恩諾沙星納米乳的制備及噴霧給藥的藥效學評價

許 穎，邱陽陽，沈 悅，馮慧心，馮云云，黃顯會

(華南農業(yè)大學 獸醫(yī)學院，廣東 廣州 510642)

大腸埃希菌Escherichiacoli常會引起禽類典型的繼發(fā)性局部或全身性感染，雞吸入污染有大腸埃希菌的灰塵和氨氣可使上呼吸道纖毛失去運動能力，從而使吸入的大腸埃希菌易于定植并導致呼吸道感染，普遍認為，大腸埃希菌病是養(yǎng)禽業(yè)最廣泛存在的感染性細菌病，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的經濟損失[1]。對于雞群體給藥，臨床一般采用飲水給藥的方式，但飲水給藥對藥物溶解度的要求較高，易受水質影響，此外，還需考慮藥物在水溶液中的穩(wěn)定性、飲水設備、管線的設計、清潔和保養(yǎng)等，以保證藥物的有效性和安全性。隨著雞呼吸道疫苗噴霧免疫的逐漸推廣與使用，近年來，噴霧給藥系統(tǒng)的研究也越來越活躍。噴霧劑是一種藥物經特殊的給藥裝置給藥后進入呼吸道深部、腔道黏膜或皮膚發(fā)揮全身或局部作用的一種給藥系統(tǒng)，對肺部給藥具有重要意義[2]。開展噴霧給藥新技術研究，通過吸入方式給藥，藥物可直接黏附于呼吸道黏膜作用靶部位，時間短，見效快，適用于群防群治。而禽飼養(yǎng)過程中，緊閉和較小的飼養(yǎng)環(huán)境，也為噴霧劑的使用提供了條件[3]。

恩諾沙星(Enrofloxacin, ENR)是動物專用的第3 代喹諾酮類抗菌藥物，抗菌譜廣，對多種革蘭陽性菌和某些革蘭陰性菌均有效，對銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa和支原體Mycoplasma也具有一定的抗菌活性[4-6]。由于恩諾沙星具有殺菌活性強、體內分布廣泛、組織濃度高、毒副作用小、與其他抗菌藥無交叉耐藥性等優(yōu)點[7-9]，被廣泛用于禽細菌性疾病和支原體感染等病癥[10-12]，能夠有效治療由雞滑液囊支原體M.synoviae、大腸埃希菌引起的呼吸道感染和氣囊炎等[13]?，F有技術將恩諾沙星制成乳劑，雖然該乳劑相對于其他制劑能夠增加恩諾沙星的分散度，但為普通乳劑或亞微乳，乳劑中的乳滴粒徑較大，乳劑在稀釋后不穩(wěn)定，恩諾沙星容易析出，難以達到肺部對可吸入微粒粒徑的要求，無法通過噴霧方式給藥。而納米乳粒徑介于10～100 nm之間，是由水相、油相、乳化劑和助乳化劑形成的膠體分散系統(tǒng)，多屬熱力學穩(wěn)定系統(tǒng)[14]。

桉葉油作為一種良好的透皮吸收促進劑[15]，還具有抗氧化、防腐、抑菌等生物活性[16]，無論混飲還是噴霧給藥對呼吸道疾病均有很好的輔助治療功效。本研究以恩諾沙星為主藥，桉葉油為油相，進行規(guī)?；u群噴霧給藥新技術研究，制備一種可噴霧給藥的獸用納米乳新制劑，并通過對沙門氏菌Salmonellapullorum和大腸埃希菌引起的全身感染疾病模型的藥效研究，初步評價研制的恩諾沙星納米乳噴霧的臨床效果。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

恩諾沙星原料藥：w為99.4%，上虞京新藥業(yè)有限公司；恩諾沙星對照品：w為99.5%，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；桉葉油：w為98.0%，成都艾科達化學試劑有限公司；1 g/L恩諾沙星溶液，安徽科爾藥業(yè)有限公司；LB瓊脂、MH 瓊脂、LB肉湯和MH肉湯均購自青島海博生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

