黃芪-丹參藥對治療缺血性腦卒中研究進展

陳雨菡，馬善波，楊 倩，李 龍，王 錦，繆 珊，石小鵬

(1.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046； 2.空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710032)

缺血性腦卒中(Cerebral ischemic stroke，CIS)是一種缺血性腦血管疾病，臨床表現為走路不穩(wěn)、口歪眼斜，甚至突然暈倒，產生意識障礙等。據《2018中國腦卒中防治報告》顯示腦卒中已成為我國成人第一死亡原因，也是成人殘疾的首要原因[1]，伴有高發(fā)病率、高復發(fā)率、高病死率的特點[2]。隨著分子生物學的發(fā)展及臨床科研研究的深入，人們對缺血性腦卒中的病理生理學發(fā)病機制有了更深入的認識，促血管內皮新生、抗炎抗氧化、抗血栓及血腦屏障保護及抑制細胞凋亡已成為抗缺血性腦卒中的治療新策略。

我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥對缺血性腦卒中的治療歷史悠久，積累了豐富的治療經驗。中醫(yī)稱缺血性腦卒中為“中風”，與《黃帝內經》中描述“薄厥”“大厥”“煎厥”以及“偏枯”的記載相似，總屬病因為氣血逆亂。明朝著名醫(yī)學家樓英稱中風病為“卒中”，清朝醫(yī)學家張錫純首次提出了“腦充血”以及“腦貧血”的論點，其中“腦貧血”與現代醫(yī)學描述“缺血性腦卒中”的發(fā)病機制相一致[3]。中醫(yī)認為腦卒中病變核心是“氣虛血瘀”?！皻馓摗笔前l(fā)病之本，“血瘀”乃病發(fā)展之核心[4]。氣是維持血液在體內運轉的動力，血是氣的滋養(yǎng)，載運不致耗虛。氣虛，血運行無力，則致血瘀，故運用益氣活血方是治療缺血性腦卒中的重要方法。中藥治療腦卒中用藥規(guī)律表明，黃芪和丹參使用頻率位于前列且為重要藥對[5]。黃芪具有補氣固表，托瘡生肌的功效，為“補氣之最”，常見于治療“氣虛血瘀癥”的方劑之中，特別是清代名醫(yī)王清任創(chuàng)制的補陽還五湯最具代表性[6]?！侗静菥V目》記載丹參具有“補新血，調經脈”的功效[7]。目前臨床上有許多黃芪-丹參藥對佐證報道。陳家權等[8]認為缺血性中風的主要病機是氣虛血瘀，黃芪、丹參等以益氣活血、化瘀通絡為治病法則，療效良好。姜德遠[9]通過對70例腦梗死恢復期患者研究表明，黃芪丹參湯對腦梗死恢復期患者療效較好。劉金棟[10]通過66例急性腦梗死患者臨床治療發(fā)現，黃芪-丹參合用對急性腦梗死療效顯著，恢復神經功能，并有助于改善預后。因此，黃芪-丹參藥對中黃芪為補氣之王，能益氣補虛；丹參為調理血分之首藥，偏于活血則活血化瘀，黃芪得丹參相佐，生新而不留瘀，丹參得黃芪之助，活血之力倍增，兩藥配伍，協(xié)同增效相得益彰。

黃芪甲苷、黃芪多糖、毛蕊異黃酮、丹參素、丹參酸、丹參酮等是黃芪-丹參藥對中主要的藥效物質?，F代醫(yī)家通過基礎研究和臨床研究證實，對于缺血性腦卒中患者的治療，黃芪-丹參藥對可以在抑制腦血管內皮凋亡及損傷、促進血管內皮新生、抗炎、抗氧化、抗血栓及保護血腦屏障等方面發(fā)揮作用。本文主要基于益氣活血的中醫(yī)理論，綜述黃芪-丹參藥對及其有效成分上述諸作用，以期為在缺血性腦卒中的臨床治療和應用中積累經驗。

