口服金霉素微囊化顆粒對(duì)綿羊瘤胃微生物菌群數(shù)量的影響

李國基，胡 浪，李榮順，李大彪，楊 碩，邢媛媛，黃顯會(huì)

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院/廣東省獸藥研制與安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642；2 金河生物科技股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

反芻動(dòng)物瘤胃微生物系統(tǒng)是由細(xì)菌、古生菌、原蟲和厭氧真菌共同組成的復(fù)雜微生物群落系統(tǒng)，瘤胃微生物對(duì)反芻動(dòng)物纖維飼料的消化及轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸做出了較大貢獻(xiàn)[1-2]。當(dāng)反芻動(dòng)物感染并暴發(fā)病原性細(xì)菌性疾病—如犢牛腹瀉、奶牛乳房炎、羔羊痢疾及母羊流產(chǎn)等，注射抗生素或者口服抗生素類飼料添加劑對(duì)細(xì)菌性疾病的防治起到了相當(dāng)重要的作用。但當(dāng)抗生素對(duì)致病菌發(fā)揮抑制或殺滅作用的同時(shí)，對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃非病原性細(xì)菌也可能會(huì)產(chǎn)生殺滅或抑制作用[3]，同時(shí)瘤胃微生物對(duì)口服抗生素會(huì)有一定的降解作用。

近年來，由大腸埃希菌引起的細(xì)菌性腸炎及痢疾廣泛存在于反芻動(dòng)物犢牛及羔羊中，每年由腹瀉及痢疾造成的羔羊及犢牛死淘率給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。金霉素屬于廣譜抗生素，具有高劑量殺菌及低劑量抑菌的效果，作為抗菌及促生長飼料添加劑在我國禽畜業(yè)養(yǎng)殖生產(chǎn)中得到了廣泛使用，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展具有重要的促進(jìn)作用。前期研究發(fā)現(xiàn)普通金霉素預(yù)混劑顆粒在反芻動(dòng)物綿羊瘤胃液中釋放量較大[4]，說明其對(duì)瘤胃微生物的抑制作用可能也較大。廣東省獸藥研制與安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主研制的反芻動(dòng)物口服用金霉素微囊化顆粒在反芻動(dòng)物瘤胃中的釋放量比普通金霉素預(yù)混劑顆粒少，且在皺胃能夠大量釋放，滿足反芻動(dòng)物對(duì)金霉素的有效吸收，起到抑菌作用，表明其可能能夠減少金霉素對(duì)瘤胃微生物的抑制作用。因此本試驗(yàn)將對(duì)反芻動(dòng)物綿羊分別口服普通金霉素預(yù)混劑顆粒及金霉素微囊化顆粒后8種主要瘤胃微生物—瘤胃總細(xì)菌（Rumen general bacteria）、瘤胃厭氧真菌（Rumen anaerobic fungi）、白色瘤胃球菌Ruminococcusalbus、黃化瘤胃球菌Ruminococcus flavefaciens、產(chǎn)琥珀酸擬桿菌Fibrobacter succinogens、牛鏈球菌Streptococcusbovis、普雷沃氏菌屬Prevotellaspp.、溶纖維丁酸弧菌Butyrivibrio fibrisolvens的數(shù)量變化進(jìn)行分析比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 金霉素微囊化顆粒制劑：金霉素含量為10% (w)，由廣東省獸藥研制與安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室與金河生物科技股份有限公司共同研制；金霉素預(yù)混劑顆粒：金霉素含量為22.7%(w)，批號(hào)20180326，由金河生物科技股份有限公司提供；PMD-19T克隆試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒、RNA 酶、DNA premix 擴(kuò)增酶、DL2000 marker、6×Loading buffer、核酸染料、TOP 10 感受態(tài)細(xì)胞、熒光定量試劑盒購自寶生物工程有限公司。

1.1.2 主要儀器 MAXQ4000 恒溫?fù)u床和 Mach 1.6R冷凍離心機(jī)購自美國賽默飛世爾科技公司；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海一恒科技有限公司；SX-500高壓鍋、NanoDrop 2000酶標(biāo)儀和G:BOX凝膠成像儀器購自基因有限公司；HH-2恒溫水浴鍋購于國華電器有限公司；CFX96 RT-PCR儀購于Bio-Rad公司。

1.1.3 培養(yǎng)基配制 LB 液體培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱取 5 g酵母提取物、10 g 胰蛋白胨及 10 g 氯化鈉于 1 L 錐形瓶中，加入950 mL去離子水后攪拌溶解，用5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.0后，加入去離子水定容至 1 L，121 ℃ 條件下高壓滅菌 15 min，于潔凈臺(tái)冷卻，4 ℃保存。