微量移液器和臺式高速離心機：德國Eppendorf公司；Thermo Scientific Heraeus恒溫培養(yǎng)箱：美國Thermo Fisher Scientific 公司；THZ-300 恒溫培養(yǎng)搖床：上海一恒科學儀器有限公司；磁力攪拌器：常州澳華儀器有限公司；電子分析天平：BSA224S型，北京賽多利斯科學儀器有限公司；Milli Q超純水發(fā)生器：美國Millipore公司；酸度計：PHS-3C型，上海雷磁儀器廠；納米粒度及Zeta電位分析儀：Zatasizer Nano ZS 90，英國馬爾文公司；高效液相色譜 (HPLC)儀：SIL-20A型，日本島津公司；分光光度計：UV5200，上海元析設備有限公司；超聲霧化器：402AI，江蘇魚躍醫(yī)療設備股份有限公司。

1.3 試驗動物和菌株

快速型黃羽肉雞，1日齡，由廣東智威貿易有限公司提供，未經任何疫苗免疫，試驗前未給任何藥物，自由采食和飲水，臨床觀察17 d無異常后開始試驗。

所用菌株為雞白痢沙門氏菌CVCC1800和雞大腸埃希菌臨床株O78，均由華南農業(yè)大學藥理教研室提供。

1.4 禽用恩諾沙星納米乳的制備

1.4.1 輔料篩選 以恩諾沙星為主藥，桉葉油為納米乳油相，對乳化劑、助乳化劑、pH調節(jié)劑和抗氧化劑等輔料進行初步篩選。通過單因素試驗確定乳化劑為吐溫?80，助乳化劑為無水乙醇，pH調節(jié)劑為氫氧化鈉，用于后續(xù)試驗。

1.4.2 處方優(yōu)化 步驟 1：將處方量的乳化劑吐溫?80和助乳化劑無水乙醇渦旋、振蕩充分混勻得到混合乳化劑；步驟2：量取處方量的桉葉油加入到混合乳化劑中，用磁力攪拌器進行磁力攪拌，使桉葉油和混合乳化劑充分混合均勻；步驟3：用滴定管將滅菌超純水逐滴加入到上述混合體系中，邊滴加邊磁力攪拌使其混合均勻，注意觀察乳劑的狀態(tài)，當乳劑由澄清透明狀態(tài)轉變?yōu)闇啙釥顟B(tài)時記為滴定終點，記錄所需的超純水量；步驟4：調整乳化劑與助乳化劑的體積比(Km)，重復進行上述第2步和第3步的操作步驟，并記錄下不同Km條件下所得的滴定終點值即超純水的量，直至無論滴定多少量的超純水，該乳劑一直呈現澄清透明狀態(tài)即達到無限稀釋狀態(tài)，以空白納米乳劑的性狀、物理穩(wěn)定性(有無分層、析出、絮凝和破乳)和形成自微乳區(qū)面積大小作為考察指標，篩選最優(yōu)Km；步驟5：利用相轉化法分別設定混合乳化劑與油相的體積比分別為3∶1、2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7，用超純水滴定，記錄由清至濁的滴定終點狀態(tài)值，然后將混合乳化劑、水相、油相作為偽三元相圖的3 個頂點，根據滴定終點數據值繪制偽三元相圖。

1.4.3 納米乳外觀性狀及結構類型的鑒別 利用亞甲基藍和蘇丹III在納米乳中的擴散速度來對納米乳的類型進行鑒別。若亞甲基藍在納米乳中的擴散速度快于蘇丹III，表明該納米乳為O/W型納米乳。

1.4.4 納米乳粒徑大小及 Zeta電位的測定 將待測恩諾沙星納米乳劑用超純水稀釋10倍，用納米粒度及Zeta電位分析儀對其粒徑大小和Zeta電位進行測定。記錄平均粒徑、多分散系數(Polydispersity index，PDI)、粒徑分布情況和 Zeta電位。

