華重樓野生種群表型變異研究

周新華，曾平生，武曉玉，黃宇濤

(中國林業(yè)科學(xué)研究院 亞熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，江西 分宜 336600)

種群內(nèi)的遺傳多樣性是種質(zhì)資源保存的依據(jù)。遺傳多樣性是指種群內(nèi)基因和基因型的多樣性，它體現(xiàn)了物種基因的豐富程度，是研究生態(tài)系統(tǒng)多樣性和物種多樣性的基礎(chǔ)[1-5]。遺傳多樣性研究通常包括表型、生化、染色體、DNA和堿基序列等多層次遺傳變異研究[6]。盡管表型性狀不能完全等同于基因位點(diǎn)，但利用表型性狀研究種群的遺傳多樣性具有簡便、高效、經(jīng)濟(jì)、直觀和實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)[7-12]。目前，國內(nèi)外學(xué)者利用表型變異已在許多珍稀瀕危植物上開展了研究[13-15]，為保護(hù)或遺傳改良珍稀瀕危植物資源奠定了理論基礎(chǔ)。

華重樓ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara屬百合科重樓屬的多年生草本植物，作為重樓藥材的基源植物收載于2020年版《中華人民共和國藥典》中，是著名中成藥云南白藥、宮血寧膠囊、季德勝蛇藥等的主要成分，具有非常高的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[16-19]。華重樓主要分布在我國江蘇、浙江、江西、福建、廣東、廣西、湖北、湖南和四川等南方省份，自然生長于海拔600～1 350 m的林下蔭處或溝谷邊的草叢中[20]。華重樓作為一種珍貴的中藥材，主要以根莖入藥，藥用活性成分為重樓皂苷，具有抗癌、止血、消炎、鎮(zhèn)痛、止咳平喘和免疫調(diào)節(jié)等作用，常用于治療蛇毒、乳腺炎、跌打損傷等病癥[21-22]。雖然華重樓具有很高的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在長江以南省份也偶見人工栽培，但研究主要集中在組培技術(shù)[23-24]、人工栽培[25]和藥用成分分析[26-27]等方面，而遺傳育種的基礎(chǔ)性工作地理種群遺傳變異少見有相關(guān)報(bào)道。本文以華重樓7個(gè)地理種群為研究對象，系統(tǒng)測定葉片、莖、花萼、果球和種子等的17個(gè)表型性狀，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，深入研究種群間和種群內(nèi)的變異規(guī)律，以期為華重樓種質(zhì)資源保護(hù)、藥材資源開發(fā)利用和繁育改良提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品來源與數(shù)據(jù)的收集

通過查閱中國植物數(shù)字標(biāo)本館(http://www.cvh.ac.cn/)和電子版《中國植物志》(http://www.iplant.cn/frps)初步確定華重樓的分布區(qū)域后，進(jìn)一步通過文獻(xiàn)檢索、咨詢當(dāng)?shù)叵嚓P(guān)專家和野外實(shí)地調(diào)查，最終確定華重樓的自然地理分布地，并于2018和2019年的9—11月間進(jìn)行野生華重樓植株、葉片、花萼、果球和種子的樣品采集和數(shù)據(jù)調(diào)查、測量工作。野生華重樓的樣品數(shù)據(jù)采集點(diǎn)分別位于江西省新余市(JXXY)、浙江省麗水市(ZJLS)、四川省雅安市(SCYA)、廣東省清遠(yuǎn)市(GDQY)、福建省三明市(FJSM)、湖南省婁底市(HNLD)和湖北省宜昌市(HBYC)，共計(jì)7個(gè)地理種群。數(shù)據(jù)采集時(shí)，選擇生長情況正常、無明顯的病蟲害發(fā)生、無明顯的生長畸形、達(dá)到生殖成熟、有正常飽滿的果球的單株樣品進(jìn)行調(diào)查測量。鑒于華重樓天然種質(zhì)資源分布稀少，調(diào)查時(shí)各地理種群單株保有量只需達(dá)到30株以上、樣品單株間隔10 m即可。因野生華重樓多分布于深山溝壑，數(shù)據(jù)收集工作比較困難，故在選擇樣品單株時(shí)，各地理種群只調(diào)查15株，7個(gè)地理種群共計(jì)105株。調(diào)查測量時(shí)，現(xiàn)場記錄樣點(diǎn)的地理經(jīng)緯度數(shù)據(jù)、海拔高度數(shù)據(jù)，其他氣候因子數(shù)據(jù)通過查詢資源學(xué)科領(lǐng)域基礎(chǔ)科學(xué)數(shù)據(jù)整合與集成應(yīng)用人地系統(tǒng)主題數(shù)據(jù)庫(http://www.data.ac.cn)獲得，具體數(shù)據(jù)見表1。

