草地貪夜蛾自噬相關(guān)基因的鑒定

馬秋琴，王禹生，梁 寬，韓 勇，易輝玉，鄧小娟

(華南農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院/廣東省農(nóng)業(yè)動物功能基因組學與分子育種重點實驗室/廣東省蠶桑工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州，510642)

細胞自噬(Autophagy)是真核生物中普遍存在并高度保守的生理過程。自噬通過形成具有雙層膜的自噬體，將細胞中錯誤折疊的蛋白質(zhì)、受損的細胞器運送到溶酶體降解后進行循環(huán)利用[1]。越來越多的研究表明，自噬是一個正常的細胞所必須的，是細胞主動的、受調(diào)控的生理過程[2]。自噬相關(guān)基因 (Autophagy-related gene，Atg)所編碼的蛋白 (ATG)參與自噬體的形成和選擇性自噬的調(diào)控[3]。

自1997年第1個自噬相關(guān)基因Atg1從酵母中被克隆以來[4]，酵母中Atg5、Atg6和Atg13等自噬相關(guān)基因相繼被克隆[5]，后來Atg基因在果蠅Drosophilamelanogaster、線蟲Caenorhabditiselegans、小鼠Musmusculus、人類Homosapiens等物種均被鑒定到。到2019年為止，真核生物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和鑒定了42個Atg基因[3]，其中包括18個參與自噬體膜形成的核心Atg基因[6]。正常條件下，細胞會發(fā)生低水平的自噬，參與維持細胞內(nèi)環(huán)境的動態(tài)平衡；當受到饑餓、溫度變化、低氧等外界環(huán)境的刺激，細胞通過啟動一系列的級聯(lián)反應，觸發(fā)自噬相關(guān)基因的表達而激活自噬，從而幫助細胞度過不良環(huán)境[7]。細菌和病毒等病原物的感染也能引發(fā)宿主的自噬響應，研究表明自噬參與病原物的清除[8-9]，這種清除病原物的自噬作用被稱為異體自噬(Xenophagy)[7]。

作為一種入侵的鱗翅目害蟲，草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda已經(jīng)對我國玉米Zeamays、高粱Sorghumbicolor、甘蔗Saccharumofficinarum等農(nóng)作物的生產(chǎn)造成嚴重危害。草地貪夜蛾卵巢細胞系Sf9是傳統(tǒng)上用于桿狀病毒表達的細胞系，同時也是基礎(chǔ)研究的常用細胞系。苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒 (Autographacalifornicamultiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)是桿狀病毒的模式種，與Sf9細胞是一對研究病毒與宿主相互作用的模式代表，但鮮見AcMNPV與Sf9細胞在自噬應答方面相互作用的研究報道。本研究通過序列相似性和保守結(jié)構(gòu)域分析，鑒定草地貪夜蛾自噬的相關(guān)基因及其對AcMNPV感染的自噬應答，以期研究草地貪夜蛾的自噬調(diào)控機制，為尋找調(diào)控防治草地貪夜蛾的dsRNA藥物篩選靶點；另一方面，研究AcMNPV引起Sf9細胞的自噬應答及分子機制，以期為病毒殺蟲劑在農(nóng)業(yè)害蟲防治上的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

草地貪夜蛾Sf9細胞、重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac HTb-EGFP由華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院昆蟲分子生物學與生物技術(shù)實驗室保存。草地貪夜蛾Sf9細胞采用SFX昆蟲培養(yǎng)基添加10%(φ)胎牛血清(Gibco)于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

PrimeScript? RT reagent Kit (Perfect Real Time)和 PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser購自 Takara 公司；Hieff SYBR Green Master Mix購自上海Yeasen公司；Bac-to-Bac表達系統(tǒng)試劑盒購自Invitrogen公司；轉(zhuǎn)染試劑FuGENE HD Transfection Reagent購自 Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 草地貪夜蛾ATG序列的生物信息學分析 以斜紋夜蛾Spodopteralitura、人類Homosapiens、果蠅Drosophilamelanogaster和家蠶Bombyxmori等物種中已經(jīng)報道的ATG的氨基酸序列為基礎(chǔ)，利用在線blast工具(https://bipaa.genouest.org/sp/spodoptera_frugiperda_pub/blast//)獲得與草地貪夜蛾ATG相似性高的序列。通過NCBI保守結(jié)構(gòu)域在線工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)[10]對草地貪夜蛾候選ATG的保守結(jié)構(gòu)域進行預測。