1.5 納米乳中恩諾沙星的含量測定

1.5.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Gemini C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：0.025 mol/L磷酸溶液 (三乙胺調節(jié) pH 至 3.0)∶ 乙腈=83∶17(V/V)；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：278 nm；進樣量：10 μL。

1.5.2 含量檢測 精密移取 1 mL 恩諾沙星納米乳劑供試品置于潔凈燒杯中，用超純水充分稀釋，混勻，并轉移至100 mL棕色容量瓶中，用超純水充分洗滌至少3次，將洗滌液轉移至容量瓶內，制成每1 mL含恩諾沙星500 μg的溶液，充分搖勻。精密移取上述供試品溶液5 mL至另一50 mL棕色容量瓶中，用超純水定容至刻度，渦旋混勻，作為供試品溶液。制備相同濃度的恩諾沙星對照品溶液，上機檢測并計算納米乳中恩諾沙星含量。

在納米乳pH為9.5～10.5范圍內，采用正交試驗，考察硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉這2種抗氧化劑的3 種質量濃度（2、4、5 g/L）以及不同混合乳化劑和油相體積比 (5∶2、3∶1、4∶1)對納米乳的影響，每種試驗做3個重復，記錄試驗結果，包括乳劑的色澤，有無分層、破乳、析出等現象，然后通過HPLC測定恩諾沙星含量，得出平均含藥量。

1.6 噴霧預防試驗設計

1.6.1 人工感染劑量的確定 采用改良寇氏法對黃羽肉雛雞進行預試攻毒，雞白痢沙門氏菌和大腸埃希菌均采用腹腔注射，通過觀察雛雞群發(fā)病狀態(tài)及計算半數致死量，確定試驗攻毒方式及感染劑量。

1.6.2 試驗分組及處理 將 210 只體況健康、精神狀態(tài)良好的黃羽肉雞雛雞隨機分組，分組情況及處理如表1所示，每次霧化給藥量均為40 mL，霧化時間為 15 min。

表 1 動物分組及試驗處理Table 1 Animal grouping and experimental treatment

1.6.3 臨床癥狀觀察 觀察并記錄雞群試驗期間的精神狀態(tài)、食欲、糞便、行為、增質量等，并對死雞進行尸體剖檢，取肺臟、腸黏膜、心包膜、脾臟、肝臟和氣囊等組織或病變器官做病理分析及記錄，計算發(fā)病率、病死率、存活率、保護率以及治愈率。

1.7 數據分析

試驗數據采用SPSS20.0軟件分析，采用卡方檢驗(χ2)進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 處方篩選與優(yōu)化

通過對滴定過程及滴定結果的記錄、分析和納米乳劑的性狀、物理穩(wěn)定性(有無分層、析出和破乳)、形成自微乳區(qū)面積的考察，當Km=3∶2，混合乳化劑∶油相(V/V)=2∶1或 3∶1時均可形成自微乳體系，且納米乳能夠被水無限稀釋成澄清透明狀態(tài)。當混合乳化劑相∶油相(V/V)=3∶1時，在常態(tài)及加速離心條件下納米乳無分層、破乳等現象，穩(wěn)定性良好。因此，選取乳化劑∶助乳化劑(V/V)=3∶2，即Km為3∶2，滴定結果如表2所示，根據滴定終點數值繪制偽三元相圖如圖1所示。

采用單因素試驗考察pH對納米乳的影響，包括乳劑的顏色，有無分層、破乳、析出和藥物含量等。結果如表3所示，當乳劑的pH<9.5時，有藥物結晶析出；當pH>10.5時，納米乳狀態(tài)不穩(wěn)定，放置一段時間后，易形成普通乳白色不透明的乳劑；當pH介于9.5～10.5之間時，該納米乳均能維持澄清、透明、均一穩(wěn)定的狀態(tài)，且測得平均含藥量差異小。

