水稻空間誘變與重離子誘變生物學(xué)效應(yīng)及突變體定向篩選

陳 淳，嚴(yán)賢誠，羅文龍，黃翠紅，周丹華，周利斌，李文建，王 慧，陳志強，郭 濤

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 國家植物航天育種工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州，510642；2 中國科學(xué)院 近代物理研究所，甘肅 蘭州，730000)

優(yōu)異種質(zhì)資源是提升水稻OryzasativaL.新品種選育效率的物質(zhì)基礎(chǔ)[1-2]。各種物理或化學(xué)誘變因素均可誘導(dǎo)生物產(chǎn)生遺傳物質(zhì)的改變，從而產(chǎn)生新的種質(zhì)資源?？臻g誘變技術(shù)和重離子誘變技術(shù)在誘發(fā)產(chǎn)生新的基因資源、創(chuàng)造優(yōu)異新種質(zhì)和培育作物新品種上已發(fā)揮重要作用[3-5]?？臻g誘變技術(shù)利用空間特殊環(huán)境誘發(fā)遺傳物質(zhì)變異?？臻g特殊環(huán)境具有強輻射、微重力、高真空、弱磁場等特點[6]，其中，輻射與生物體的變異關(guān)系最為密切，當(dāng)生物被宇宙高能粒子擊中，會產(chǎn)生各種DNA和染色體結(jié)構(gòu)的變化，并影響基因的表達(dá)[7-8]。重離子誘變技術(shù)通過注入的高能帶電粒子與生物體內(nèi)的分子或原子發(fā)生彈性、非彈性的碰撞，導(dǎo)致生物體內(nèi)的電離損傷，進(jìn)而使DNA損傷，染色體畸變。重離子束具有傳能線密度高和能量峰特點，所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)比傳統(tǒng)的X射線及γ射線要大[9]?，F(xiàn)有研究表明，空間環(huán)境與重離子輻射誘發(fā)的變異在細(xì)胞、基因及蛋白水平具有一定的相似性。史金銘[8]發(fā)現(xiàn)無論是空間飛行還是低劑量(2 Gy)重離子輻射都能夠引起水稻種子DNA甲基化的變化。Shi等[10]利用AFLP和MSAP方法檢測空間誘變及重離子誘變水稻基因組和表觀遺傳變異的結(jié)果表明，2種方法都能夠顯著地改變水稻基因組和表觀基因組，并且重離子誘變與空間誘變具有20%的相同變異位點。Wei等[11]比較空間誘變和C離子、Ne離子及Fe離子輻照的結(jié)果表明，空間環(huán)境和重離子誘變均可以影響根尖的有絲分裂，誘發(fā)各種染色體畸變，包括微核、染色體橋、染色體落后片段。王巍[12]比較重離子輻射與空間搭載后水稻的蛋白表達(dá)譜特征發(fā)現(xiàn)，2 mGy、62.2 keV/μm的12C離子輻射蛋白表達(dá)特征與空間環(huán)境的最為類似。上述結(jié)果對于理解空間誘變與重離子誘變效應(yīng)提供了有益參考，但有關(guān)2種誘變技術(shù)對于水稻的生物學(xué)效應(yīng)及后代變異頻率的比較研究鮮見報道。

本研究對水稻純系品種‘華航31號’干種子進(jìn)行空間誘變和重離子誘變處理，并對誘變一代進(jìn)行了表型及細(xì)胞學(xué)誘變效應(yīng)的分析；對誘變二代直鏈淀粉含量及粒型性狀進(jìn)行了表型和基因型的定向篩選，獲得系列候選突變體；比較了2種誘變處理的性狀變異頻率。為水稻誘變育種以及誘變后代的高效篩選提供理論參考和實踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

‘華航31號’是華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家植物航天育種工程技術(shù)研究中心育成的感溫型水稻純系品種，已通過廣東省農(nóng)作物品種審定，農(nóng)藝性狀穩(wěn)定。