表 1 7個(gè)野生華重樓地理種群的地理及主要?dú)夂蛞蜃忧闆rTable 1 Sample collection information of Paris polyphylla var.chinensis from different distribution regions and climatic data at the sampling sites

1.2 表型性狀的測定

統(tǒng)計(jì)待調(diào)查表型性狀的野生華重樓單株的葉片數(shù)和花萼片數(shù)，摘取其所有葉片和花萼片，平鋪在硬紙板上，并利用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測量其葉長、花萼長、葉寬、花萼寬，同時(shí)測量地徑、果球橫徑和果球縱徑等指標(biāo)，精確到0.01 mm，測量結(jié)束后，計(jì)算葉片長寬比、花萼長寬比和果球橫縱比；利用便攜式葉面積測定儀(LI-3000C，LI-COR，Lincoln，USA)測定所有葉面積和花萼面積，精確到0.01 cm2；利用不銹鋼卷尺測量每株野生華重樓的株高和花梗長，精確到0.1 cm；采集成熟種子，人工搓掉紅色種皮，用清水沖洗干凈，置于通風(fēng)陰涼處，晾干后及時(shí)利用電子分析天平測定每個(gè)種群種子的千粒質(zhì)量，精確到0.01 g。以上數(shù)據(jù)測量，每個(gè)種群選取5個(gè)樣品單株，重復(fù)3次，每個(gè)種群測量15株，共計(jì)105株。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用社會(huì)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS25.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。應(yīng)用表型分化系數(shù)、單因素方差分析以及多因素方差分析方法分析種群間和種群內(nèi)的變異情況；利用相關(guān)分析來探討表型因子與地理因子的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生華重樓種群間和種群內(nèi)的表型變異

野生華重樓種群間和種群內(nèi)的表型性狀變異的方差分析結(jié)果見表2。所選取的17個(gè)表型性狀除葉片數(shù)和花萼片數(shù)外，其余15個(gè)表型性狀指標(biāo)在種群間和種群內(nèi)都存在顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)的差異，這說明野生華重樓絕大多數(shù)表型性狀在種群間和種群內(nèi)存在廣泛的變異。

野生華重樓7個(gè)地理種群17個(gè)表型性狀的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及多重比較分析結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，除葉片數(shù)和花萼片數(shù)在各種群間差異不顯著外，其余15個(gè)表型性狀指標(biāo)在各種群間均存在顯著差異。其中，四川雅安種群的葉長、花萼長、葉寬、花萼寬、葉面積、花萼面積、株高和地徑8個(gè)表型性狀指標(biāo)數(shù)值最大，與其他6個(gè)地理種群大多為差異顯著；浙江麗水種群的果球縱徑最大，葉片長寬比和果球橫縱比最??；廣東清遠(yuǎn)種群的花梗長、葉片長寬比和花萼長寬比最大，果球縱徑最??；湖北宜昌種群的花梗長、葉長、花萼長、花萼寬、花萼長寬比、葉面積、種子千粒質(zhì)量和地徑8個(gè)表型性狀指標(biāo)為所有種群中最小，果球橫縱比最大；湖南婁底種群果球橫徑和種子千粒質(zhì)量最大；福建三明種群的果球橫徑最小，顯著小于湖南婁底和浙江麗水種群。

