculation with 40 times dilution on tobacco， CMV systemically spread from inoculated leaf to stem， first down to root and up to heart leaf， then to whole plant， finally continued to upper new leaves. Bright yellow and G28 were susceptible， showing heavy narrow and yellow mosaic， leathery and distorted leaves. Ti245 and Tiepazi were moderate resistance， showing vein clearing and mild mosaic.

Keywords： tobacco; cucumber mosaic virus; subgroupⅠ; biological characteristics

黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）是雀麥花葉病科（Bromoviridae）黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus）的代表種，是由RNA1、RNA2、RNA3組成的三分體正義單鏈RNA病毒。CMV嚴(yán)重危害我國煙葉生產(chǎn)，煙草苗期和成株期均可感染，以大田成株期發(fā)病較多，且CMV往往與其他病毒混合發(fā)生嚴(yán)重，煙草產(chǎn)量損失巨大[1-2]。

CMV不同株系或分離物其寄主范圍不同，侵染同一寄主表現(xiàn)的癥狀存在一定差異。根據(jù)外殼蛋白（coat protein，CP）同源性可將其分為亞組Ⅰ和亞組Ⅱ[3]，根據(jù)RNA3的5'非編碼區(qū)將亞組Ⅰ分為ⅠA和ⅠB[4-6]。亞組Ⅱ接種煙草引起溫和的系統(tǒng)斑駁和接種葉上出現(xiàn)壞死斑紋，亞組Ⅰ導(dǎo)致嚴(yán)重的系統(tǒng)花葉畸形，但不引起壞死斑紋[7]。

研究表明，RNA2是決定不同分離物存在寄主相關(guān)的致病性分化的主要區(qū)段[8]。RNA2編碼的2a蛋白是引起細(xì)胞壞死反應(yīng)的重要因子，第631位氨基酸突變可導(dǎo)致豇豆上的壞死反應(yīng)消失[9-10];2a蛋白C端缺失會降低病毒在寄主體內(nèi)的含量，減輕在煙草上的致病癥狀[11]。此外，RNA3編碼的CP嚴(yán)重影響葉綠體光系統(tǒng)Ⅱ，與花葉癥狀的產(chǎn)生直接相關(guān)[12]。例如，M株系侵染煙草引起嚴(yán)重的黃白化，F(xiàn)ny株系侵染煙草引起綠斑駁;通過兩者RNA3不同區(qū)域重組試驗，發(fā)現(xiàn)花葉斑駁癥狀由CP上第129位氨基酸所決定[4， 12]。

病毒不同株系致病癥狀和發(fā)病程度受寄主抗性和侵染后環(huán)境條件影響。通常利于煙株生長的溫度也利于病毒增殖，高溫條件下葉部常發(fā)生隱癥[1]。CMV在寄主上引起的癥狀與摩擦接種時的溫度有關(guān)，亞組Ⅱ在高于26 ℃時侵染煙草不產(chǎn)生系統(tǒng)癥狀，而低于26 ℃時會產(chǎn)生葉片黃化[3];亞組Ⅱ分離物接種三生煙（Nicotiana tabacum）癥狀溫和，但其癥狀和致病性受溫濕度和光照強度影響[14]。強致病性株系M能引起煙草葉片完全黃化，但具有癥狀恢復(fù)現(xiàn)象，機制尚不明確[13]。

山東青島煙草CMV典型癥狀為斑駁黃化、花葉狹長及皰斑畸形，嚴(yán)重降低煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)。為明確該地區(qū)CMV株系，闡明其在煙株體內(nèi)的系統(tǒng)擴散時程，采集該CMV病葉進(jìn)行了分離純化、株系鑒定和生物學(xué)特性研究，以期為該病害的防治提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試植物、病毒和檢測試劑盒

枯斑寄主莧色藜（Chenopodium amaranticolor）用于病毒分離純化和稀釋限點檢測;系統(tǒng)寄主三生NN煙（N. tabacum var. Samsun NN）、本氏煙（N. benthamiana）、K326、Ti245、鐵耙子、亮黃、G28用于病毒擴散時程和致病性測定。

熒光定量、聚丙烯酰胺凝膠電泳及免疫印跡等試劑購自TaKaRa公司，CP抗體購自美國Agdia公司，Actin抗體購自北京CWBIO公司，引物（表1）合成及測序由青島派森諾基因科技有限公司完成。

1.2 CMV純化保存及株系鑒定

于發(fā)病初期，采集青島即墨試驗地花葉狹長及皰斑畸形的煙草CMV病葉，于滅菌的研缽中研磨成病汁液，用TMV、CMV和PVY免疫膠體金試紙條檢測，排除混合侵染樣品后，汁液摩擦接種莧色藜，于26 ℃/16 h光照下培養(yǎng)5～7 d。摳離單斑，研磨成汁液接種在三生NN煙上活體保存[14]。田間系統(tǒng)調(diào)查于團棵期至旺長期進(jìn)行[15]。

提取病葉總RNA，以CMV CP-F1和CMV CP-R1為引物，擴增CP全序列。測序后提交NCBI比對病毒株系并制作系統(tǒng)進(jìn)化樹。提取病葉總蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡，檢測CP條帶[16]。