1.2 方法

1.2.1 誘變處理 水稻干種子分成 3 份：一份經(jīng)“實踐十號”返回式科學(xué)實驗衛(wèi)星搭載(2016年4月6日發(fā)射)，在軌時間 12 d，軌道高度 200～500 km；另一份送往中國科學(xué)院蘭州近代物理研究所，利用重離子研究裝置HIRFL提供的12C6+束流進(jìn)行干種子輻照處理，重離子能量80.55 MeV/u，輻照劑量率為 20 Gy/min，輻照劑量分別為 5、10、20、40、80 和160 Gy；剩下的作為對照，不進(jìn)行誘變處理。誘變后的種子為誘變一代(M1)，種植于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)科研基地水稻育種試驗田，播種前種植田塊需翻地浸泡2個月，以避免前茬落粒谷的影響；M1單株主穗收獲得誘變二代(M2)種子，種植于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)增城教學(xué)科研基地。2017年3月8日播種M1，尼龍薄膜育秧，秧齡22 d左右；2017年7月20日播種M2，秧齡13 d左右。長勢良好的秧苗移栽至大田，大田為完整田塊，肥力均勻；秧苗單株插植，行株距 20 cm×20 cm；上半年每 667 m2施尿素 20 kg，下半年每 667 m2施尿素 21 kg；分蘗期、抽穗期、齊穗期每 667 m2用 16%(φ)紋病清 40 g+20%(φ)三環(huán)唑 100 g+18%(φ)殺蟲雙 300 g+20%(φ)稻虱凈 20 g兌水100 kg，噴霧防治稻縱卷葉螟、三化螟、紋枯病、稻瘟病、白葉枯病等病蟲害。

1.2.2 種子活力測定 取種子發(fā)芽盒 (12 cm×12 cm×6 cm)，墊入2張吸水紙，加入ddH2O充分浸濕。各處理取100粒種子均勻放入發(fā)芽盒，30 ℃恒溫培養(yǎng)，每個處理3次重復(fù)。每天調(diào)查發(fā)芽種子數(shù)量，第3天調(diào)查發(fā)芽勢，第7天調(diào)查發(fā)芽終期的發(fā)芽率，第8天測定芽長。計算各處理種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)，估算空間誘變及重離子誘變對‘華航31號’的生理損傷效應(yīng)[13]。

1.2.3 根尖染色體觀察 參考劉向東等[14]的壓片法制作水稻根尖臨時標(biāo)本，進(jìn)行染色體觀察。取發(fā)芽后的水稻根尖(約0.5 cm)經(jīng)固定、解離、染色、壓片后，400倍顯微鏡觀察有絲分裂情況，再用1 000倍顯微鏡觀察有絲分裂染色體異常情況。將誘變種子分為2次重復(fù)進(jìn)行發(fā)芽并切取根尖，每個劑量隨機觀察20～30個水稻根尖，每個根尖觀察300～400個細(xì)胞。

1.2.4 農(nóng)藝性狀及直鏈淀粉含量測定 調(diào)查M1代處理及對照各30株，調(diào)查性狀包括株高、劍葉長、劍葉寬、穗質(zhì)量、穗長、有效穗數(shù)、結(jié)實率、谷粒長、谷粒寬、長寬比、千粒質(zhì)量?？臻g誘變和重離子誘變M2各種植約20 000株，成熟期調(diào)查所有植株的粒長、粒寬，篩選粒型突變體。計算對照的平均值()及標(biāo)準(zhǔn)差(s)，求出±3s的數(shù)值范圍，將性狀數(shù)值在此范圍之外的M2個體作為突變株。

將空間誘變及重離子誘變M2群體和對照分別進(jìn)行單株收獲后脫粒，利用礱谷機(大竹FC2K)碾磨成糙米。采用基于波通DA7200型近紅外分析儀的糙米直鏈淀粉含量(AC值)檢測模型進(jìn)行檢測。用于直鏈淀粉含量檢測的模型有3個(M5、M6和M32)，將3個模型檢測出來的AC值的平均值作為該樣品的最終AC值。計算對照的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，求出±3s的數(shù)值范圍，將性狀數(shù)值在此范圍之外的M2個體作為突變株。

1.2.5Wx基因型突變檢測 采用磁珠法提取水稻基因組DNA[15]。將Wxa和Wxb擴增產(chǎn)物分別按1∶1、3∶1、5∶1、7∶1、9∶1、11∶1 的比例混合構(gòu)成 6 個不同倍率的DNA混合池用于HRM檢測(引物見表1)，確定最適的DNA混合池倍率?！A航31號’誘變M2代單株DNA按4株混合提取DNA，采用微孔板分光光度計(EPOCH2T)測定DNA 質(zhì)量濃度并調(diào)至 50 ng/μL。