表 2 野生華重樓種群間和種群內(nèi)全株、果、葉及種子表型性狀的方差分析結(jié)果1)Table 2 Variance analysis of phenptypic traits of wholeplant, leaf, fruit and seeds among and within Paris polyphylla var.chinensis

表 3 野生華重樓7個(gè)地理種群20個(gè)表型性狀的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及多重比較1)Table 3 Mean, standard deviation and multiple comparison of 20 phenotypic traits in seven geographical populations of Paris polyphylla var.chinensis

續(xù)表 3 Continued table 3

野生華重樓7個(gè)地理種群的17個(gè)表型性狀的方差分量及其種群間表型分化系數(shù)見表4。17個(gè)表型性狀的平均方差分量在種群間占比26.39%、種群內(nèi)占比52.19%、隨機(jī)誤差占比21.42%，就平均方差分量所占百分比而言，種群間只是種群內(nèi)的一半，這說明野生華重樓生長表型在種群間的變異遠(yuǎn)小于種群內(nèi)的變異；17個(gè)表型性狀的平均分化系數(shù)種群間的貢獻(xiàn)值為34.27% (即種群內(nèi)的貢獻(xiàn)值為65.73%)，這就進(jìn)一步表明，野生華重樓的表型變異主要源于種群內(nèi)部。

2.2 野生華重樓表型變異特征分析

野生華重樓各地理種群表型性狀的變異系數(shù)列于表5。野生華重樓17個(gè)表型性狀在種群內(nèi)的平均變異系數(shù)為17.72%，變異幅度為6.83%～29.95%?；üｉL、葉面積、花萼面積和株高4個(gè)表型性狀指標(biāo)的平均變異系數(shù)均大于20%，超過所有表型性狀指標(biāo)的平均變異系數(shù)(17.72%)；葉片數(shù)、花萼片數(shù)、果球橫徑、果球縱徑、果球橫縱比和種子千粒質(zhì)量6個(gè)表型性狀指標(biāo)的平均變異系數(shù)均小于14.47%，小于所有表型性狀指標(biāo)的平均變異系數(shù)(17.72%)，表明華重樓葉片數(shù)量、花萼數(shù)量、果球和種子的性狀穩(wěn)定性大于其他性狀指標(biāo)的穩(wěn)定性。進(jìn)一步比較7個(gè)地理種群野生華重樓17個(gè)表型性狀指標(biāo)的平均變異系數(shù)可以得到，廣東清遠(yuǎn)、湖南婁底和江西新余3個(gè)地理種群的變異系數(shù)均超過平均變異系數(shù)，表明廣東清遠(yuǎn)、湖南婁底和江西新余野生華重樓種群的表型變異和多樣性較為豐富；湖北宜昌、浙江麗水、四川雅安和福建三明4個(gè)地理種群的變異系數(shù)均小于平均變異系數(shù)，說明湖北宜昌、浙江麗水、四川雅安和福建三明地理種群的表型變異和多樣性較廣東清遠(yuǎn)、湖南婁底和江西新余地理種源弱。