1.3 CMV形態(tài)及提純液侵染力測定

采用聚乙二醇法提純CMV[1]，測定OD280計算病毒提純液的濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測CP純度，負(fù)染法透射電鏡觀察病毒形態(tài)[16]。提純液用PBS稀釋10、20倍，摩擦接種4～5葉期亮黃上部兩片展開葉，記錄病癥。

1.4 CMV病汁液稀釋限點測定

取在三生NN煙上活體保存35 d的上部展開病葉，研磨并用PBS稀釋成10-1～10-6系列質(zhì)量濃度，接種莧色藜，測定稀釋限點[16]。

1.5 CMV在煙草上的擴散時程觀測

在5～6葉期單盆單株本氏煙和K326上，接種質(zhì)量濃度40倍稀釋的CMV，26 ℃培養(yǎng)。定株拍照記錄發(fā)病時程。另于接種后4、8、12、16 d取各部位組織，采用熒光定量PCR檢測CP表達(dá)量[16]。

1.6 CMV對不同煙草品種的致病性觀測

Ti245、鐵耙子、G28、亮黃于30孔聯(lián)體育苗盤假植，26 ℃培養(yǎng)至5～6葉期。在其上部兩片展開葉上摩擦接種40倍稀釋的CMV。接種后21 d逐株判定發(fā)病級別并記錄抗感差異[17]。

2 結(jié) 果

2.1 CMV田間癥狀和純化保存

田間系統(tǒng)調(diào)查顯示，團棵期CMV發(fā)病率達(dá)10%，顯著低于TMV和PVY，但0～9級發(fā)病級別均有發(fā)現(xiàn)。病葉典型癥狀有：花葉狹長、斑駁黃化，變薄革質(zhì)化，皰斑耳突、扭曲畸形，葉基伸長、葉尖細(xì)長呈鼠尾狀，嚴(yán)重時葉肉組織變窄甚至消失，僅剩主脈而呈線條葉，病株矮化、發(fā)育不良。此外，中下部葉還可表現(xiàn)沿主、側(cè)葉脈的深褐色閃電狀壞死斑紋，也稱“橡葉紋”。

取CMV黃化狹長及皰斑畸形病葉，研磨汁液摩擦接種在莧色藜上，26 ℃培養(yǎng)5～7 d，接種葉出現(xiàn)過敏性壞死反應(yīng)枯斑;接種三生NN和K326表現(xiàn)系統(tǒng)花葉，在本氏煙上表現(xiàn)心葉皺縮和植株矮化（圖1）。

2.2 CMV株系鑒定

CMV CP擴增產(chǎn)物測序大小為657 bp（圖2），命名為青島分離物CMV-Qingdao。比對顯示，CMV-Qingdao與亞組Ⅱ的代表Q株系同源性僅為69.83%;與亞組Ⅰ的代表Fny株系同源性為93.00%，介于ⅠA和ⅠB株系之間，與ⅠA株系同源性為92.09%～94.04%，與ⅠB株系同源性為91.28%～93.27%。提取病葉總蛋白，免疫印跡到一條24 kDa的單一條帶，與CMV CP大小一致。

2.3 提純CMV的形態(tài)和侵染力

100 g病葉提純獲得10 mL濃度為0.266 mg/mL的病毒提純液。電鏡下觀察到直徑28～30 nm的正二十四面體（近球形）病毒粒體，中心有致密電子云。提純液在聚丙烯酰胺凝膠電泳上顯示單一的CP條帶;由于是來自病葉的粗提純液，因而遷移減慢使表觀分子量略大于CP分子量24 kDa。提純液接種在感病煙草亮黃上7～15 d，上部葉表現(xiàn)花葉皰斑和變薄革質(zhì)化，病株矮化，且高濃度處理發(fā)病較重（圖3）。

2.4 CMV病汁液稀釋限點

圖4顯示：枯斑數(shù)量隨稀釋倍數(shù)的增加而顯著降低，10-6稀釋液接種時多數(shù)處理葉片已無侵染點枯斑，因此稀釋限點為10-5，接種物濃度以不低于10-2為宜。此外，隨保存時間的延長，需要定期對毒源進(jìn)行轉(zhuǎn)接復(fù)壯。

2.5 CMV在煙株上的癥狀發(fā)展和移動路徑

5～6葉期本氏煙接種40倍稀釋的CMV后5～11 d，最先顯癥的是心葉，隨之為心葉下葉，最后呈簇頂狀皺縮，顯著矮化（圖1E）。接種在K326上7～21 d，初始心葉上出現(xiàn)脈明褪綠、黃綠相間的斑駁;隨之葉片黃化、變薄革質(zhì)化，葉基伸長、葉尖細(xì)長;最后皰斑畸形，頂芽矮縮（圖1D）。及時施肥，心葉會相對長開，出現(xiàn)煙株生長伴隨花葉顯癥的現(xiàn)象。