表 1 用于HRM檢測的特異引物信息Table 1 Specific primer information for HRM detection

根據(jù)GRAMENE(http://www.gramene.org/)公布的Wx基因序列，在其第4、9、10外顯子區(qū)域以及Wxa和Wxb差異位點設(shè)計巢式PCR引物，引物采用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計，由上海生工生物工程有限公司合成，采用梯度PCR確定適合的退火溫度。巢式PCR第1輪擴增與常規(guī)PCR擴增相同，擴增結(jié)束后加入200 μL ddH2O稀釋；第2輪擴增反應(yīng)體系含 2×TaqPlus Master Mix 4.0 μL、10.0 μmol/L 引物 0.3 μL、模板 DNA1.0 μL 和Evagreen 飽和熒光染料 0.3 μL，加 ddH2O 至 10 μL，添加15 μL礦物油防止產(chǎn)物揮發(fā)。PCR反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性 3 min；95 ℃ 變性 30 s，25 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，15 個循環(huán)；72 ℃ 延伸 5 min。擴增結(jié)束后，95 ℃ 變性 30 s、25 ℃ 退火 1 min，形成異源雙鏈分子。第2輪PCR擴增產(chǎn)物離心轉(zhuǎn)移至HRM檢測板中。使用LightScanner96進(jìn)行HRM檢測，溶解程序根據(jù)目的片段GC含量確定，低(高)GC含量的目的片段溶解程序起始溫度66 (75) ℃、結(jié)束溫度96 ℃、保持溫度62 ℃，曝光值為180。檢測結(jié)束后用自帶軟件的Scanning選項進(jìn)行差異分析。

將篩選得到的疑似突變混合池對應(yīng)單株進(jìn)行DNA提取并統(tǒng)一稀釋至50 ng/μL，將單株DNA與對照DNA按1∶1混合后進(jìn)行巢式PCR擴增，擴增產(chǎn)物進(jìn)行HRM檢測，檢測方法同上。將篩選得到的疑似突變單株進(jìn)行特異性引物擴增，其引物為用于HRM檢測的巢式PCR引物的外引物。PCR反應(yīng)體系含 2×TaqPlus Master Mix 25.0 μL、10.0 μmol/L 引物 2.0 μL、模板 DNA 2.0 μL，加ddH2O 至 50 μL。PCR 反應(yīng)：95 ℃ 預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 30 s，25 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 延伸 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 20 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶明顯且單一后，送至賽默飛世爾科技(中國)有限公司進(jìn)行測序，序列比對軟件為CLC Sequence Viewer 7.7。

2 結(jié)果與分析

2.1 空間誘變和重離子誘變處理水稻種子M1代生物學(xué)效應(yīng)

2.1.1 M1代種子活力和農(nóng)藝性狀 M1代種子發(fā)芽試驗結(jié)果(表2)表明，空間誘變和重離子誘變均對種子的活力產(chǎn)生了不同程度的影響。與對照相比，重離子輻照后發(fā)芽勢、發(fā)芽率、芽長、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均呈下降趨勢，其中，活力指數(shù)相對效應(yīng)為?25.22% ～ ?9.01%，表明重離子輻照對種子活力表現(xiàn)為較明顯的抑制作用?？臻g誘變提升了種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，但芽長比對照降低了16.53%，導(dǎo)致活力指數(shù)比對照降低14.62%。此外，不同劑量重離子輻照后，發(fā)芽勢、芽長、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均表現(xiàn)出馬鞍型劑量效應(yīng)曲線(圖1)，即在中低劑量(小于20 Gy)下，損傷效應(yīng)隨著劑量的增加而增加，但輻照劑量增加到一定程度后損傷效應(yīng)反而減少，表明水稻種子對于重離子的輻照具有閾值效應(yīng)。空間誘變效應(yīng)與低劑量(小于10 Gy)重離子誘變效應(yīng)相似，但也存在一定差異，主要表現(xiàn)為空間誘變顯著降低了種子芽長。

表 2 空間誘變及重離子誘變對種子活力的影響1)Table 2 Effects of space mutation and heavy ion mutation on seed vigor

圖 1 不同劑量重離子輻射的種子發(fā)芽勢和芽長Fig.1 The germination potential and bud length of rice seeds treated by different doses of heavy ion radiation

觀察空間誘變與重離子誘變水稻種子M1代植株的田間表現(xiàn)，并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的分離現(xiàn)象?？疾旄髡T變處理當(dāng)代植株的主要農(nóng)藝性狀，結(jié)果見表3。由表3可見，空間誘變處理的水稻種子M1代穗長和每穗粒數(shù)與對照有極顯著差異(P<0.01)，其他農(nóng)藝性狀與對照差異不顯著；重離子誘變處理的水稻種子M1代穗長和每穗粒數(shù)顯著低于對照，其中，每穗粒數(shù)與對照差異極顯著，表明重離子誘變導(dǎo)致的生物學(xué)損傷從種子的發(fā)芽期延續(xù)到成熟期。