1 黃芪-丹參藥對抑制缺血性腦血管內皮損傷和凋亡

當前，對于缺血性腦卒中的治療策略，臨床上還是以早期的溶栓治療為主。雖然這種方法可以有益于患者的血管再通，但是缺血再灌注能導致嚴重的多器官、組織的損傷，甚至影響患者預后效果。缺血性腦卒中患者再灌注損傷的機制現還未完全闡明，普遍認為是由于在缺血性腦卒中發(fā)生超過最佳治療時間窗時，相應區(qū)域內的內皮細胞由于長時間的缺氧、缺血則會發(fā)生變性、壞死，而在這時恢復灌注反而會導致腦血管神經元損傷進一步加重，腦組織水腫加重，從而進一步釋放炎性因子如腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素6(Interleukin6，IL-6)等，同時明顯上調黏附因子表達，引起白細胞的聚集、浸潤，導致血管堵塞，且白細胞釋放的氧自由基會損傷內皮細胞，使腦損傷進一步加劇，形成惡性循環(huán)。因此，減少大腦內皮細胞損傷和凋亡就成為了控制缺血性腦卒中惡化的關鍵。而黃芪-丹參藥對以及其有效成分可通過抑制腦血管內皮損傷、促進腦血管內皮增殖等，從而對治療缺血性腦卒中起到有效的作用。

1.1 黃芪-丹參藥對抑制腦血管內皮細胞凋亡 腦血管內皮細胞在組織細胞和血液中形成半通透屏障，是單層連續(xù)覆蓋于血管內層的扁平細胞。缺血性腦卒中引起的腦血管缺氧、缺血等刺激均可導致血管內皮細胞的氧化應激反應以及通過線粒體途徑凋亡，緊密連接蛋白被破壞，細胞外基質降解量增多或合成障礙。

崔偉等[11]發(fā)現黃芪甲苷處理H2O2誘導的人臍靜脈內皮細胞，能夠減少內質網應激，并且還可以激活低氧誘導因子(Hypoxia inducible factor，HIF-1)，使缺氧誘導的內皮細胞凋亡得到有效控制。Tang等[12]驗證丹參多酚酸對大鼠MCAO模型的治療作用，在進行60 min再灌注之前施用注射用丹參多酚酸(1.67 mg/kg)經股靜脈注入，再灌注后24 h，結果表明丹參多酚酸可減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，支持其臨床應用于急性缺血性卒中的治療。丹參多酚酸可減輕I/R所致的微循環(huán)障礙和神經元損傷，與激活AMPK，抑制NADPH氧化酶亞基的膜轉位，抑制Akt磷酸化和PKC轉位有關。有研究表明[13]，注射用丹參多酚酸孵育人外周血來源內皮祖細胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)后，通過調節(jié)其增殖、黏附和NO分泌活性，促進血管EPCs存活及血管新生，24 h后最多可增加至為5 mg/L(P<0.01)。黃芪-丹參藥對配伍能有效激活PI3K/Akt信號通路，激活HIF-1，改善腦微循環(huán)障礙和神經元損傷，增加EPCs的增值與黏附，調節(jié)NO分泌活性，從而抑制腦血管內皮細胞凋亡。

1.2 黃芪-丹參藥對促進腦血管內皮細胞增殖 缺血性腦卒中會嚴重導致腦細胞缺血缺氧，而隨著缺氧情況愈演愈烈，對腦血管內皮細胞的增殖和代謝的抑制也漸漸加強，血管內皮細胞不僅是平滑肌細胞與血液之間的屏障，還具有強大的內分泌功能，可以釋放各種各樣的活性物質參與人體的各種生理病理過程。

李軍昌等[14]發(fā)現，黃芪甲苷可以穩(wěn)定組織中HIF-1以及血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達，促進人體快速新生血管和促進血管成熟，并且構成具有效灌注功能的微脈管，使人體的血液和氧氣供應得到一定程度的改善。Liang等[15]研究發(fā)現，黃芪甲苷可顯著縮小心肌梗死面積，促進細胞增殖和導管形成，繼而實現促進血管生成和缺血性腦損傷后的腦保護作用。這與通過上調miRNA-210的表達、誘導HIF-VEGF-Notch信號通路的激活、抑制靶基因ewitinA3的表達密切相關。丹參中丹酚酸B有促進內皮祖細胞黏附的作用，趙先鋒等[16]的研究表明，100 g/L丹酚酸B能夠使內皮祖細胞附著率明顯提高，并促使白細胞介素-8 (Interleukin-8,IL-8)和基質細胞衍生因子-1 (Stromal cell-derived factor-1，SDF-1)等細胞活性因子的水平上調，優(yōu)化側支循環(huán)的組織血液供應。李耀汝[17]建立小鼠MCAO模型，并觀察腦缺血后血管生成調控情況，注射用丹參多酚酸連續(xù)治療14 d，結果表明丹酚酸可以調節(jié)VEGF、血管生成素-1(Angiopoietin，Ang-1)和Ang-2的表達，使腦缺血后新血管的重塑加快，該機制可能與JAK2/STAT3路線有關。丹參多酚酸可激活血管生成過程中JAK2/STAT3信號通路，促進卒中后血管生成和神經功能恢復的影響，并取消促血管生成因子的介導作用[18]。在以往的研究中，很多研究者都提出黃芪、丹參的提取物進行配伍可以調控促血管生成因子，黃芪丹參的水煎液還能激活腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine 5-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)[19]。黃芪丹參進行配伍還可以通過抑制腦內微血管內皮細胞系非編碼長鏈RNA的表達，上調VEGF、VEGFA2的表達促進血管內皮細胞新生[20]。

