尼可地爾通過磷脂酰肌醇-3激酶通路對缺氧/復(fù)氧心肌細胞抗凋亡作用的研究

師幸偉 石美晶 彭世平

近年來，急性心肌梗死(AMI)的發(fā)病率逐年上升，且發(fā)病年齡日趨年輕化，嚴重威脅人類健康，2000～2017年我國18歲以上人群的AMI住院粗病死率為8.5%，冠狀動脈再通后的心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是其重要原因之一[1]。如何減輕MIRI、最大限度地保護心肌，一直是臨床上關(guān)注的焦點。既往已有較多研究證實MIRI中存在細胞凋亡現(xiàn)象，進一步研究也發(fā)現(xiàn)在MIRI中有多種機制引起心肌細胞凋亡，其中線粒體損傷機制受到廣泛關(guān)注。有研究結(jié)果顯示，線粒體內(nèi)Ca2+超載可導(dǎo)致線粒體嚴重損傷，體積增大至10%左右，在ATP敏感性鉀通道(KATP)開放劑作用下，線粒體損傷明顯減輕，同時KATP開放劑也可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生，繼而起到抑制細胞凋亡的作用[2-3]。蛋白激酶B(Akt)是磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)信號通路中的關(guān)鍵激酶，也是細胞內(nèi)最重要的原癌基因之一，其能夠影響胰島素、生長因子、凝血酶等多種細胞生存所需因子的分泌，通過多種途徑對細胞的生長和死亡發(fā)揮重要調(diào)控作用。深入研究后發(fā)現(xiàn)，KATP開放對多種凋亡信號通路如PI3K、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)均有影響，可能與Akt、活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)等中介物質(zhì)的變化有關(guān)，相互關(guān)系復(fù)雜。本研究通過建立大鼠心肌細胞缺氧復(fù)氧(H/R)模型，采用KATP開放劑尼可地爾和PI3K/Akt抑制劑Ly294002干預(yù)心肌細胞，探討尼可地爾通過PI3K/Akt信號通路發(fā)揮抗凋亡作用的內(nèi)在機制，為尼可地爾應(yīng)用于AMI的臨床防治提供依據(jù)。

材料與方法

1.材料：胎牛血清(FBS)和DMEM/F-12培養(yǎng)基購于GIBCO公司，碘化丙啶(PI)購于Sigma公司，CCK-8購于Dojindo公司，尼可地爾購于北京四環(huán)科寶公司，乳酸脫氫酶(LDH)購于南京建成生物公司，Ly294002、凋亡蛋白淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bax)、Akt、p-Akt和GAPDH抗體購于Cell Signaling公司，三氣培養(yǎng)箱(95%N2+5%CO2混合氣體)購于Esco公司,二氧化碳培養(yǎng)箱購于Sanyo公司，流式細胞儀購于Epics Elite公司，酶標儀購于Tecan公司，凝膠成像系統(tǒng)購于Bio-Rad公司。

2.方法

(1)原代心肌細胞培養(yǎng)：選取出生1～2 d的SD乳鼠，處死后取其心臟心尖部組織，酒精浸泡5 min，用預(yù)冷的D-Hank’s液洗滌3遍，剪碎至1 mm3左右，加入0.125%胰酶8 ml，在37 ℃水浴箱中溫浴10 min，棄上清，加入0.125%胰酶和0.08%Ⅱ型膠原酶各3 ml，37 ℃水浴箱中再次溫浴5 min，收集上清液，加入等量的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，吹打制備成細胞懸液，以1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，重復(fù)3次，棄上清，培養(yǎng)液重懸細胞后置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90 min，利用差速貼壁分離法調(diào)整細胞濃度至5×105個/ml,將最后的細胞懸液接種于96孔板上。接種實驗前3 d于接種板中加入0.1 mmol/L的5-溴脫氧尿苷，抑制非心肌細胞的生長[4]。

(2)H/R模型的構(gòu)建和實驗分組：將原代心肌細胞置于含10%FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，于5%CO2、37 ℃條件下傳代培養(yǎng)約24 h，待細胞生長至約80%的融合狀態(tài)時可用于實驗。然后先將心肌細胞置于三氣培養(yǎng)箱中孵育3 h，再次更換培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至正常培養(yǎng)箱(95%空氣+5%CO2混合氣體)中復(fù)氧孵育3 h，依此構(gòu)建H/R心肌細胞損傷模型[5]。實驗隨機分為4組，每組接種6個孔，①對照組(Con組)：僅在正常培養(yǎng)箱中孵育；②H/R組：先后在三氣培養(yǎng)箱和正常培養(yǎng)箱中孵育；③尼可地爾組(Nic組)：加入50 μmol/L尼可地爾作用心肌細胞60 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，更換含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，然后依次在三氣培養(yǎng)箱和正常培養(yǎng)箱孵育；④尼可地爾+PI3K/Akt途徑特異性抑制劑Ly294002組(Nic+Ly294002組)：加入50 μmol/L尼可地爾和20 μmol/L LY294002作用心肌細胞60 min，PBS洗滌2次，更換含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，然后依次在三氣培養(yǎng)箱和正常培養(yǎng)箱孵育。