表 3 空間誘變和重離子誘變的水稻種子M1代植株主要農(nóng)藝性狀 1)Table 3 The main agronomic characters of contemporary plants of rice seeds treated by space mutation and heavy ion mutation

2.1.2 M1代水稻植株根尖細(xì)胞染色體有絲分裂 有絲分裂指數(shù)反映了細(xì)胞的活躍程度，微核及畸變?nèi)旧w均體現(xiàn)了染色體的嚴(yán)重?fù)p傷，表4為有絲分裂指數(shù)、微核千分率及染色體畸變率的統(tǒng)計結(jié)果。由表4可見，空間誘變和重離子輻射均誘發(fā)了水稻根尖細(xì)胞有絲分裂的異常，隨著重離子輻射劑量的增加，水稻有絲分裂指數(shù)逐漸降低，而微核千分率及染色體畸變率逐漸增加，160 Gy處理的染色體畸變率是5 Gy處理的2.5倍。空間誘變導(dǎo)致有絲分裂指數(shù)降低、微核千分率及染色體畸變率增加，變異效應(yīng)與中低劑量(5 Gy)重離子輻射相似。空間誘變或重離子誘變處理后，觀察到單橋、雙橋、斷片、落后染色體或不均等分裂等不同畸變?nèi)旧w類型，其中，斷片是最常見的類型(圖2)。

表 4 空間誘變和重離子誘變對水稻M1代植株根尖細(xì)胞的影響1)Table 4 Effects of space mutation and heavy ion mutation on root tip cells of contemporary rice plants

圖 2 誘變處理后水稻M1代植株根尖細(xì)胞有絲分裂染色體異常Fig.2 Chromosomal abnormality of apical mitosis of root tip cells of contemporary rice plants after mutagenic treatment

2.2 空間誘變及重離子誘變處理M2代突變體篩選

2.2.1 M2代粒型突變體 為篩選不同類型的粒型突變體，對‘華航31號’空間誘變及重離子(80 Gy劑量處理)誘變M2代單株籽粒的粒長、粒寬進(jìn)行了測量，共測量14 754份材料，其中，空間誘變處理5 991 份、重離子誘變處理 8 733 份、對照 30 份。對各粒型性狀的統(tǒng)計分析結(jié)果如表5所示。從表5可以看出，空間誘變及重離子M2代的粒長、粒寬以及粒長寬比的平均值與對照差異不顯著，但粒長的變異系數(shù)高于對照；M2代各粒型性狀的變異幅度均明顯大于對照，表明2種誘變處理的M2代均存在粒型差異明顯的單株類型。參照±3s范圍，確定了粒長<9.376 4 或>9.993 6，粒寬<2.250 0 或>2.450 0，粒長寬比<3.901 7 或>4.342 4 為突變體篩選標(biāo)準(zhǔn)。

表 5 空間誘變及重離子誘變水稻M2代粒型變異Table 5 Grain type variation in the second generation of rice seeds treated by space mutation and heavy ion mutation

依據(jù)突變體篩選標(biāo)準(zhǔn)，空間誘變處理5 991份材料共篩選到248份突變材料，其中，粒長變長的80份、變短的140份，粒寬變寬的20份、變窄的8份，粒長寬比變大的4份、變小的36份；80 Gy重離子誘變處理8 733份材料共篩選到426份突變材料，其中，粒長變長的192份、變短的99份，粒寬變寬的51份、變窄的81份，粒長寬比變大的117份、變小的72份?？臻g誘變及重離子誘變的粒型變異頻率分別為4.14%和4.88%；空間誘變處理的突變材料中具有2個及以上性狀變異的占17.74%，而重離子誘變處理的占16.25%?？梢姡臻g誘變粒型突變材料多為粒長變短、粒寬變寬、粒長寬比變小，而重離子誘變的粒型突變材料的粒長多為變長、粒寬變窄、粒長寬比變大；空間誘變與80 Gy重離子輻射對于粒型的誘變頻率相近，但2種方法誘發(fā)變異的趨勢不一致。