2 黃芪-丹參藥對抗炎、抗氧化作用

缺血性腦卒中發(fā)病過程中會由于腦缺血等原因，造成壞死區(qū)周圍缺血半暗帶的組織供血不足,造成細胞的衰老或死亡，導致超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)的水平顯著降低，清除氧自由基能力下降[21]，大量的氧自由基能夠對蛋白活性和細胞功能產生影響，導致細胞損傷。死亡的內皮細胞還可釋放黏附因子、趨化因子、細胞因子等物質，促使白細胞黏附、趨化運動，最終導致多種炎癥因子的釋放，發(fā)生大炎癥反應。炎癥反應的發(fā)生以及氧自由基的增多引發(fā)的細胞進一步壞死和血管腔堆積在缺血性腦卒中的發(fā)病過程中起著重要的作用。

低密度脂蛋白的氧化可導致內皮細胞部分炎癥性反應。黃芪甲苷治療能逆轉腦組織丙二醛(Malondialdehyde，MDA)水平升高，神經細胞凋亡，半胱氨酸天冬氨酸蛋白-3(Caspase-3)裂解，腦水腫，SOD和谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)活性降低[22]。這表示，黃芪甲苷能夠減少氧化應激反應的發(fā)生，清除自由基，減輕缺血腦組織損傷程度[23]。Xu等[24]研究發(fā)現黃芪甲苷也能顯著提高缺氧/復氧誘導的細胞SOD活性，顯著降低MDA活性和活性氧的產生。因此，黃芪甲苷抑制內質網的氧化應激，大大避免了氧自由基對血管內皮的直接損傷，及其誘發(fā)的炎性反應對血管內皮造成的間接損傷害。用于注射的丹參多酚酸具有明顯增加兩種SOD的活性并減少MDA含量的多種活性成分，清除自由基損傷，大大增強機體抗氧化損傷的能力，從而發(fā)揮良好的腦保護作用[25-26]。注射用丹參多酚酸減弱了Toll樣受體4和核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號傳導途徑，以減少炎癥因子IL-1，IL-6和TNF的表達[27]。Fan等[28]評價丹酚酸對腦I/R損傷的腦保護作用時，通過TTC染色和磁共振成像分析顯示，丹酚酸B能顯著縮小腦梗死面積，并能改善神經行為功能，同時可減少活性氧的產生，顯著降低缺血再灌注損傷腦組織膠質纖維狀酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)、Iba1、白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、TNF-α和Caspase-3的表達。免疫組織化學染色顯示，丹酚酸還可抑制星形膠質細胞和小膠質細胞的過度活化，提示丹酚酸B對腦缺血再灌注損傷具有神經保護作用，可作為臨床治療的有效候選藥物。黃芪、丹參經過一定的濃度進行配比以后，可以影響NF-κB和Nrf2信號通路的調控作用，從而起到抗炎以及抗氧化應激損傷的作用[29]，黃芪丹參顆粒能使腦組織內轉化生長因子(Transforming growth factor beta 1，TGF-β1)、p38MAPK信號通路、Caspase-3 mRNA及蛋白表達明顯減少，從而治療應激損傷部位，有效保護缺血性腦卒中患者的腦組織。

3 黃芪-丹參藥對抗血栓形成作用

正常的情況下，血流中的血小板是不黏附于血管壁的。但當血管壁的內皮受損傷，血小板活化因子和凝血酶等和血小板結合，導致血小板膜糖蛋白的構象發(fā)生改變[30]，與纖維蛋白原結合，從而形成血小板凝集造成附壁血栓。如處理不及時，血小板凝集塊的表面上就會進一步形成纖維蛋白網，網入紅細胞和白細胞致使血栓擴大，導致腦血管內腔閉塞，最終發(fā)生缺血性腦梗塞。