1.2.2 EGFP-AcMNPV 重組病毒的制備 采用Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建帶有綠色熒光的AcMNPV重組病毒[11-12]。將重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTb-EGFP轉(zhuǎn)化含AcMNPV基因組的EscherichiacoliDH10Bac感受態(tài)細胞，經(jīng)抗性篩選和PCR鑒定獲得重組桿粒Bacmid-EGFP。當Sf9細胞培養(yǎng)生長至六孔板的40%～50%時(對數(shù)生長期)，將重組桿粒Bacmid-EGFP轉(zhuǎn)染Sf9細胞，轉(zhuǎn)染操作參考FuGENE HD Transfection Reagent說明書進行，轉(zhuǎn)染72 h之后收集的上清液即為P1病毒。

1.2.3 病毒滴度測定 采用 TCID50法[13]測定重組病毒EGFP-AcMNPV的滴度，具體操作方法如下：Sf9細胞在96孔板中培養(yǎng)至生長密度為80%～90%時，遺棄培養(yǎng)基，依次加入經(jīng)SFX 10倍系列稀釋(10?1～10?10)的重組病毒EGFP-AcMNPV稀釋液各 100 μL，每個稀釋度設 8 個重復；感染 72 h 后，使用倒置熒光顯微鏡進行觀察，記錄各稀釋度病毒感染的細胞培養(yǎng)孔中出現(xiàn)和未出現(xiàn)病毒的孔數(shù)，以大約50%感染“臨界值”的稀釋度計算TCID50。

1.2.4 病毒感染Sf9細胞 采用六孔板培養(yǎng)Sf9細胞，當細胞生長密度達到80%～90%時，加入重組病毒EGFP-AcMNPV，感染復數(shù)(MOI)為8。在感染6、12、24、36 和 48 h 后，收集 Sf9 細胞，并同時取正常培養(yǎng)的Sf9細胞作為對照。

1.2.5 qRT-PCR 檢測Atg基因的轉(zhuǎn)錄活性 收集Sf9細胞，采用Trizol法提取總RNA，經(jīng)NanoDrop One 微量分光光度計檢測，D260 nm/D280 nm為 1.8～2.0即合格，取1μg總RNA用于合成cDNA。

根據(jù)草地貪夜蛾Atg基因序列，利用Premier Primer 5.0設計熒光實時定量PCR引物，序列見表1。采用SYBR Green熒光定量PCR試劑盒，反應體系為 SYBR Green 混合液 (2×) 10 μL，引物 (10 μmol/L)各 0.2 μL，cDNA 0.1μL(相當于 10 ng 總 RNA)，加ddH2O至總體積20 μL。反應程序為：95 ℃預變性5 min; (95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s)循環(huán)40次；溶解曲線在65～95 ℃每隔0.5 ℃采集1次，每次采集 5 s，在 CFX 96 儀器 (Bio-Rad)上進行反應。以草地貪夜蛾Ecdysoneless(ECD)基因作為內(nèi)參基因[14]，采用 2???ct法[15]計算基因相對表達量，每個基因設置3個重復，進行3次生物學重復。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用 GraphPad Prism 5.0軟件t-檢驗方法對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

表 1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequence for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 草地貪夜蛾自噬相關(guān)蛋白的序列分析

根據(jù)已經(jīng)報道的昆蟲和哺乳動物等多個物種中的ATG序列，在草地貪夜蛾網(wǎng)站 (https://bipaa.genouest.org/sp/spodoptera_frugiperda_pub/blast/)進行同源序列的比對分析，獲得了10多個核心自噬相關(guān)基因，其中包括已經(jīng)報道的Atg8(NCBI登錄號MF069154.1)，和Atg3、Atg5、Atg6、Atg7、Atg10、Atg12、Atg13和Atg101基因序列的全長，以及Atg1、Atg2、Atg4、Atg9、Atg14、Atg16、Atg17和Atg18等基因的部分序列 (表 2)。利用 smart blast在線比對工具，比較獲得的草地貪夜蛾ATG蛋白和黑腹果蠅、人類ATG蛋白的氨基酸序列相似性，顯示草地貪夜蛾基因組中存在高度保守的ATG序列。從表2的比對結(jié)果可見，具有完整序列的ATG蛋白中，ATG8的保守性最高，草地貪夜蛾ATG8與黑腹果蠅ATG8、人類GABARAP的氨基酸序列相似性分別為93.10%和90.52%；ATG3的保守性也很高，與黑腹果蠅ATG8、人類GABARAP的氨基酸序列相似性分別為65.88%和64.40%；ATG5、ATG6、ATG12、ATG101與果蠅序列相似性在50%以上，暗示了草地貪夜蛾自噬相關(guān)蛋白具有參與自噬的保守功能。

表 2 草地貪夜蛾自噬相關(guān)蛋白的序列與相似性分析Table 2 Sequence and similarity analysis of Spodoptera frugiperda autophagy related proteins

