豬流行性腹瀉病毒（PEDV）核酸疫苗研究進展

伊立超，婁安鋼

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）核酸疫苗研究進展

伊立超，婁安鋼*

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea,PED）是危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要疾病之一。它是急性的，具有高度傳染性，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）感染會破壞動物的消化系統(tǒng)，導(dǎo)致患豬食欲不振，嘔吐和嚴(yán)重腹瀉，用藥物治愈的仔豬也會受到生長不良等因素的嚴(yán)重影響。與傳統(tǒng)的PEDV滅活疫苗和PEDV減毒疫苗相比，PEDV核酸疫苗具有安全性好，制備簡單，免疫效果好的優(yōu)點。文章著重對PEDV發(fā)病機理和PEDV核酸疫苗的研究進展展開綜述，從而加深對PEDV和PEDV核酸疫苗的了解，以期為PEDV感染的預(yù)防和控制措施提供參考。

豬流行性腹瀉病毒；發(fā)病機制；核酸疫苗

豬流行性腹瀉（PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的急性傳染病。該病的主要特征是仔豬急性水瀉，脫水，嘔吐和高死亡率[1-3]，任何階段的豬對PEDV均易感，但由于新生仔豬消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，母源抗體不足以保護它們免受PEDV感染。被PEDV感染的仔豬的平均死亡率可高達80 %。斷奶的豬和育肥的豬連續(xù)腹瀉5～7 d后即可自愈。成年豬通常只出現(xiàn)嘔吐和厭食癥，沒有其他明顯的臨床癥狀[4-5]。1971年，PED首次在英國發(fā)生。然后它傳播到其他歐洲國家，給許多國家的養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。1978年，在比利時分離到了類似于冠狀病毒的病原體CV777，病原性測試證實分離出的病毒是PED的病原體[6]。1982年，PED首次在亞洲報道。與當(dāng)時的歐洲相比，PED在亞洲的流行更為嚴(yán)重[7]。特別是自2010年以來，隨著PEDV新變種的出現(xiàn)，中國，韓國，日本和其他亞洲國家發(fā)生了嚴(yán)重的PED暴發(fā)[8-10]，哺乳仔豬的致死率可高達100 %，PED對亞洲養(yǎng)豬業(yè)產(chǎn)生了越來越大的影響。

疫苗免疫是預(yù)防和控制PED的最重要手段。目前，市場上的商業(yè)疫苗主要是PEDV滅活疫苗和PEDV減毒疫苗。這些疫苗對相同類型的野生株具有良好的免疫效果，但是PED能夠在世界范圍內(nèi)流行并給農(nóng)民造成巨大經(jīng)濟損失的原因恰恰是因為PEDV株具有多種基因型并且容易發(fā)生基因突變，使菌株的毒力得到增強，因此現(xiàn)有疫苗很難發(fā)揮保護作用。

隨著基因工程技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們開始將注意力轉(zhuǎn)向新的基因工程疫苗，例如亞單位疫苗，活載體疫苗和核酸疫苗。因此，本文總結(jié)了PEDV的分子生物學(xué)和發(fā)病機理，以及PEDV核酸疫苗獲得的最新研究成果，為預(yù)防和控制PED提供理論指導(dǎo)。