(3)比色法檢測LDH漏出率：收集4組培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)液，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液備檢。待培養(yǎng)液吸出后加入等量PBS，超聲波破碎細胞后的溶液待測。應(yīng)用酶標儀于490 nm處測定上清液和破碎細胞液吸光度(OD)值，LDH漏出率(%)=上清液OD值/(上清液OD值+破碎細胞液OD值)×100%。

(4)CCK-8法檢測心肌細胞存活率：將4組建模后的心肌細胞接種于96孔板上，調(diào)整細胞數(shù)量為6×103個/孔，設(shè)6個復(fù)孔，每孔加入培養(yǎng)液200 μl(內(nèi)含20 μl CCK-8)。另設(shè)空白組，空白組不接種心肌細胞只加培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h。H/R處理后除去培養(yǎng)液，再次加入CCK-8培養(yǎng)液置于培養(yǎng)箱中孵育4 h。最后采用酶標儀在450 nm處測定OD值。細胞活力(%)=(處理組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

(5)流式細胞儀檢測細胞凋亡率：收集各組心肌細胞懸液，加入95%的冷乙醇4 ℃固定12 h以上，以2 000 r/min轉(zhuǎn)速離心后加入等量PBS，重復(fù)3次。取細胞懸液50 μl，加入PI 100 μl，染色20 min以上，4 ℃下密封避光保存?zhèn)錂z。流式細胞儀檢測5×103個細胞，激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射光波長為620 nm，用于檢測PI熒光。采用Cell Quest軟件計算凋亡率。

(6)蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)法檢測Bax、Bcl-2、Akt和p-Akt蛋白表達水平：收集各組心肌細胞懸液,4 ℃ PBS液反復(fù)洗滌2次，加入預(yù)冷的細胞裂解緩沖液,冰上裂解15 min，裂解的產(chǎn)物再次于4 ℃、12 000 r/min離心30 min。待蛋白變性后，先進行十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，用TBST溶液洗膜10 min×3次，加入Bax、Bcl-2、p-Akt和GAPDH一抗(GAPDH的稀釋度為1∶5 000，其余蛋白的稀釋度均為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜,用TBST溶液洗膜10 min×3次，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶5 000)，37 ℃孵育2 h，TBST溶液洗膜10 min×3次，以化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色后，置于凝膠成像系統(tǒng)上成像，采用Image Lab軟件分析圖像。凋亡蛋白(Bcl-2、Bax)的相對表達水平以其與內(nèi)參(GAPDH)條帶的灰度值比值表示，Akt磷酸化水平以p-Akt和Akt條帶的灰度值比值表示[6]。

結(jié) 果

1.4組心肌細胞LDH漏出率和存活率比較：H/R組、Nic組及Nic+Ly294002組LDH漏出率均高于Con組，Nic組和Nic+Ly294002組LDH漏出率均低于H/R組，Nic組LDH漏出率低于Nic組+Ly294002(P<0.05)；H/R組、Nic組及Nic+Ly294002組心肌細胞存活率均低于Con組，Nic組和Nic+Ly294002組心肌細胞存活率均高于H/R組，Nic組心肌細胞存活率高于Nic+Ly294002組(P<0.05)。見表1。

2.4組心肌細胞凋亡率比較：Con組、H/R組、Nic組、Nic+Ly294002組心肌細胞凋亡率分別為(3.97±1.30)%、(36.78±2.38)%、(21.12±2.05)%、(28.69±1.84)%，其中H/R組、Nic組及Nic+Ly294002組均高于Con組，Nic組和Nic+Ly294002組均低于H/R組，Nic低于Nic+Ly294002組(P<0.05)。見圖1。

表1 各組間心肌細胞LDH漏出率和存活率比較

3.4組心肌細胞Bcl-2、Bax和p-Akt表達水平比較：H/R組、Nic組及Nic+Ly294002組Bcl-2表達水平均低于Con組，Nic組和Nic+Ly294002組Bcl-2表達水平均高于H/R組，Nic組Bcl-2表達水平高于Nic+Ly294002組(P<0.05)。H/R組、Nic組及Nic+Ly294002組Bax表達水平均高于Con組，Nic組和Nic+Ly294002組Bax表達水平均低于H/R組，Nic組Bax表達水平低于Nic+Ly294002組(P<0.05)。Nic組p-Akt表達水平高于Con組和H/R組，Nic+Ly294002組p-Akt表達水平低于Con組、H/R組和Nic組(P<0.05)。見表2。