2.2 草地貪夜蛾ATG的結(jié)構(gòu)域及功能分析

利用 NCBI CD(Conserved domain)在線搜索工具對所獲得的候選ATG蛋白序列進行保守結(jié)構(gòu)域分析，表明多數(shù)草地貪夜蛾ATG蛋白具有該蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域(圖1)，ATG1具有激酶活性，是自噬過程中的一個重要蛋白激酶；ATG4具有肽酶活性，可以切除ATG8的C端使甘氨酸(Gly)暴露出來；ATG8和ATG12具有類泛素的結(jié)構(gòu)，ATG8可結(jié)合脂分子磷脂酰乙醇胺(PE)，ATG12可與ATG5共價結(jié)合；而ATG16和ATG18具有WD40結(jié)構(gòu)域。根據(jù)草地貪夜蛾ATG蛋白在序列上與果蠅、人類ATG的高度相似性及這些蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，推測這些自噬相關(guān)蛋白具有參與自噬體形成及分子機制的調(diào)控功能，草地貪夜蛾中的自噬通路也是真核生物高度保守的(圖2)。這些ATG蛋白通過形成多個不同功能的復合物參與自噬的各個階段，包括負責自噬起始的ATG1/ULK復合物(包括 ATG1、ATG17/RB1CC1、ATG13 和 ATG101)、主要參與成核的Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(PI3KC3)復合物(由ATG6/Beclin1和ATG14等組成)、參與延伸和成熟的2個泛素樣蛋白系統(tǒng)：ATG5-ATG12系統(tǒng)和ATG8-PE系統(tǒng)。ATG8作為類泛素分子，羧基端被蛋白水解酶ATG4切割，暴露出的甘氨酸在E1-like酶ATG7、E2-like酶ATG3和具有E3連接酶活性的ATG12/ATG5/ATG16復合物的作用下結(jié)合PE，ATG8-PE定位于自噬體膜。此外，ATG9、ATG2和ATG18參與了膜延伸的過程。

圖 1 草地貪夜蛾候選自噬相關(guān)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預測Fig.1 Prediction of the conserved domains in the candidate autophagy-related proteins of Spodoptera frugiperda

圖 2 草地貪夜蛾自噬相關(guān)蛋白參與的自噬途徑Fig.2 The autophagy pathway involving autophagy related proteins in Spodoptera frugiperda

2.3 重組病毒載體EGFP-AcMNPV

將 pFast HTb-EGFP重組載體轉(zhuǎn)化至含AcMNPV基因組的大腸埃希菌Escherichiacoli感受態(tài)細胞DH10Bac中，經(jīng)過抗性篩選獲得的單菌落，通過M13引物進行PCR鑒定，獲得約3 000 bp的單一條帶，表明重組桿粒Bacmid-HTb-EGFP已成功構(gòu)建(圖3)。經(jīng)測序驗證后將重組桿粒轉(zhuǎn)染Sf9細胞，獲得P1代重組病毒EGFP-AcMNPV。以P3代重組病毒EGFP-AcMNPV感染Sf9細胞，在感染 6、12、24、36 和 48 h 后觀察 Sf9 細胞的綠色熒光強弱來判斷重組病毒的增殖情況，結(jié)果(圖4)表明：病毒感染6和12 h后沒有觀察到綠色熒光；24 h后可見少量的綠色熒光，表明子代病毒已經(jīng)復制和繁殖；在36和48 h后可見大量的綠色熒光，表明制備的重組病毒能夠有效感染Sf9細胞。

圖 3 重組桿粒Bacmid-EGFP的PCR鑒定Fig.3 PCR identification of recombinant Bacmid-EGFP

2.4 EGFP-AcMNPV感染Sf9細胞引起自噬相關(guān)基因的變化

收集EGFP-AcMNPV感染不同時間的Sf9細胞，抽提總RNA，去除基因組后進行反轉(zhuǎn)錄，通過qRT-PCR對自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進行分析，定量結(jié)果(圖5)顯示：多數(shù)自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平在病毒感染后表達上調(diào)，Atg2、Atg4和Atg7在感染6 h 后基因表達量顯著增加；Atg5、Atg6、Atg8和Atg12在病毒感染12 h后表達顯著上調(diào)；之后隨著病毒感染時間的延長，多數(shù)自噬相關(guān)基因(除Atg7)的表達持續(xù)下調(diào)。可能的原因是子代病毒的大量復制導致宿主細胞自噬相關(guān)基因的表達量減少，或是隨著感染時間的延長，自噬無法實現(xiàn)細胞“自救”而走向不可逆的死亡。

圖 4 EGFP-AcMNPV感染Sf9細胞不同時長后的熒光顯微鏡觀察結(jié)果Fig.4 Fluorescence microscopy of Sf9 cells at different time after infection with EGFP-AcMNPV

