B 族鏈球菌在圍產(chǎn)期婦女的情況和血清型分型研究進(jìn)展

覃德明綜述；胡龍華審校

(江西省婦幼保健院，江西 南昌 330000)

B 族鏈球菌是革蘭陽性球菌，在全球的妊娠婦女GBS 攜帶率為11%～35%[1,2]，我國GBS 陽性定值率3.5%～32.4%[3]，由于地域性差異、種族、衛(wèi)生條件和篩查方法等因素, 使得不同地區(qū)孕婦GBS 陽性率變化很大。 圍產(chǎn)期孕婦感染GBS 會導(dǎo)致孕婦早產(chǎn)、晚期流產(chǎn)、胎膜早破、死產(chǎn)[4]、產(chǎn)褥熱和敗血癥等疾病[5-7]。若無干預(yù)措施，約50%的GBS 攜帶孕婦會將細(xì)菌傳播給新生兒[8],導(dǎo)致新生兒發(fā)生肺炎、敗血癥、腦膜炎等嚴(yán)重疾病[9,10]。 一般新生兒感染分為早發(fā)型（從出生到第6 天）和晚發(fā)型（7 天至89天）[11-13]。 早發(fā)型[14,15]占新生兒GBS 感染的80%～90%，且多是垂直傳播，一般多表現(xiàn)為肺炎和敗血癥。 遲發(fā)型，有多種途徑感染，如早發(fā)型未治愈復(fù)發(fā)、水平傳播等，主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎，可有致死性和神經(jīng)癥狀等后遺癥[16]，所以預(yù)防GBS 感染非常的重要。

目前全世界絕大多數(shù)國家是采用美國婦產(chǎn)科學(xué)會和兒科學(xué)會指南[17]進(jìn)行孕35 周至37 周婦女篩查，GBS 陽性孕婦進(jìn)行藥物[18]干預(yù)治療，對情況不明的孕婦采用風(fēng)險評估策略而預(yù)防性用藥。 國外對孕婦篩查GBS 非常重視，我們國家近幾年也開始重視孕婦GBS 篩查，為了提高檢查的準(zhǔn)確率，臨床除傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)外，不段引入新的檢測方法，如顯色平板培養(yǎng)法、實(shí)時熒光PCR、微滴數(shù)字PCR 檢測方法等。 現(xiàn)對目前臨床上孕婦產(chǎn)前GBS篩查的方法學(xué)進(jìn)行歸納總結(jié)，和GBS 血清型分型情況進(jìn)行闡述以便找到合適臨床篩查方法以及血清型與GBS 感染的關(guān)聯(lián)性。

1 B 族鏈球菌的微生物學(xué)特征

B 族鏈球菌，革蘭陽性球菌，呈單、雙或3～8 個串珠狀排列。 鏈的長短與培養(yǎng)環(huán)境相關(guān)，在液體培養(yǎng)基中生長良好，鏈相對較長。 無芽孢，無鞭毛，無動力，有菌毛，有莢膜且與致病性密切相關(guān)。 兼性厭氧，營養(yǎng)要求較高，一般初次分離要在5%～10%CO2環(huán)境中生長良好，最適生長溫度35℃，pH 值7.4～7.6。 在羊血瓊脂平板上形成灰白色、凸起、中等大小、濕潤、邊緣整齊，絕大多數(shù)呈狹窄溶血，極少數(shù)菌株不溶血，少數(shù)菌株產(chǎn)黃色色素。3%過氧化氫觸酶試驗(yàn)陰性，CAMP 協(xié)同試驗(yàn)陽性，馬尿酸鈉水解試驗(yàn)陽性，6.5%NaCL 不生長。

依據(jù)GBS 表面的莢膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）抗原成分將GBS 分成10 個血清型[11,19,20]（Ia、Ib、Ⅱ….Ⅸ）,不同國家、地區(qū)流行的血清型有所不同[21]。 在國內(nèi)Ia、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ型較為常見[22]，其中Ⅲ型[11]在新生兒侵襲性病例中分離較多，證明其致病力較其他血清型強(qiáng)。

同時，GBS 表面有多種蛋白組成，如莢膜多糖、Sip 蛋白和α 蛋白，還可以分泌一些酶[23,24]等，這些都是重要的毒力因子和分型的主要依據(jù)，在定值、粘附和感染等過程起關(guān)鍵性作用。