黃志恩等[31]的研究顯示,補陽還五湯能使游離的CD63與CD62P蛋白的表達下調，降低患病大鼠神經受損的程度并減少面積，其劑量和效應之間的關系十分明顯，對今后研究補陽還五湯中有效成分黃芪抗血栓的形成有很大的啟發(fā)作用。華曉東等[32]借助生物標志物檢測方法，評估了丹參多酚酸注射液對血小板活性的影響。由試驗結果可知，丹參多酚酸注射液能夠顯著抑制血小板上由二磷酸腺苷所激活的P-選擇素較高水平的表達，并抑制血小板的活化能力。Liu等[33]通過檢測ADP誘導的血小板表面PAC-1結合和P-選擇素的表達來評價丹酚酸酯對急性冠脈綜合征患者血小板的影響，結果發(fā)現丹酚酸酯可顯著增強標準雙重抗血小板治療的抗血小板作用。丹酚酸B是丹酚酸酯的主要成分，占丹酚酸酯的85%。丹酚酸B通過抑制磷酸二酯酶(Phosphodiesterases，PDEs)和拮抗P2Y12受體，在體外抑制多種激動劑誘導的人血小板活化。杜冠華等[34]實驗發(fā)現丹酚酸A(1 μmol/L)在體外給藥能夠抑制膠原蛋白、二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate，ADP)以及在花生四烯酸油脂的作用下出現的血小板凝集。體內用丹酚酸A(6 mg/kg)可以使在膠原蛋白作用下出現的血小板凝集全部消失；10 mg/kg丹酚酸A可以對在ADP作用下出現的血小板凝集起到明顯的作用，證明丹參有改善缺血性腦卒中的作用。

丹參、黃芪以及兩藥合用會對腦缺血再灌注后腦組內Bcl-2蛋白表達產生影響，從而防止腦血栓的生成。黃芪注射液配伍丹參注射液可以明顯升高氣虛血瘀大鼠腦組織中VEGF、bFGF mRNA的表達，黃芪-丹參藥對配伍能使t-PA維持正常水平，這也是限制缺血性腦卒中患者血栓發(fā)展的重要因素之一，黃芪-丹參藥對還可以通過影響血小板膜糖蛋白的表達等途徑限制血栓擴散，在缺血性腦卒中治療中起到良好的效果[35]。

4 黃芪-丹參藥對血腦屏障保護作用

血腦屏障(Blood brain barrier，BBB)在缺血性中風的發(fā)病機制中起到的特殊作用，逐漸成為臨床醫(yī)學家關注點。缺血性中風發(fā)作后，內皮之間缺乏緊密連接蛋白會引起血腦屏障在短時間內被破壞，從而導致血管性腦水腫，而且這種破壞往往是持續(xù)的，貫穿缺血性中風的急性期到亞急性早期。在缺血性腦卒中情況下，BBB的破壞意味著患者臨床結果出現了惡化，例如出血性轉化。要使血腦屏障結構和功能保持正常必須使毛細血管和內皮之間緊密的相連在一起。