圖 5 AcMNPV對Sf9細胞對自噬相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.5 Effects of AcMNPV on transcriptional levels of autophagy-related genes in Sf9 cells

3 討論與結(jié)論

自噬是真核生物中保守的生理過程，早期認為自噬的主要作用是實現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)利用。近年來，隨著對自噬研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)自噬還參與細胞發(fā)育和分化、維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，也與腫瘤形成、神經(jīng)退行性疾病和免疫疾病有密切關(guān)系，自噬已成為國內(nèi)外研究的熱點。通過對酵母、線蟲、果蠅、小鼠和人類等多種模式生物的研究，發(fā)現(xiàn)盡管有些物種中存在特有的自噬相關(guān)基因，但多數(shù)自噬基因是高度保守的。通過相似性比對分析，本研究從草地貪夜蛾基因組數(shù)據(jù)庫中獲得了自噬相關(guān)基因及對應自噬相關(guān)蛋白的序列。在參與自噬體膜形成的18個核心自噬相關(guān)蛋白中，除ATG29和ATG31外，獲得了 ATG1～10、ATG12～14、ATG16～18 共16個草地貪夜蛾的ATG序列，其中ATG3、ATG5、ATG6、ATG7、ATG8、ATG10、ATG12 和 ATG13 的序列是完整的。候選自噬相關(guān)蛋白保守結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果表明，除ATG2外，其他自噬相關(guān)蛋白中均存在保守的結(jié)構(gòu)域，暗示了在草地貪夜蛾中ATG功能的保守性，并且自噬過程也是保守的，猜測同酵母、果蠅和哺乳動物相似，草地貪夜蛾中的自噬也經(jīng)過了起始、成核、延伸、成熟、融合和降解等基本過程，自噬相關(guān)蛋白參與了上述自噬體形成的各個過程和自噬過程中的分子調(diào)控。

Sf9細胞的自噬現(xiàn)象已有報道，饑餓條件和神經(jīng)毒劑類殺蟲劑高效氯氰菊酯都能誘導Sf9細胞發(fā)生自噬[16-17]。最新的研究表明具有殺蟲活性的姜黃素、β-咔啉類生物堿是通過阻斷信號通路PI3K/Akt/TOR誘導Sf9細胞發(fā)生自噬的[18-19]。為探討桿狀病毒模式代表AcMNPV與宿主Sf9細胞在自噬途徑中的相互關(guān)系，本研究檢測了AcMNPV病毒感染Sf9細胞后中Atg基因的表達水平，結(jié)果顯示在感染6～12 h后多數(shù)Atg基因的表達上調(diào)，暗示了AcMNPV的感染激活了Sf9細胞中的自噬應答。后續(xù)研究進一步通過Western blot和免疫熒光顯微鏡觀察等方法驗證了自噬的發(fā)生(結(jié)果未發(fā)表)。在果蠅中的研究結(jié)果顯示不同的病原菌，如李斯特菌Listeriamonocytogenes[8]、大腸埃希菌[20]、沃爾巴克氏體Wolbachia[21]和水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV)[22-23]的感染都能引發(fā)細胞自噬應答，但這些不同的病原菌激活自噬的分子機制不同[1]?？梢?，病原菌引發(fā)自噬響應的分子機制復雜，AcMNPV引發(fā)Sf9細胞自噬響應的分子機制還有待進一步研究。

利用草地貪夜蛾基因組序列，通過相似性比對分析鑒定自噬相關(guān)基因及編碼的蛋白質(zhì)序列，結(jié)合候選自噬相關(guān)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，我們推測了所鑒定的自噬相關(guān)蛋白在自噬中的功能。已有研究揭示：利用RNAi技術(shù)干擾棉鈴蟲Atg6、Atg8基因的表達引起產(chǎn)卵量和卵的孵化率降低[24-25]；干擾褐飛虱Atg1的表達，抑制自噬和糖原代謝，降低褐飛虱的生存率[26]。草地貪夜蛾自噬相關(guān)基因與自噬通路的研究可能為未來篩選新型的dsRNA藥物提供候選靶標。同時，本研究證實了自噬基因在AcMNPV感染的Sf9細胞中表達上調(diào)，暗示了病毒引發(fā)Sf9細胞的自噬應答，為進一步探究病毒引發(fā)草地貪夜蛾自噬響應的分子機制奠定了基礎(chǔ)，為探索草地貪夜蛾的生物防治提供了理論依據(jù)。

致謝：衷心感謝中山大學生命科學學院楊凱教授在制備重組病毒EGFP-AcMNPV過程中提供的支持與幫助！