2 目前臨床GBS 篩查方法

依據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心指南，對所有孕35W～37W 婦女均要進(jìn)行GBS 篩查，由于GBS 在直腸生殖道的定值呈現(xiàn)慢性攜帶、 間歇性帶菌和短暫攜帶[25,26]，所以需要多種篩查方法比對，找出敏感性高和特異性強(qiáng)的方法用于臨床至關(guān)重要。 目前常用的篩查方法學(xué)有：傳統(tǒng)培養(yǎng)法、顯色平板培養(yǎng)法、實(shí)時熒光PCR、微滴數(shù)字PCR 檢測方法、免疫層析法和等溫lamp 法等[27]。

2.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)法

2.1.1 操作方法 培養(yǎng)法是依據(jù)《臨床微生物操作手冊》，由醫(yī)師或經(jīng)過培訓(xùn)的護(hù)士，清潔孕婦外陰，然后擰開已貼患者信息條碼的滅菌拭子管，使用棉拭子在陰道下段1/3 處旋轉(zhuǎn)2～3 圈，然后將拭子插回?zé)o菌套管里； 擰開另一根也已貼患者條碼信息的滅菌拭子，用棉拭子在離肛門口2～3cm 處直腸旋轉(zhuǎn)2～3 圈，然后將拭子插回套管。 于2h 內(nèi)將標(biāo)本送到實(shí)驗(yàn)室及時接種，以免長時間可能導(dǎo)致細(xì)菌死亡，造成假陰性結(jié)果。 將標(biāo)本接種在羊血瓊脂平板上，分區(qū)劃線，放35℃，5% CO2溫箱培養(yǎng)16～18h，根據(jù)菌落形態(tài)，溶血現(xiàn)象、觸酶，CAMP 試驗(yàn)，然后再進(jìn)行血清凝集鑒定或API 鏈球菌板條或采用全自動微生物分析儀進(jìn)行菌種鑒定。

2.1.2 優(yōu)缺點(diǎn) 培養(yǎng)法是 “金標(biāo)準(zhǔn)”[28]，有較好敏感度和較強(qiáng)特異性，靈敏度和特異度分別是36.36%～73% ，98.24%～100%，且價格便宜，但耗時較長，需要專業(yè)人員且具有一定經(jīng)驗(yàn)才能完成，一般需要24～48h 出結(jié)果，且還易受取樣、送檢時間等因素影響檢出率。

2.2 顯色平板培養(yǎng)法

2.2.1 操作方法 取樣和標(biāo)本接種方法同培養(yǎng)方法，將標(biāo)本接種于顯色平板上[29]，分區(qū)劃線，放普通溫箱35℃，16～18h。 若平板上菌落為紅色或紫紅色則提示可能為GBS，然后進(jìn)行菌株鑒定確認(rèn)。

2.2.2 優(yōu)缺點(diǎn) 顯色平板能非常直觀提示GBS 菌株，且平板添加了抑制劑，可以抑制一些雜菌的生長。 但是少部分不產(chǎn)生色菌的菌株易漏檢。

2.3 實(shí)時熒光定量PCR[30-33]

2.3.1 操作方法 取樣同培養(yǎng)法，國外或國內(nèi)部分實(shí)驗(yàn)室將取樣的標(biāo)本插入Todd Hewitt 選擇培養(yǎng)基35℃，16～18h 增菌后，再進(jìn)行PCR 檢測。 但國內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室是直接將已取標(biāo)本拭子，按試劑盒說明書操作。 ⑴細(xì)菌DNA 提取，⑵將DNA 模板加入反應(yīng)體系，⑶采用專用的熒光PCR 儀，進(jìn)行DNA擴(kuò)增和收集熒光信息，依據(jù)熒光曲線自動判斷陰陽性結(jié)果。

2.3.2 優(yōu)缺點(diǎn) PCR 技術(shù)[34]也是在不斷發(fā)展中，之前的常規(guī)PCR 是以GBS 的蛋白基因、16S-23S 沉默區(qū)基因、 編碼氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-gs0538 的atr 基因、sip[35]基因等作為靶基因，目前大多實(shí)驗(yàn)室或臨床使用的快速篩查GBS 方法都是以編碼CAMP 因子的cfb 為靶基因試劑盒。 它實(shí)現(xiàn)了 “快”“準(zhǔn)”“狠”的特性，體現(xiàn)在檢測時限短，1h 左右可完成；敏感度較高（85%～98.5%）； 超強(qiáng)的特異性（97.6%～99.6%）。 如能實(shí)現(xiàn)自動化，可進(jìn)行床旁檢測。 全程反應(yīng)在單管進(jìn)行，無需產(chǎn)物分析，又避免了實(shí)驗(yàn)室的污染。 但設(shè)備和試劑成本大，有較高技術(shù)含量，對經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)的地區(qū)來說無疑是增加了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 不過從綜合角度考慮，能盡早篩查出GBS 減少疾病導(dǎo)致的不良后果，其成本效應(yīng)[36]是否可以相互抵消？