2.3 野生華重樓種群表型的地理變異分析

對野生華重樓全株、莖、葉、花、果球和種子17個(gè)表型性狀與樣品采集點(diǎn)地理氣象因子之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，葉長、葉寬和葉面積與樣品采集點(diǎn)的經(jīng)度呈現(xiàn)顯著或極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明隨著經(jīng)度的不斷增加，野生華重樓葉長、葉寬和葉面積將不斷減小；葉寬、葉面積、花萼長、花萼寬、花萼面積和果球縱徑與緯度呈現(xiàn)顯著或極顯著的正相關(guān)關(guān)系，葉片長寬比和果球橫縱比與緯度呈現(xiàn)極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，這就說明隨著緯度的增加，葉寬、葉面積、花萼長、花萼寬、花萼面積、果球縱徑將呈現(xiàn)上升趨勢，而葉片長寬比、果球橫縱比將呈現(xiàn)下降趨勢；葉長、葉寬、葉面積、花萼長、花萼寬、花萼面積、花萼長寬比、株高和地徑與海拔呈現(xiàn)顯著或極顯著的正相關(guān)關(guān)系，果球橫縱比和種子千粒質(zhì)量與海拔呈現(xiàn)極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明海拔越高，葉片、花萼、株高、地徑也隨之越大，果球橫縱比和種子越小(表6)；葉寬、葉面積、花萼長、花萼面積、果球橫徑和果球縱徑與年平均溫度呈顯著或極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，葉片長寬比、花萼寬與年平均溫度呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系，說明隨著年平均溫度的升高，葉片將變得小而長，種球也隨之變小；葉長、葉寬、葉面積、花萼長、花萼寬、花萼面積和果球縱徑與無霜期呈顯著或極顯著的正相關(guān)關(guān)系，果球橫縱比則與無霜期呈現(xiàn)極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明無霜期越長，葉片和花萼越大，果球越大；葉長、葉面積、花萼長、花萼寬、花萼面積與年日照時(shí)數(shù)呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明日照時(shí)間越長，葉片和萼片越??；葉長、花萼長、花萼寬、果球縱徑和種子千粒質(zhì)量與年降水量呈顯著或極顯著正相關(guān)，果球橫縱比則與年降水量呈極顯著負(fù)相關(guān)，這說明年降水量越大，葉片越長，種子越大(表6)。對表6的綜合分析發(fā)現(xiàn)，野生華重樓的葉片數(shù)、花萼片數(shù)和花梗長與7個(gè)生態(tài)地理環(huán)境因子無顯著相關(guān)關(guān)系，說明這些生態(tài)地理環(huán)境因子對野生華重樓這一物種的種群形態(tài)影響不大。

表 4 野生華重樓表型性狀的方差分量及種群間表型分化系數(shù)Table 4 Variance component and differentiation coefficients of phenotypic traits among and within populations in Paris polyphylla var.chinensis

表 5 野生華重樓種群17個(gè)表型性狀變異系數(shù)Table 5 Variation coefficients of 17 phenotypic traits in Paris polyphylla var.chinensis populations %

續(xù)表 5 Continued table 5

表 6 野生華重樓17個(gè)表型性狀與生態(tài)地理因子的相關(guān)系數(shù)1)Table 6 Correlation coefficients between 17 phenotypic traits of Paris polyphylla var.chinensis and ecological geography factors

3 討論與結(jié)論

3.1 野生華重樓表型性狀的變異來源

通過對野生華重樓7個(gè)地理種群的17個(gè)性狀和生長表型指標(biāo)的深入研究發(fā)現(xiàn)，無論是在種群間還是在種群內(nèi)，除葉片數(shù)和花萼片數(shù)外的其他指標(biāo)均存在顯著或極顯著的變異，這與多花黃精Polygonatumcyrtonema[2,28]、人參Panaxginseng[29]、畢節(jié)小檗Berberisguizhouensis[30]、八角蓮Dysosma versipellis[31]等林下經(jīng)濟(jì)植物的研究結(jié)果類似。通過種群間的表型分化系數(shù)分析可知，種群間的變異遠(yuǎn)小于種群內(nèi)的變異，這就說明種群內(nèi)的變異是野生華重樓表型變異的主要來源。華重樓17個(gè)表型性狀的變異幅度為16.38%～50.08%，平均表型分化系數(shù)為34.27%，種群間的變異僅貢獻(xiàn)34.27%，遠(yuǎn)小于種群內(nèi)的變異貢獻(xiàn)65.73%，這一現(xiàn)象出現(xiàn)的可能原因：一是各種群的自然分布有著極強(qiáng)的區(qū)域性，這就增加了不同種群間的基因交流難度；二是野生華重樓的生長發(fā)育與林下小生境關(guān)系密切。綜上所述，野生華重樓種群間的基因交流機(jī)會(huì)要小于種群內(nèi)部的基因交流，說明華重樓的表型變異主要源自于各地理種群內(nèi)部。