表2 4組心肌細胞Bcl-2、Bax和p-Akt表達水平比較

討 論

根據(jù)在細胞上的分布情況，KATP被分為mKATP和sKATP兩種，前者存在于線粒體膜表面，后者存在于細胞膜表面，其在心臟保護方面發(fā)揮重要的正面作用。KATP在正常生理情況下并不開放，當冠狀動脈阻塞、心肌壞死、缺血、缺氧、能量匱乏時，KATP開放以發(fā)揮阻止心肌細胞死亡、保護剩余心肌細胞的作用。既往研究結(jié)果顯示，mKATP可降低室顫的發(fā)生率,縮小AMI的最后壞死面積；選擇性mKATP阻斷劑5-羥色胺(5-HD)可降低AMI期間惡性心律失常的發(fā)生率，抑制AMI的梗死面積擴大[7]。心肌缺血再灌注后心臟出現(xiàn)的心律失常和心電圖監(jiān)測發(fā)現(xiàn)的眾多變化多數(shù)與心肌細胞的KATP狀態(tài)有關(guān)，主要表現(xiàn)包括靜息膜電位和動作電位電壓降低、時程縮短、除極化速度和電傳導(dǎo)速率減慢。進一步研究發(fā)現(xiàn)，KATP在MIRI中開放不足，不能維持心肌細胞動作電位的復(fù)極化順序時，可能會產(chǎn)生早期后去極化(EAD)，繼而導(dǎo)致各種惡性心律失常的發(fā)生[8]。

圖1 流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡情況(A：Con組；B：H/R組；C：Nic組；D:Nic+Ly294002組；PI染色，×100；在熒光顯微鏡下，PI染色的凋亡心肌細胞核顯示為紅色熒光)

PI3K/Akt是細胞內(nèi)重要的信號通路，在介導(dǎo)心肌細胞存活方面具有非常重要的作用，Akt存在于細胞膜內(nèi)面，其表達在PI3K調(diào)控下被激活，通過多條途徑直接或間接調(diào)控心肌細胞凋亡，主要途徑如下：(1)影響細胞轉(zhuǎn)錄因子的活性：叉頭轉(zhuǎn)錄因子磷酸化可在p-Akt作用下被激活,在磷酸化的叉頭轉(zhuǎn)錄因子的作用下，促凋亡基因(如Fasl)的表達可能被抑制；同時活化的Akt也能夠上調(diào)MDM2的活性。(2)抑制凋亡相關(guān)因子的釋放：在PI3K/Akt信號通路的活化作用下，線粒體凋亡因子如細胞色素C釋放減少，促凋亡相關(guān)因子(半胱天冬蛋白酶Caspase-9)可在p-Akt的活化作用下失去作用，繼而綜合多方面發(fā)揮抗凋亡作用。(3)通過級聯(lián)激活直接調(diào)控細胞凋亡：p-Akt能夠激活促凋亡蛋白(如Bad、Bax等)，同時也能夠激活抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-XL等)，在整體作用下，線粒體功能受到保護，細胞凋亡受到明顯抑制[9-10]。

Ahmad等[11]通過研究缺血預(yù)處理模型，發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通道中關(guān)鍵酶Akt的磷酸化能被mKATP開放劑BMS-191095和二氮嗪激活，且該節(jié)點被阻斷后，mKATP開放劑降低心肌細胞凋亡的作用明顯下降，對KATP開放劑保護心肌、抗凋亡的機制可能與PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通道相關(guān)做了系統(tǒng)研究。其他學(xué)者也發(fā)現(xiàn)KATP開放劑對ERK信號通路也有影響，可能與ROS和NO相關(guān)，進一步研究發(fā)現(xiàn)P38MAPK/ERK的保護作用可被5-羥色胺阻斷，同時也表明KATP在體內(nèi)的作用機制較復(fù)雜[12-13]。另有研究結(jié)果顯示，在應(yīng)激導(dǎo)致的心肌凋亡和線粒體損傷中，KATP能通過與鈣結(jié)合的方式進而與線粒體發(fā)生相互聯(lián)系，從而發(fā)揮抗心肌凋亡和抗線粒體損傷的重要保護作用[14]。

本研究結(jié)果顯示，KATP開放劑尼可地爾對H/R損傷模型中心肌細胞的LDH漏出率和細胞凋亡有明顯抑制作用，且此作用的發(fā)揮與PI3K信號通路關(guān)系密切。通過對凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和p-Akt表達水平的檢測，提示尼可地爾減輕細胞凋亡與影響凋亡蛋白有關(guān)，同時其作用發(fā)揮也與PI3K信號通路關(guān)系密切。本研究中，阻斷PI3K信號通路關(guān)鍵酶AKT后，尼可地爾的保護作用并未完全消失，表明尼可地爾發(fā)揮抗凋亡作用存在多通路多方向，這為今后探討KATP和尼可地爾提供了更寬廣的視角。