研究發(fā)現，黃芪甲苷能夠維持血管壁結構和功能穩(wěn)定，作用的機制是顯著下調缺血再灌注后腦組織中基質金屬蛋白酶-9(Matrix metalloprotein-9，MMP-9)蛋白的表達，從而抑制細胞外基質的溶解，而對緩解血管源性腦水腫起到了顯著的效果。Claudinscl是毛細血管和內皮細胞之間的緊密連接的跨膜蛋白，其能夠調節(jié)內皮細胞相互之間的黏附、極性和屏障功能，并參與細胞外基質的降解。 Claudin-5是在內皮細胞與細胞接觸處發(fā)現的緊密連接蛋白，對維持腦微血管內皮細胞(Human brain microvascular endothelial cells，BMVEC)完整性至關重要。朊病毒蛋白質(Prion protein，PrP)是一種表面黏附分子，在各種細胞類型的連接處表達，包括BMVEC，是BBB的重要組成部分，Megra等[36]發(fā)現TNF-α和VEGF降低了BMVEC的表面PrP，進一步發(fā)現PrP減少導致Claudin-5的表達減少。TNF-α增強構成血腦屏障的腦毛細血管通透性。Claudin-5是一種關鍵的蛋白，其在腦內皮細胞中的表達對血腦屏障的功能起著至關重要的作用。Aslam等[37]發(fā)現黃芪甲苷能調控單獨過表達NF-κB亞單位p65可抑制小鼠腦內皮細胞中Claudin-5啟動子的活性。在原代培養(yǎng)的小鼠腦內皮細胞中，觀察到長時間的TNF-α作用后 Claudin-5蛋白表達的部分缺失，證實了TNF-α誘導的小鼠腦內皮細胞 Claudin-5表達下調。因此，推測黃芪甲苷能夠通過以上機制維持毛細血管內皮緊密連接結構和功能的完整性。已有研究表明，丹參能夠下調MMP-9的水平和上調金屬蛋白酶的組織抑制劑-1(Tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1)水平，從而大大減少血腦屏障的損傷。Wu等[38]通過用血管生成素-2(Angiopoietin-2，Ang2)刺激周細胞建立高血壓的體外模型，丹酚酸A以劑量依賴性方式減弱血腦屏障通透性。它下調大腦外周細胞中的促凋亡蛋白，包括p53，p21，Fas，FasL，caspase 3和Bax，并上調CDK6，cyclin D1，CDK2，cyclin E和Bcl-2。這可能與丹酚酸A通過增加Ras，Raf，p-MEK1，p-MEK2，p-ERK1和p-ERK2等蛋白的水平以劑量依賴性方式激活Ras/Raf/MEK/ERK途徑，減少Ang2誘導的腦微血管周細胞凋亡，降低細胞周期G0/G1期細胞比例有關。黃芪甲苷和丹參酮配伍可明顯抑制缺血性腦損傷的大鼠腦組織含水量進一步上升，使MDA、IL-1β、TNF-α含量降低從而抑制MMP-2、MMP-9蛋白的表達，使SOD、CAT的活性增加，并且上調緊密連接蛋白ZO-1的表達。相關的研究表明[39]，在中醫(yī)傳統(tǒng)的針灸治療的基礎上配合黃芪-丹參藥對，可明顯使ZO-1、Claudin-5、JAM-A蛋白表達水平升高。黃芪-丹參藥對還可以通過調控蛋白以及一些炎性因子的表達，對血腦屏障起到一定的保護作用，從而治療缺血性腦卒中。而在西藥環(huán)孢菌素A的基礎上加用黃芪丹參顆?？梢允鼓X組織水含量及伊文思藍漏出量大大減少，表明黃芪-丹參藥對能夠有效保護血腦屏障。

5 結 語

缺血性腦卒中患者可能出現認知功能障礙和運動功能障礙，如果缺血性腦卒中的發(fā)病部位在額葉、海馬等部位，將會導致患者的智能顯著下降，運動功能受到影響則會出現偏癱，嚴重影響患者日常生活。除此之外，如果缺血性腦卒中面積較大，則會導致患者意識模糊，行動出現障礙，甚至危及患者的生命。近年來，越來越多的研究表明，該疾病運用中醫(yī)辨證活血化瘀藥治療效果顯著，而黃芪-丹參藥對及主要成分以其可以通過多種作用保護血管內皮和抑制細胞凋亡、抗炎、抗血栓以及保護血腦屏障，從而有望成為中醫(yī)藥治療缺血性腦卒中的重要藥物。

黃芪-丹參藥對能夠抑制內皮細胞凋亡，加快內皮細胞繁殖和遷移、使每個細胞間的連接蛋白得到充分的表達并且可以提高細胞自身抵抗疾病的能力從而使其能夠更好的起到保護血管內皮的作用，維持血管內皮屏障功能和促進血管再生,抵抗炎癥和氧化過激以及改善認知功能的藥用價值也尤為突出。但是，黃芪丹參藥對的藥理作用的研究仍尚未全面展開，目前研究的主要方向還集中在心血管疾病上，其他疾病諸如神經退行疾病、腦血管疾病、神經免疫性疾病等的研究還相對較少，且大多數都還停留在基礎研究階段，臨床應用較少。因此，深入研究黃芪-丹參藥對對神經細胞等的保護作用機制，以及保護血管內皮的作用靶點，將對心腦血管疾病的治療和腦部疾病的預防產生重要價值。