3.2 不同地理種群野生華重樓表型變異豐富度

變異系數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)中又稱離散系數(shù)，是衡量離散程度的一個(gè)歸一化量度指標(biāo)，離散系數(shù)越大，則說明觀測對象的變異越大，則對應(yīng)的種群表型變異和多樣性越豐富。通過對野生華重樓各地理種源表型指標(biāo)的變異系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，所有指標(biāo)的變異系數(shù)幅度在6.83%～29.95%之間，平均變異系數(shù)為17.72%，變異系數(shù)的變化幅度較大，種群內(nèi)部的表型變異程度高，說明華重樓能夠通過種群內(nèi)部的遺傳變異，更好地適應(yīng)環(huán)境。

野生華重樓葉面積、花萼面積、株高、地徑、果球橫徑、果球縱徑、果球橫縱比和種子千粒質(zhì)量8個(gè)表型指標(biāo)的變異系數(shù)分別為27.72%、29.95%、29.89%、15.16%、12.57%、14.34%、10.19% 和6.83%，前3個(gè)指標(biāo)遠(yuǎn)大于平均變異系數(shù)，后5個(gè)指標(biāo)遠(yuǎn)小于平均變異系數(shù)，這些指標(biāo)的穩(wěn)定性排名依次為種子千粒質(zhì)量>果球橫縱比>果球橫徑>果球縱徑>地徑>葉面積>株高>花萼面積，說明野生華重樓種子的穩(wěn)定性最高，果球的穩(wěn)定性其次，莖的穩(wěn)定性排第3，葉片和花萼的穩(wěn)定性最差，這與多花黃精Polygonatumcyrtonema這方面性狀的研究結(jié)果[2]是類似的。

3.3 野生華重樓表型性狀的地理變異規(guī)律性

本研究發(fā)現(xiàn)，所選取的野生華重樓17個(gè)表型性狀指標(biāo)中，除葉片數(shù)、花萼片數(shù)和花梗長3個(gè)表型性狀指標(biāo)與所有地理氣象因子無顯著相關(guān)性外，其余性狀指標(biāo)均與部分地理氣象因子存在顯著或極顯著的相關(guān)性，這說明地理氣象因子對野生華重樓的種群表型影響較大。經(jīng)度的增加會(huì)抑制葉長、葉寬和葉面積的生長，緯度的增加會(huì)促進(jìn)葉片和果球的生長；海拔與野生華重樓的葉、莖營養(yǎng)生長呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，與果球和種子的生殖生長呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明海拔增加會(huì)促進(jìn)營養(yǎng)生長，抑制生殖生長；年均溫度、無霜期、年日照時(shí)長和年降雨量等環(huán)境因子均與絕大多數(shù)表型指標(biāo)存在顯著或極顯著相關(guān)性，說明其表型變異受多個(gè)環(huán)境因子的共同控制。

3.4 野生華重樓保護(hù)策略

華重樓是重樓藥材的法定基原，是許多知名中成藥不可或缺的主要組分材料，隨著制藥工業(yè)的不斷發(fā)展，人們對華重樓的需求越來越大。因華重樓人工栽培種植周期長、生境要求苛刻、種植技術(shù)難，人們?yōu)榱藵M足需求對其進(jìn)行掠奪性、毀滅性的采挖，導(dǎo)致野生資源枯竭，處于瀕危狀態(tài)。

因此，開展野生華重樓資源保護(hù)的研究是非常有必要的，筆者結(jié)合研究結(jié)果，提出以下保護(hù)策略：首先，建議將遺傳變異多樣性豐富的華重樓地理種群原生地?廣東清遠(yuǎn)設(shè)定為重點(diǎn)育種保護(hù)地；其次，嚴(yán)禁破壞野生華重樓的原生環(huán)境，為華重樓種群的恢復(fù)提供生境支撐；第三，及時(shí)開展華重樓人工繁育研究，爭取在短時(shí)間內(nèi)解決種苗繁育問題，為市場提供充足的人工種苗；最后，收集全分布區(qū)華重樓種質(zhì)資源，建立保存圃，做好基因資源的搶救性保存工作。