2.2.2 M2代直鏈淀粉含量突變體 對空間誘變及80 Gy重離子誘變M2代共7 549份材料的糙米采用近紅外光譜技術(shù)測定直鏈淀粉含量，其中，空間誘變處理3 674份、重離子誘變處理3 875份。表6的結(jié)果表明，空間誘變及重離子誘變M2代的直鏈淀粉含量的平均值與對照差異不顯著，但變異系數(shù)及變異幅度均明顯大于對照，表明2種誘變處理后代存在較大變異。按照±3s的突變體篩選標(biāo)準(zhǔn)，在空間誘變及重離子誘變M2代中分別篩選到59和60份突變材料，變異頻率分別為1.61%和1.55%?？臻g誘變后代高直鏈淀粉含量突變體有39份，為低直鏈淀粉含量突變體(20份)的1.95倍；重離子誘變后代高直鏈淀粉含量突變體有29份，與低直鏈淀粉含量突變體(30份)數(shù)量相近；表明‘華航31號’更容易產(chǎn)生高直鏈淀粉含量的突變。

表 6 空間誘變和重離子誘變水稻M2代直鏈淀粉含量變異Table 6 Variation of amylose content in the second generation of rice seeds treated by space mutation and heavy ion mutation

圖 3 不同比例DNA混合池Wx基因的HRM檢測結(jié)果Fig.3 HRM detection result of DNA mixed pool with different proportion

2.2.3 M2代Wx基因突變體定向篩選結(jié)果 將Wxa和Wxb擴增產(chǎn)物按 1∶1、3∶1、5∶1、7∶1、9∶1、11∶1 的比例混合構(gòu)建不同倍率DNA混合池用于HRM檢測分析，結(jié)果如圖3所示。在差異曲線中，將|ΔF|>0.05看作是差異顯著，表明存在疑似突變[16]。綜合各比例DNA混合池的檢測結(jié)果，混合池比例在9∶1(10倍池)時差異曲線的|ΔF|都在 0.05以上?？紤]到實際檢測中可能存在雜合體的情況，為保證突變檢測的靈敏度，最終選用4倍池作為群體檢測的倍率。另外，檢測單株時需保證樣品的雜合型，因此需將單株DNA與對照1∶1混合構(gòu)建2倍池進(jìn)行檢測。

4 736份水稻空間誘變M2代單株構(gòu)建1 184個4倍DNA混合池，4 848份水稻重離子誘變M2代單株構(gòu)建1 212個4倍DNA混合池。每個PCR96孔板放置93個DNA混合池和3個對照DNA，并統(tǒng)一稀釋質(zhì)量濃度至50 ng/μL后進(jìn)行高分辨率溶解曲線 (High resolution melting curve，HRM)檢測分析。圖4所示的是其中一個96孔板DNA混合池的4對巢式PCR引物擴增產(chǎn)物的HRM檢測結(jié)果。圖4可以看出，在Wxab-O和Wxab-I引物擴增產(chǎn)物、EX9-O和EX9-I引物擴增產(chǎn)物以及EX10-O和EX10-I引物擴增產(chǎn)物的檢測中分別有2、4和1個|ΔF|>0.05的紅色差異曲線，視為疑似突變池(圖 4a、4c、4d)。EX4-O 和 EX4-I引物擴增產(chǎn)物并無檢測到差異曲線(圖4b)。空間誘變共篩選到9個疑似突變池，其中Wxa與Wxb差異位點檢測區(qū)域3個、exon 4 檢測區(qū)域 3個、exon 9檢測區(qū)域 2個、exon 10檢測區(qū)域1個；重離子誘變共篩選到14個疑似突變池，其中Wxa與Wxb差異位點檢測區(qū)域5個、exon 4 檢測區(qū)域 3個、exon 9檢測區(qū)域 2個、exon 10檢測區(qū)域4個。

將23個突變池對應(yīng)的92個單株以及對照分別提取DNA，利用巢式PCR的外引物進(jìn)行擴增，回收PCR片段進(jìn)行測序?？臻g誘變后代共鑒定到3個Wx基因突變體，全部位于Wxa與Wxb差異位點，均為Wxa型；重離子誘變后代共鑒定到4個Wx基因突變體，其中，Wxa與Wxb差異位點檢測區(qū)域2個、exon 10檢測區(qū)域2個。圖5是重離子誘變exon 10突變體的測序結(jié)果。測序顯示該突變單株在第10外顯子的第115位點產(chǎn)生了CT的轉(zhuǎn)換(圖5a)，密碼子由CCU變成UCU，為錯義突變。該突變導(dǎo)致編碼脯氨酸變成編碼絲氨酸(圖5b)，推測其會對Wx基因的功能產(chǎn)生一定的影響。分析該突變單株的Sanger測序峰圖，發(fā)現(xiàn)該突變體為雜合突變 (圖 5c、5d)。