表 2 乳化劑與助乳化劑體積比(Km)為3∶2時滴定過程數據記錄Table 2 Data of titration with water when the volume fraction of emusifier to coemusifier(Km) was 3∶2

圖 1 乳化劑與助乳化劑體積比(Km)為3∶2時納米乳的偽三元相圖Fig.1 Pseudo-ternary phase diagram of nanoemulsion when the volume fraction of emusifier to coemusifier(Km) was 3∶2

表 3 乳化劑與助乳化劑體積比(Km)為3∶2時pH對納米乳的影響Table 3 The effects of pH on nanoemulsion when the volume fraction of emusifier to coemusifier(Km)was 3∶2

正交試驗結果如表4所示，選擇焦亞硫酸鈉為抗氧化劑，且當其質量濃度為0.4%時有較好的抗氧化性?；旌先榛瘎┡c桉葉油的比值為3∶1和4∶1時較合適，通過對制劑進行質量評價及穩(wěn)定性考察（包括影響因素試驗、加速試驗及長期穩(wěn)定性試驗）的結果，當選取混合乳化劑與桉油的比例為4∶1時，納米乳的穩(wěn)定性較比例為3∶1時更強，在相同試驗條件下，納米乳的物理性狀及藥物含量更穩(wěn)定。

表 4 恩諾沙星納米乳正交試驗處方篩選結果Table 4 Screened formula of enrofloxacin nanoemulsion by orthogonal test

2.2 外觀性狀及結構類型的鑒別

采用該工藝制備的納米乳呈淡黃色，為澄清透明且具有良好流動性的清亮液體，無分層、析出、絮凝及破乳等現象出現，成品如圖2所示。染色試驗結果(圖3)顯示，亞甲基藍在該乳劑中的擴散速度 大于蘇丹III，表明該乳劑為O/W型納米乳。

圖 2 恩諾沙星納米乳成品Fig.2 End product of enrofloxacin nanoemulsion

圖 3 亞甲基藍和蘇丹III在恩諾沙星納米乳中的擴散效果Fig.3 Diffusion effects of methylene blue and sudan III in enrofloxacin nanoemulsion

將制備的恩諾沙星納米乳稀釋10倍后經納米粒度及Zeta電位分析儀的測定，粒度分析儀試驗結果(圖4)顯示，恩諾沙星納米乳的平均粒徑為（10.79±1.5） nm，PDI為 0.446，粒徑分布范圍較窄，且分布比較均勻。Zeta 電位為?21.63 mV(圖 5)。

圖 4 恩諾沙星納米乳的粒徑分布Fig.4 Particle size distribution of enrofloxacin nanoemulsion

圖 5 恩諾沙星納米乳的Zeta電位Fig.5 Zeta potential of enrofloxacin nanoemulsion

2.3 對雞白痢沙門氏菌病和禽大腸埃希菌病的防治效果評估

通過觀察發(fā)現感染對照組全群發(fā)病，表現為精神委靡、縮頭閉眼、飲水和采食均減少、排綠白色稀糞[17-19]；剖檢特征如圖6所示：纖維素性心包炎，心肌出血點明顯，氣囊混濁，有干酪樣滲出物，肝周炎，肝臟表面有出血點，被膜有纖維素性附著物[20-22]。健康對照組全群健康。試驗組數據經統(tǒng)計學軟件分析，高、中、低劑量預防給藥組的存活率分別為90%、83.3%、73.3%，均極顯著高于感染對照組26.7%(P<0.01)；高劑量組保護率為83.3%，顯著高于低劑量組53.3%的保護率(P<0.05)；3組預防給藥組的治愈率較低，且差異不顯著(P>0.05)。各試驗組的防治效果如表5所示。