2.4 微滴數(shù)字PCR 檢測方法[37,38]

2.4.1 操作方法 實(shí)驗(yàn)前的臨床取樣同培養(yǎng)法：⑴將樣品在微滴發(fā)生器里進(jìn)行微滴化處理，形成油包水分散微滴體系； ⑵將該液體轉(zhuǎn)移至PCR 反應(yīng)微孔進(jìn)行獨(dú)立DNA 擴(kuò)增；⑶結(jié)束后微滴分析儀進(jìn)行熒光信號收集，經(jīng)泊松分布原理進(jìn)行樣品濃度計(jì)算。

2.4.2 優(yōu)缺點(diǎn) 該方法是一種新型GBS 篩查方法，無需依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量，微滴化處理減少了雜質(zhì)的污染，且能對低拷貝數(shù)的樣本進(jìn)行檢測，靈敏度（93.1%～99.37%）高和特異性（84.39%～97.2%）強(qiáng)。 但相對于培養(yǎng)法，成本無疑更高，相對于熒光PCR，操作步驟要繁瑣些。

2.5 免疫層析法[39]

2.5.1 操作方法 臨床取樣同培養(yǎng)法，⑴抗原提取，⑵將標(biāo)本滴入抗原檢測試劑卡，⑶根據(jù)檢測卡出現(xiàn)兩條紅線，判讀為GBS 陽性。

2.5.2 優(yōu)缺點(diǎn) 該方法操作簡單，快速，不需要大型設(shè)備，不受標(biāo)本送檢時間限制，可以靈活檢測。 但敏感性變化很大，易受到取樣方式和帶菌量等影響。 特異性也與抗體純度有關(guān)，易受到干擾。 申旺[40]等作者用免疫層析法篩查GBS 敏感度97.5%，特異度為97.54%，而另有研究數(shù)據(jù)顯示，遠(yuǎn)低于上述數(shù)據(jù)，可能不同地區(qū)GBS 流行率不同、與選取的標(biāo)本等因素相關(guān)。

2.6 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）[41,42]

2.6.1 操作方法 臨床取樣同培養(yǎng)法，進(jìn)行DNA 提取，利用靶基因設(shè)計(jì)的特異引物，鏈置換型BstDNA 合成酶，在60～65℃環(huán)境下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，依據(jù)顏色變化肉眼判讀結(jié)果。

2.6.2 優(yōu)缺點(diǎn) 該方法敏感性為92.2%，特異性為95.6%，不需要昂貴的擴(kuò)增儀，快速、便捷，一般可在一小時完成標(biāo)本檢測。 不足之處是引物設(shè)計(jì)較復(fù)雜，試劑成本較貴。

綜合以上方法的優(yōu)缺點(diǎn)，兼顧不同地區(qū)、不級別醫(yī)院的實(shí)際情況，可選擇不同的篩查方法，一般經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的地區(qū)和大醫(yī)院適合開展普通培養(yǎng)聯(lián)合實(shí)時熒光PCR 或介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增。 培養(yǎng)法最大的優(yōu)勢是可以檢測細(xì)菌同時還可以進(jìn)行藥物敏感測試，指導(dǎo)臨床用藥。 實(shí)時熒光PCR 敏感度高，特異性強(qiáng)，可以快速篩查，特別是對那些未能按時產(chǎn)假的孕婦進(jìn)行實(shí)時檢測，以了解孕婦帶菌情況，又可避免僅依據(jù)風(fēng)險評估用藥導(dǎo)致的過度用藥。 而在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)和小型醫(yī)療機(jī)構(gòu)可以選擇膠體金法，簡便快捷。

3 妊娠婦女GBS 攜帶率和血清型分布及菌株耐藥情況

北京[43]地區(qū)孕婦GBS 陽性定值率為5.18%，以Ⅲ型血清型占主要（41.7%），其次為Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ型；菌株對一線藥青霉素、頭孢噻肟敏感，對紅霉素和克林霉素的耐藥率分別為71%和69%。上海[44]地區(qū)孕婦的GBS 陽性定值率為3.72%，以Ⅲ型（32.2%）血清型為主，同時還有Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅴ型；菌株對紅霉素、 克林霉素及左氧氟沙星的耐藥率分別為63.37%，3.48%和25.13%。 廣州[45]地區(qū)孕婦GBS 定值率為6.33%；血清型主要為Ⅲ型，同時有Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ型；菌株對紅霉素和林霉素的耐藥率分別為50.6%和47.8%。 深圳[46]地區(qū)孕婦GBS 定值率為4.5～4.9%，血清型以Ⅲ型（56.1%）為主，同時有Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅴ型。 菌株對四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、 左氧氟沙星的耐藥率分別為76.9%、72.1%、66.4%及27.8%。 江西地區(qū)[47,48]的GBS 定值率為10.21～21.5%, 菌株對紅霉素耐藥率為45～96.03%，對克林霉素耐藥率26～35.1%，未找到血清型分型的相關(guān)文獻(xiàn)。 結(jié)果表明，國內(nèi)孕婦攜帶的GBS 以血清Ⅲ型為主，菌株對青霉素幾乎全部敏感，但對紅霉素和克林霉素耐藥率較高，應(yīng)引起重視。