圖 4 DNA混合池的4對巢式PCR引物擴增產(chǎn)物的HRM檢測結(jié)果Fig.4 HRM detections of four pairs of nested PCR primer amplification products in DNA mixing cell

圖 5 重離子誘變exon 10突變體序列分析結(jié)果Fig.5 The results of sequence analysis of exon 10 mutant induced by heavy ion

3 討論與結(jié)論

3.1 空間誘變及重離子誘變對水稻的誘變效應(yīng)

誘變育種的誘變M1代往往以生理損傷為主，在誘變M2代時才開始發(fā)生大量的性狀分離，出現(xiàn)各種變異性狀?？臻g誘變M1代生理損傷低，在生物學(xué)效應(yīng)、突變頻率和突變方向等方面呈現(xiàn)出與地面其他傳統(tǒng)誘變方式不同的性狀變異特點[5]。馬良勇等[17]比較了不同的航天搭載對10份秈稻材料的誘變效果，研究表明各航天器搭載材料的誘變M1代發(fā)芽率與成苗率相較對照都有所降低，其中“神州4號”搭載材料最低。誘變M2代出現(xiàn)株高、生育期及其他類型的變異，其中“實踐8號”搭載材料的變異頻率介于0.24%～7.23%，5個材料的平均變異頻率為3.38%；返回式衛(wèi)星搭載材料的變異頻率介于1.06%～1.37%，平均為1.24%；而“神州4號”搭載材料的變異頻率為2.79%?？梢姴煌目臻g搭載以及不同的材料，其誘變效應(yīng)具有明顯差異，劉永柱等[18]和俞法明等[19]的研究也證實了這一點。此外，空間誘變M2代大部分性狀變異還表現(xiàn)出一定的傾向性。嚴(yán)文潮等[13]和黃永相等[20]發(fā)現(xiàn)空間處理后水稻株高、抽穗期、粒型、直鏈淀粉含量等突變的方向、頻率與基因型有關(guān)，突變具有一定的傾向性。

重離子輻射具有生物學(xué)效應(yīng)高的特點，在誘變育種中具有重要價值。Xu等[21]利用2種不同劑量的重離子輻照3個品種水稻種子，發(fā)現(xiàn)在低劑量下種子發(fā)芽率、存活率(除‘日本晴’)、秧苗高度都沒有顯著變化，中劑量下種子發(fā)芽率和存活率影響顯著，低劑量突變率4.71%、中劑量突變率5.22%。盧明[22]研究表明14C離子和7Li離子輻照的水稻種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率均低于對照，且隨著劑量的增加先增加后降低，發(fā)芽勢、發(fā)芽率與劑量之間呈明顯的“馬鞍型”劑量效應(yīng)曲線。Wei等[11]比較空間誘變和C離子、Ne離子及Fe離子輻照，發(fā)現(xiàn)空間誘變導(dǎo)致的有絲分裂指數(shù)和染色體畸變率最高。梅曼彤等[23]研究表明，高LET的重離子能更有效地抑制水稻種子萌發(fā)、幼苗生長，誘導(dǎo)根尖細(xì)胞和花粉母細(xì)胞的染色體畸變，降低當(dāng)代植株的結(jié)實率并誘發(fā)后代出現(xiàn)形態(tài)性狀及農(nóng)藝性狀的變異；程維民等[24]和楊瑰麗等[25]的研究也證實了這一點。本研究發(fā)現(xiàn)，重離子輻射水稻種子后M1代的發(fā)芽勢、芽長、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)均隨著劑量的增加呈先下降后上升而后再下降的“馬鞍”型曲線，與前人的研究[23-25]一致；當(dāng)輻照劑量為80和160 Gy時，M1代植株結(jié)實率顯著低于對照，而5～40 Gy輻照劑量下結(jié)實率與對照沒有顯著差異，表明重離子誘變對結(jié)實率的影響存在劑量閾值。在細(xì)胞學(xué)方面，本研究發(fā)現(xiàn)重離子誘變對水稻根尖分生組織細(xì)胞有絲分裂產(chǎn)生影響，隨著劑量的增加，水稻根尖有絲分裂指數(shù)降低，染色體的畸變率增加；細(xì)胞染色體畸變有染色體斷片、染色體橋、染色體落后、染色體不均等分裂等異常，且伴有微核的產(chǎn)生，這與前人的結(jié)果[26]是一致的。