1 PEDV概述

1.1 PEDV基因組和遺傳結(jié)構(gòu)

PEDV屬于尼多病毒目，冠狀病毒屬和α-冠狀病毒亞科。病毒顆粒是多球形的，直徑約90～ 190 nm，具有電子致密的核和中心暈圈，并且從核輻射出約20 nm的棒狀突起。PEDV的基因組是線性單鏈正鏈RNA，大小約為28 kb。整個PEDV基因組包括5'帽子結(jié)構(gòu)（Cap）和3'poly（A）尾部結(jié)構(gòu)。兩端的非編碼區(qū)（UTR）包含至少7個開放閱讀框（ORFla，ORF1b，ORF2～6）[11-12]。位于5'近端的ORF1a和ORF1b占據(jù)了基因組的2/3，該基因組也不編碼結(jié)構(gòu)蛋白（nsp），其分別編碼病毒聚合酶1a和1b，并且在PEDV的繁殖和復(fù)制中起著非常重要的作用。ORF3基因編碼一種輔助蛋白，其與病毒的致病性有關(guān)[13]。3'末端附近的ORF2，ORF4，ORF5和ORF6基因編碼四種結(jié)構(gòu)蛋白：151.68 kDa的纖突糖蛋白（S），8.79 kDa的包膜蛋白（E），25.37 kDa的基質(zhì)蛋白（M）和48.93 kDa的核蛋白（N）[14]。

1.2 PEDV發(fā)病機制

PEDV具有強烈的宿主細胞傾向，通常僅在小腸絨毛頂部的腸道上皮細胞中感染和復(fù)制，導(dǎo)致絨毛萎縮和吸收不良性腹瀉，繼而出現(xiàn)電解質(zhì)失衡，代謝性酸中毒甚至死亡[15-17]。

大量研究發(fā)現(xiàn)，豬氨肽酶N（pAPN）是PEDV的功能性受體，在PEDV侵襲宿主細胞的過程中起著非常重要的作用[18-19]。研究表明，PEDV S蛋白中S1域的N端區(qū)域可以識別并結(jié)合到pAPN，然后通過直接膜融合將PEDV內(nèi)化到靶細胞中，然后通過病毒去核將病毒基因組釋放到細胞質(zhì)中并開始基因組復(fù)制[20]。Xu等[21-22]研究發(fā)現(xiàn)，PEDV能誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和激活NF-B通路，并能促進宿主細胞IL-8的表達，引起細胞炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致宿主細胞的死亡和破碎并釋放出病毒，從而有利于PEDV的持續(xù)感染。此外，PEDV似乎能夠通過激活細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK），c-Jun N末端激酶（JNKs）和p38促分裂原活化蛋白激酶的三個信號通路來激活細絲。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）使活化的MAPK迅速轉(zhuǎn)運至細胞核，并參與細胞增殖，分化，轉(zhuǎn)化和凋亡，從而促進PEDV在靶細胞中有效繁殖病毒[23]。由此，可以推斷出PEDV復(fù)制和隨后的病理學(xué)變化依賴于PEDV能夠利用多種細胞內(nèi)過程，如細胞凋亡、MAPK信號傳導(dǎo)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

2 PEDV核酸疫苗

核酸疫苗安全且時效性強，與亞單位疫苗和減毒疫苗相比，可以更好地刺激人體的體液和細胞免疫反應(yīng)。核酸疫苗是通過基因工程方法開發(fā)的新型疫苗。其實質(zhì)是將編碼病原微生物特異性抗原蛋白的外源基因直接引入動物細胞，并通過宿主細胞表達抗原蛋白以誘導(dǎo)人體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。這種疫苗可以激活不同的免疫途徑，首先激活MHCⅠ和MHCⅡ分子，然后激活T細胞或間接激活B淋巴細胞產(chǎn)生抗體。

2.1 PEDV S蛋白核酸疫苗研究

Yin等[24]使用EGFP真核表達載體構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPI-2.EGFP.VP7.S，包含了豬輪狀病毒（PoRV）VP7蛋白和PEDV S蛋白。免疫小鼠并進行體液免疫測試，發(fā)現(xiàn)重組核酸疫苗pPI-2.EGFP.VP7.S可以誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生針對PEDV的特異性抗體。同時，細胞免疫試驗發(fā)現(xiàn)，免疫組誘導(dǎo)T淋巴細胞增殖，促進IL-4和IFN-γ細胞因子的分泌，其分泌能力明顯高于空白對照組。Meng等[25]使用編碼PEDV S蛋白的基因制備了核酸疫苗pIRES-（TGEV-S1-PEDV-S），可以刺激人體產(chǎn)生更高水平的體液和細胞免疫反應(yīng)。Suo等[26]用真核表達載體pVAX1分別構(gòu)建了含PEDV S和IL-18的重組核酸疫苗pVAX1-（PEDV-S）和pVAX1-（IL-18），免疫小鼠后，用PEDV特異的ELISA試劑盒分析體液免疫和細胞免疫狀況，MTT法檢測特異性淋巴細胞增殖試驗，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ、IL-4以及PEDV抗體水平均顯著高于單獨免疫組，表明IL-18可以作為細胞因子佐劑增強核酸疫苗的免疫原性。