本氏煙接種40倍CMV后11 d，取同質(zhì)量的心葉、心葉下葉、接種葉和接種葉下葉，制備相同質(zhì)量濃度的病汁液。試紙條檢測均顯示明顯的陽性條帶，無法從亮度上區(qū)分含量高低（圖5A）。熒光定量檢測CP表達(dá)量顯示：相對于心葉（病毒含量1.00），接種葉含量最高（7.48），其次是心葉下葉（2.16）和接種葉下葉（1.80）（圖5B）。

K326于接種CMV后4、8、12、16 d，取各部位（接種葉上2葉、接種葉上1葉、接種葉、接種葉下1葉、接種葉下2葉、根）組織，相對于接種葉的CP表達(dá)量檢測顯示，第4天在根部、接種葉、上2葉中檢測到CMV，說明病毒由接種葉到達(dá)莖后，先向下至根部。第8天各部位均檢測到病毒，積累量排序為：上1葉<下2葉<接種葉<上2葉<下1葉<根，說明病毒在根部大量積累且開始向上運輸至頂端。第12天積累量排序為：下2葉<下1葉<上1葉<接種葉<上2葉<根，說明病毒由根部向上運輸旺盛。第16天積累量排序為：根<下2葉<下1葉<接種葉<上1葉<上2葉，說明病毒持續(xù)向上部葉運輸，集中在頂端（圖5C）。

上述移動路徑顯示病毒從接種葉移動至莖后，先向下至根、向上至心葉，再逐漸擴散布滿全株，最后集中在上部葉。

2.6 CMV在不同抗病性煙草上的癥狀

在即墨溫室進(jìn)行的煙草苗期接種CMV抗性鑒定試驗中，接種40倍CMV后21 d調(diào)查。T.I.245和鐵耙子上部葉表現(xiàn)輕微的脈明和花葉，表現(xiàn)抗病;G28和亮黃表現(xiàn)顯著的葉片狹窄、黃化斑駁、變薄革質(zhì)化及皰斑畸形，表現(xiàn)感?。▓D6）。

3 討 論

CMV在煙草上具有較強致病性[1，18]。本文用煙草花葉狹長及皰斑畸形的CMV分離物接種煙草，本氏煙、K326、亮黃、G28等均表現(xiàn)感?。▓D1、圖6）。與本試驗同時進(jìn)行的一組試驗表明[19]，該病株引起的煙草花葉畸形較TMV重，矮化較PVY重。CMV在體外的抗逆性較TMV差，致死溫度為60～75 ℃下10 min[1];室溫下病汁液中病毒只能存活3～4 d;稀釋限點為10-5（圖4），病葉質(zhì)量濃度40倍稀釋使用時較易致病。在K326上接種后4～16 d的擴散路徑為接種葉→莖→向下至根、向上至心葉→擴散布滿全株，最后集中在上部葉。這一擴散路徑與TMV相同[16];但試驗中還發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)條件下接種，對癥狀發(fā)展尤其是癥狀恢復(fù)現(xiàn)象有較大影響，營養(yǎng)條件好的單盆單株較30孔聯(lián)體育苗盤更易出現(xiàn)上部葉隱癥現(xiàn)象[19]。

自然界中存在很多CMV株系[20]，已報道的株系或分離物有100余種，命名規(guī)則尚不統(tǒng)一，存在重復(fù)。ⅠB主要發(fā)生在中國、朝鮮、韓國、蒙古和日本等，而世界各地都有ⅠA和Ⅱ亞組的分布[12]。我國煙草CMV分離物兩個亞組均有分布，以ⅠB株系報道較多。從云南煙草上檢測到的CMV分離物與亞組Ⅱ同源性達(dá)96%，與亞組Ⅰ同源性僅為75%[21];從我國11個煙草分離物中鑒定出Ⅰ亞組的ⅠA和ⅠB及Ⅱ亞組，存在組間重組事件[22];侵染貴州、四川煙草的分離物主要屬于ⅠB[23-24]。本文根據(jù)CP序列，發(fā)現(xiàn)青島分離物與Ⅰ亞組Fny株系和Ⅱ亞組Q株系同源性分別為93.00%和69.83%，介于ⅠA與ⅠB株系之間。

重組在RNA病毒變異進(jìn)化中極其重要，同時侵染同一寄主的不同病毒或株系，如發(fā)生重組，會產(chǎn)生適應(yīng)力較強的變異株系，克服寄主抗性、擴大寄主范圍或表現(xiàn)新癥狀。因此，記錄我國煙草主栽品種上CMV的癥狀類型及其對應(yīng)的核酸序列和株系種類，有助于監(jiān)測優(yōu)勢株系的流行變異。

4 結(jié) 論

表現(xiàn)病葉狹窄、斑駁黃化、變薄革質(zhì)化、皰斑畸形和病株矮化重癥反應(yīng)的青島煙草CMV分離物屬于Ⅰ亞組，介于ⅠA與ⅠB株系之間，對煙草致病性強;稀釋限點為10-5，病葉質(zhì)量濃度40倍稀釋接種易致病;在K326上接種4～16 d的擴散時程為：病毒從接種葉移動至莖后，先向下至根、向上至心葉，再逐漸擴散布滿全株，最后集中在上部葉;后期營養(yǎng)充足利于煙株生長和癥狀恢復(fù)。

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