本研究對空間誘變及重離子誘變M1代的種子活力、主要農(nóng)藝性狀以及誘變M2代的主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行了調(diào)查。結(jié)果表明，空間誘變對誘變M1代的影響，以輕微的生理損傷為主；重離子誘變的生理損傷要明顯高于空間誘變，重離子誘變M1代的生理損傷為37.74%，而空間誘變M1代的生理損傷為6.55%。2種誘變處理產(chǎn)生的性狀變異及變異頻率存在差異。對9 665株空間誘變M2代的粒型、直鏈淀粉含量進(jìn)行表型和基因型突變篩選，共發(fā)現(xiàn)各種類型突變體310份，突變頻率為3.21%；對12 608株重離子(80 Gy)誘變M2代單株進(jìn)行了同樣性狀篩選，共發(fā)現(xiàn)各種類型突變體490份，突變頻率3.89%。在變異的方向上，空間誘變粒型突變材料多以粒長變短、粒寬變寬、粒長寬比變小、直鏈淀粉含量升高為主；重離子誘變多以粒長變長、粒寬變窄、粒長寬比變大為主，直鏈淀粉含量變異無規(guī)律。綜合而言，空間誘變的生理損傷類似于低劑量重離子輻射，變異頻率與高劑量重離子輻射相近。易繼財?shù)萚27]對返回式衛(wèi)星誘導(dǎo)水稻突變的研究表明，空間誘變的輻射劑量約為3 mGy，相比較地面重離子輻射而言是比較低的輻射劑量。雖然空間誘變與重離子輻射誘變的方式不一樣，但本研究發(fā)現(xiàn)空間誘變誘發(fā)表型變異頻率與80 Gy重離子輻射相近，這表明低劑量輻射也可以誘發(fā)變異，駱?biāo)嚨萚28]報道低劑量空間重離子輻射可以誘發(fā)水稻產(chǎn)生遺傳變異，與本研究結(jié)果一致。此外，低劑量空間輻射誘變的變異機制也可能與高真空、微重力的空間復(fù)雜環(huán)境協(xié)作效應(yīng)有關(guān)。

3.2 誘變后代的定向選擇方法比較

對于誘變育種，如何高效、精確地篩選符合要求的突變體是育種工作者關(guān)注的重點。目前，育種工作者多是從誘變后代中篩選表型明顯變異的、符合育種目標(biāo)的突變單株，但局限于肉眼或簡單測量可以獲得的表型，對于一些需要大量分析的性狀(如化學(xué)物質(zhì)含量)則難以鑒定。與傳統(tǒng)誘變育種的表型篩選相比，分子標(biāo)記能夠有針對性地對目的基因進(jìn)行突變篩選，排除了環(huán)境的干擾，目的性更強。將表型選擇與基因型選擇有機結(jié)合，是提高誘變后代篩選效率的有效途徑。

本研究利用高通量掃描系統(tǒng)獲取粒型信息、利用近紅外無損分析獲得直鏈淀粉含量變異信息，提升了表型檢測效率；將HRM引入到基因型鑒定，為誘變后代基因型的定向篩選提供了有益參考。HRM技術(shù)是通過檢測與飽和熒光染料結(jié)合的DNA雙鏈在解鏈過程中的熒光強度變化趨勢進(jìn)而繪制成溶解曲線，并通過分析曲線的差異實現(xiàn)對DNA雙鏈差異的檢測和分類[28]，目前已普遍應(yīng)用于基因分型、突變篩選和DNA甲基化研究等方面[29]。該技術(shù)具有高通量、高分辨率、靈敏度和特異性高的特點；操作簡單，成本低，無須酶切系統(tǒng)，只需要在PCR過程中加入熒光染料即可檢測；閉管操作，產(chǎn)物無污染，可用于后續(xù)試驗等諸多優(yōu)點。本研究針對HRM檢測方法的要求，對直鏈淀粉含量Wx基因設(shè)計了多個目的位點，利用DNA混合樣品、巢式PCR及突變測序提高鑒定的效率和準(zhǔn)確性。Bush等[15]提出的ITILLING是對傳統(tǒng)的TILLING的方法進(jìn)行改進(jìn)和簡化，利用來自Bio-Rad實驗室的 CFX96 PCR 檢測系統(tǒng)，分辨率比 Light Scanner系統(tǒng)低，檢測的目的片段大小為95～125 bp。本研究利用的Light Scanner系統(tǒng)與之相比更靈敏，檢測的目的片段更大，提高了檢測效率。