2.2 PEDV S1蛋白核酸疫苗研究

Meng等[25]使用編碼PEDV S1蛋白的基因制備了核酸疫苗pIRES-（TGEV-S1-PEDV-S1）。pIRES-（TGEV-S1-PEDV-S1）可以刺激人體產(chǎn)生高水平的體液和細胞免疫反應(yīng)，并能誘導(dǎo)一定的中和抗體產(chǎn)生。Suo等[26]用真核表達載體pVAX1分別構(gòu)建了含PEDV S1和IL-18的重組核酸疫苗pVAX1-（PEDV-S1）和pVAX1-（IL-18），將2種重組核酸疫苗單獨或聯(lián)合免疫小鼠，采取PEDV特異的ELISA試劑盒分析體液免疫和細胞免疫狀況，MTT法檢測特異性淋巴細胞增殖試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pVAX1-（PEDV-S1）/pVAX1-（IL-18）聯(lián)合免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ、IL-4以及PEDV抗體水平均顯著高于單獨免疫組，表明IL-18可以作為細胞因子佐劑增強核酸疫苗的免疫原性。

3 討論

李樂等[27]對新城疫病毒F基因優(yōu)化并構(gòu)建真核表達載體質(zhì)粒，免疫SPF雞后發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答。由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所研制的，可預(yù)防H5亞型禽流感的DNA疫苗是中國首個DNA疫苗產(chǎn)品，已獲批在動物中使用[28]。新冠S蛋白的重組質(zhì)粒DNA疫苗在健康成人Ⅰ期臨床試驗中也表現(xiàn)出良好的安全性和免疫原性[29]。核酸疫苗的優(yōu)點主要有：（1）DNA高度穩(wěn)定和靈活，在大流行期間修改相關(guān)的質(zhì)粒序列，即能夠快速地制備相關(guān)疫苗；（2）核酸疫苗質(zhì)?？梢酝ㄟ^多種途徑轉(zhuǎn)染至宿主細胞，通過將質(zhì)粒注射入肌肉、真皮或黏膜表面即可誘導(dǎo)免疫反應(yīng)；（3）可與多種疫苗共同使用，且持續(xù)時間長：動物機體內(nèi)安全性好，無不良反應(yīng)，不存在致病性；（4）吸收質(zhì)粒DNA的肌細胞和單核細胞，能夠刺激產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答；（5）核酸疫苗比較穩(wěn)定，便于儲存和運輸。但是由于核酸疫苗免疫原性較低導(dǎo)致該類型的疫苗并未得到快速發(fā)展，因此近幾年對核酸疫苗的研究主要集中于如何提高其免疫原性。研究發(fā)現(xiàn)使用更加有效的啟動子、對抗原基因進行密碼子優(yōu)化、將編碼佐劑的基因與抗原基因共同表達以及改變免疫接種策略等均可在一定程度上提高核酸疫苗的免疫效力[30]。質(zhì)粒DNA本身攜帶的CPG基序，也具有一定的佐劑功能。通過增加不同類型的佐劑分子與核酸疫苗質(zhì)粒共同使用，可以使免疫調(diào)節(jié)因子保持持久低水平的產(chǎn)生，從而增強核酸疫苗的免疫效果。由此來看，研制出高效、安全的核酸疫苗是亟待解決的關(guān)鍵性問題。

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（2021–05–13）

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