韓國[49,50]孕婦GBS 陽性定值率為10～17.3%，III 型血清型為主，其他型為Ia,Ib,Ⅱ,IV、V 和VI，菌株對紅霉素和克林霉素耐藥率分別為19.1%和33.3%。 非洲地區(qū)[51]孕婦的GBS 陽性定值率為19.3%，V 型（29.2%）血清型為主, 其他型為III, Ia,Ib 和II，菌株對紅霉素和林霉素耐藥率分別為20.82%和19.63%，分離到對青霉素耐藥菌株。在西澳大利亞[52]孕婦的GBS 陽性定值率為24%，血清型Ia（27.9）為主，其他血清型有III、Ⅱ、V、Ib、VI、IV，菌株對紅霉素和林霉素耐藥率分別為6.4%和4.2%，未檢出對青霉素耐藥菌株。 瑞士[53]孕婦GBS陽性定值率為21%，血清型以Ⅲ型為主，其他型有V 和Ia； 菌株對紅霉素和克林霉素耐藥率分別為14.5%和14%。 在美國[54]孕婦的GBS 陽性定值率為10%～30%，血清型Ia 和III 型最常見，其他型分別是Ib、II、III、IV 和V； 菌株對紅霉素和克林霉素耐藥率分別為32%和20%。

全球孕婦GBS 的定值率為18%，國內(nèi)大部分城市孕婦GBS 定植率要低于全球平均水平，非洲地區(qū)顯著高于全球平均水平，這可能跟種族、流行的血清型和篩查力度等相關(guān)[55]。 現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，全球孕婦攜帶的GBS 血清型以Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、V 型多見，分型的方法以前主要是依靠抗血清，而現(xiàn)在多采用PCR 方法分型。 利用抗血清法存在交叉凝集和不分型菌株，且試劑較為昂貴；現(xiàn)一些實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)使用多重PCR 分子技術(shù)將GBS 分為10 個血清型，檢測時間短，準(zhǔn)確性高，為流行病學(xué)調(diào)查提供了好的技術(shù)手段。

大部分國家孕婦攜帶的GBS 對青霉素類和頭孢菌素類藥物敏感，僅少部分地區(qū)如日本和非洲的一些城市分離到對青霉素耐藥株。 僅澳大利亞孕婦攜帶的GBS 對紅霉素和克林霉素耐藥率＜10%，對于青霉素嚴(yán)重過敏患者可以將其作為二線藥物使用。 其他地區(qū)必須依據(jù)藥物敏感測試結(jié)果才能使用。

大量研究表明，大范圍預(yù)防性用藥[56]，可能會增加耐藥菌株的產(chǎn)生，并且僅對預(yù)防新生兒早發(fā)型感染有一定效果，不能明顯預(yù)防遲發(fā)型感染[57]。甚者會對新生兒產(chǎn)生一定的不利影響[58]，尋求其他預(yù)防策略勢在必行，疫苗是目前最好的方法[59]。

4 總結(jié)

B 族鏈球菌的篩查非常有必要，然而不同篩查方法得到的GBS 陽性率有所差別。 在多種方法中，培養(yǎng)方法仍然為基本技術(shù)，有條件實(shí)驗(yàn)室使用PCR 方法更為方便、陽性率更高。 大量資料顯示，目前血清型以Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、III、V 型最多見，分離的菌株對青霉素絕大地區(qū)均全敏感，說明仍可作為一線用藥，而對于嚴(yán)重過敏患者需要根據(jù)紅霉素和克林霉素藥敏結(jié)果用藥。 要想達(dá)到理想預(yù)防GBS 感染效果，疫苗無疑是最佳選擇，已有數(shù)據(jù)[60]表明五價聯(lián)合疫苗能預(yù)防96%新生兒感染和88%兒童與成人感染。 目前疫苗處于臨床二、 三期階段，相信不久未來，突破一些技術(shù)障礙就可以制備出安全有效的疫苗，使母嬰減少一種病原菌的威脅。