本研究利用HRM技術(shù)在空間誘變及重離子誘變后代中共鑒定出7個Wx基因突變體。其中，篩選到的一個突變單株在Wx基因的第10外顯子的第115位點產(chǎn)生了C/T的錯義突變，密碼子由CCU變成UCU，由編碼脯氨酸變成了編碼絲氨酸，說明HRM技術(shù)可以應(yīng)用于突變篩選。

3.3 空間誘變與重離子誘變的分子突變頻率分析

突變密度的大小決定著突變獲得的難易程度，突變密度與誘變材料、誘變手段以及檢測手段密切相關(guān)[30]。表型變異的鑒別容易受到篩選規(guī)模和環(huán)境的影響，基因組層面的篩選可以更準(zhǔn)確地反映突變率。全基因組測序是分析輻射誘發(fā)變異的理想手段，但受限于測序樣本的數(shù)量和成本，難以大規(guī)模進(jìn)行突變調(diào)查。利用TILLING技術(shù)對目的DNA片段進(jìn)行誘變?nèi)后w的大量調(diào)查，進(jìn)而分析分子突變頻率是一個可行的解決辦法。Landau等[31]利用X射線和NaN3組合誘變二倍體大麥，利用TILLING篩選33個質(zhì)體基因，至少發(fā)現(xiàn)61個獨立突變，突變密度約 1/211.6 kb(即每 211.6 kb 有 1 個突變)。Botticella等[32]利用EMS誘變六倍體小麥，利用TILLING技術(shù)結(jié)合HRM檢測手段篩選出3個編碼淀粉分支酶的同源等位基因，突變密度為1/40 kb。Kim等[33]分別用NaN3、EMS和MNU組合誘變水稻，經(jīng)過測序檢測控制植酸6個基因家族的基因，獲得293個突變，突變密度為1/277 kb。王彩芬等[34]利用TILLING技術(shù)篩選水稻耐鹽基因SKC1突變體，共獲得4個突變，突變密度為1/526.3 kb。Hwang等[35]分別用200和300 Gy的γ射線誘變水稻，利用TILLING篩選9個跨膜轉(zhuǎn)運基因，共鑒定出41個突變，突變密度為1/744.6 kb。上述結(jié)果表明，通過掃描特定DNA片段并分析序列變異，可以計算分子突變頻率。

本研究利用HRM技術(shù)掃描了水稻直鏈淀粉Wx基因的4個位點共673 bp序列，空間誘變4 736份樣本中發(fā)現(xiàn)3個SNP變異，突變密度為1/1 063.83 kb；重離子誘變4 848份樣本中發(fā)現(xiàn)4個SNP變異，突變密度為1/815.68 kb。本研究中，空間誘變和重離子誘變的分子突變頻率與Hwang等[35]的結(jié)果類似，但顯著低于已報道的化學(xué)誘變或化學(xué)物理組合誘變的分子突變頻率。這可能與本研究中HRM檢測特性有關(guān)，HRM可有效檢測SNP變異，但對小片段DNA插入或缺失突變的檢測效率不高。重離子輻射可以誘發(fā)SNP和插入缺失突變[35-36]，本研究中可能對于插入缺失突變的檢測效率較低，導(dǎo)致檢測到的分子突變頻率偏低；與重離子輻射不同的是，化學(xué)誘變劑誘發(fā)以SNP為主的序列變異，在TILLING檢測中更容易被鑒定，導(dǎo)致分子突變頻率較高。本研究下一步擬利用混合樣品靶向測序技術(shù)開展基因組突變檢測，以便準(zhǔn)確地比較不同誘變方式的分子突變頻率。

3.4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)空間誘變與重離子輻射對于水稻誘變M1代具有一定的抑制效應(yīng)，并且空間誘變與低劑量重離子輻射的生物學(xué)效應(yīng)相近。空間誘變M2代的突變頻率為3.21%，80 Gy重離子輻射誘變M2代的突變頻率為3.89%。在變異的方向上，空間誘變突變多以粒長變短、粒寬變寬、粒長寬比變小、直鏈淀粉含量升高為主；重離子誘變以粒長變長、粒寬變窄、粒長寬比變大為主，而直鏈淀粉含量變異無明顯規(guī)律。可見，空間誘變的生理損傷類似于低劑量重離子輻射，而誘發(fā)變異的頻率與高劑量重離子輻射相近。