圖 6 臨床試驗病理解剖對比圖Fig.6 Comparison of pathological anatomy in clinical trials

表 5 各試驗組的預防及治療效果Table 5 Preventive and therapeutic effects of each trial

3 討論與結論

噴霧給藥能夠使藥物迅速到達病灶，禽類特殊的呼吸特征有利于噴霧給藥的使用，氣囊的存在，極大地增大了受藥面積[23]。試驗采用相轉變法，通過單因素試驗和正交試驗對納米乳的制備輔料和工藝處方進行優(yōu)化，制備出了一種可噴霧給藥的復方恩諾沙星納米乳獸用新制劑。桉葉油作為納米乳的油相，在采取噴霧給藥方式時，能夠發(fā)揮其良好的透皮促滲作用[24]，并改善呼吸道功能[25-26]。對納米乳的物理性狀和藥劑學特征進行考察，本試驗所制得的禽用恩諾沙星納米乳劑呈淡黃色、澄清透明、均一穩(wěn)定，pH為9.5～10.5，未有分層、絮凝、藥物析出及破乳等現象出現。通過對其粒徑及Zeta電位進行測定，該乳劑中乳滴粒徑達到10 nm左右，且分布集中，經多次測試，平行性良好。制備出的復方納米乳制劑性質穩(wěn)定，在穩(wěn)定性考察中未出現分層、絮凝、藥物析出及破乳等現象，可以避免在超聲霧化及其他噴霧給藥方式過程中因各種原因堵塞噴頭及管道。

對雛雞的感染預試驗確定雞白痢沙門氏菌CVCC1800的感染劑量為1.0 mL/kg，經平板培養(yǎng)計數法測定其菌落總數為5×108CFU/mL，按常規(guī)飼養(yǎng)方式在12 h后在雛雞右側腹腔注射大腸埃希菌O78的感染劑量為2.0 mL/kg，經平板培養(yǎng)計數法測定其菌落總數為 1×109CFU/mL，約為 0.3 mL，這與歐陽五慶等[27]報道的對18日齡京白雛雞腹腔注射大腸埃希菌O2菌液0.3 mL相一致。感染后發(fā)病癥狀明顯，通過病理解剖可發(fā)現典型癥狀如纖維素性心包炎、心肌出血點等。通過構建人工感染模型，對研制的禽用恩諾沙星納米乳進行初步藥效評估，試驗數據表明，健康對照組全群健康，且健康對照組試驗雞群在噴霧給藥過程中未有任何不良反應如咳嗽、喘氣、打噴嚏等。采取超聲霧化吸入給藥方式進行疾病防治對雞群應激性較小，在對霧化過程進行觀察時發(fā)現，霧化出的小液滴能夠長時間懸浮于雞舍內，確保了雞群能夠有比較充裕的時間吸入液滴，避免了噴霧后立即下沉或附著在雞舍周邊及雞羽上等情況的發(fā)生。制備的復方恩諾沙星納米乳采用高、中、低劑量噴霧給藥對雞大腸埃希菌與沙門氏菌侵染均有一定的防護效果，各組保護率明顯高于感染對照組，且劑量越高，防護效果越好，但試驗中噴霧給藥的治療效果一般，低劑量治療噴霧給藥組的治愈率僅為35.7%，表明該恩諾沙星納米乳采取噴霧給藥方式可用于恩諾沙星敏感菌引起的呼吸道感染和氣囊炎等的預防。

本研究以恩諾沙星為主藥、桉葉油為油相制備的復方恩諾沙星納米乳，具有一定的自乳化能力，且稀釋液澄清透明、均一穩(wěn)定，可通過噴霧裝置經呼吸道途徑吸入給藥，適合雛雞群前期的預防給藥，打破了傳統(tǒng)給藥方式的束縛，對雞群中常發(fā)的雞白痢沙門氏菌病和大腸埃希菌病有良好的預防效果，該研究為獸藥新劑型的研發(fā)及新型給藥方式的探索提供了參考。