LB/Amp/IPTG/X-Gal固體培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱取5 g酵母提取物、10 g 胰蛋白胨及 10 g 氯化鈉于 1 L 錐形瓶中，加入950 mL去離子水后攪拌溶解，用5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.0后，加入去離子水定容至 1 L，121 ℃ 條件下高壓滅菌 15 min。冷卻至 55～60 ℃ 左右，加入 1 mL Amp (100 mg/mL)、0.48 mL IPTG 及 0.80 mL X-Gal后混勻，快速倒入培養(yǎng)皿中，于潔凈臺(tái)冷卻凝固，4 ℃保存。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 體質(zhì)量（29.0±2.3） kg、體況良好、6月齡左右的18只綿羊購于內(nèi)蒙古呼和浩特托克托縣某示范羊場。試驗(yàn)動(dòng)物飼喂的飼糧精粗料質(zhì)量比為3∶7，其中精料為內(nèi)蒙古正大羊育肥料(內(nèi)蒙古正大有限公司)，粗料為青干草且均不含藥物及抗生素。每天按照試驗(yàn)動(dòng)物正常采食量投放精料，待精料吃完后再投放粗料。試驗(yàn)動(dòng)物飼糧的營養(yǎng)水平(w)為有機(jī)物92.70%、干物質(zhì)94.52%、粗蛋白質(zhì)14.33%、酸性洗滌纖維24.76%、中性洗滌纖維47.30%、鈣0.89%、磷0.42%。試驗(yàn)動(dòng)物每天飼喂2次(09：00左右及17：00左右)，自由飲水。羊舍環(huán)境及綿羊飼養(yǎng)管理均在統(tǒng)一試驗(yàn)水平條件下進(jìn)行，所有試驗(yàn)動(dòng)物均單代謝籠飼喂，且動(dòng)物房保持通風(fēng)。18頭綿羊統(tǒng)一飼喂相同配比的粗精料15 d且體況均表現(xiàn)正常后，開始正式試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)于2019年1月10日在內(nèi)蒙古呼和浩特托克托縣某示范羊場進(jìn)行。所有試驗(yàn)動(dòng)物統(tǒng)一飼養(yǎng)15 d后，隨機(jī)分為6組，每組3只，包括1個(gè)空白對(duì)照組（CK）和5個(gè)給藥組?？瞻讓?duì)照組的綿羊只飼喂基礎(chǔ)飼糧，5個(gè)給藥組綿羊的具體處理如下。試驗(yàn)I組：飼喂基礎(chǔ)飼糧和普通金霉素預(yù)混劑顆粒；試驗(yàn)II組：飼喂基礎(chǔ)飼糧和氫化油處方組金霉素微囊化顆粒；試驗(yàn)III組：飼喂基礎(chǔ)飼糧和PEG4000/單甘脂處方組金霉素微囊化顆粒，輔料PEG4000和輔料單甘脂的質(zhì)量比為5︰5，試驗(yàn)IV組：飼喂基礎(chǔ)飼糧和氫化油/單甘脂處方組金霉素微囊化顆粒,輔料氫化油和輔料單甘脂的質(zhì)量比為9︰1；試驗(yàn)V組：飼喂基礎(chǔ)飼糧和氫化油/單甘脂處方組金霉素微囊化顆粒，輔料氫化油和輔料單甘脂的質(zhì)量比為8︰2。

1.2.2 給藥與樣本采集 5個(gè)給藥組按照每頭綿羊的單位體質(zhì)量進(jìn)行灌胃給藥，金霉素的給藥劑量均為25 mg/kg，每天給藥1次且均在晨飼前灌胃給藥。連續(xù)給藥5 d后對(duì)6組綿羊進(jìn)行瘤胃食糜采集，采集的瘤胃食糜均迅速經(jīng)4層紗布過濾，保留濾液于液氮中，?80 ℃保存。

1.2.3 瘤胃液基因組總DNA提取 將瘤胃液樣品從?80 ℃冰箱取出后于冰上解凍，根據(jù)李子健[5]及劉薇等[6]提供的CTAB法提取瘤胃液基因組DNA。

1.2.4 DNA 的檢測 配制 10 g/L 的瓊脂糖凝膠，對(duì)所提瘤胃微生物總基因組DNA進(jìn)行檢測，同時(shí)用酶標(biāo)儀檢測所提 DNA 的濃度及D260 nm、D280 nm值。

1.2.5 瘤胃微生物引物設(shè)計(jì) 瘤胃微生物引物均在華大基因合成，引物序列見表1。

1.2.6 目的基因的擴(kuò)增參數(shù)及擴(kuò)增體系 PCR預(yù)變性參數(shù)為 94 ℃ 5 min；擴(kuò)增參數(shù)為 94 ℃ 變性 30 s，55～60 ℃ 退火 40 s，72 ℃ 延伸 40 s，40 次循環(huán)；延長參數(shù)為 72 ℃ 5 min；保溫溫度為 4 ℃?？偡磻?yīng)體系為 25 μL：DNA 模板 2.0 μL、上下游引物各 1.0 μL、DNA 聚合酶 12.5 μL、滅菌超純水 8.5 μL。

1.2.7 目標(biāo)片段膠回收 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物首先用 10 g/L 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，目標(biāo)片段合格后切膠回收。

1.2.8 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆連接體系 連接體系為 10 μL，包括膠回收產(chǎn)物 4 μL、克隆載體 1 μL 和Solution I 5 μL，于 16 ℃ 條件下連接 7 h 左右。

1.2.9 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 將 10 μL連接產(chǎn)物全部加入 50 μL TOP 10 感受態(tài)細(xì)胞中，于冰中靜置 30 min 后轉(zhuǎn)入 42 ℃ 水浴鍋中，90 s后快速轉(zhuǎn)移到冰中靜置2 min左右后再轉(zhuǎn)至300 μL不含抗生素的LB 液體培養(yǎng)基，在水浴搖床中振蕩培養(yǎng)1 h 進(jìn)行復(fù)蘇，復(fù)蘇培養(yǎng)條件為 37 ℃、160～200 r/min。之后將復(fù)蘇菌液涂布于含有抗生素及顯色底物的LB固體培養(yǎng)基上，最后于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20 h。

1.2.10 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備 挑選單個(gè)白色菌落接種至含有抗生素的4 mL LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，復(fù)蘇條件為 37 ℃、160～200 r/min。復(fù)蘇培養(yǎng)12～16 h后，對(duì)菌液進(jìn)行PCR陽性鑒定，鑒定為陽性者委托華大基因進(jìn)行單向測序。將測序結(jié)果在NCBI比對(duì)，相似性在95%以上方可進(jìn)行質(zhì)粒提取。

表 1 瘤胃微生物PCR擴(kuò)增引物Table 1 PCR amplification primers of ruminal microbes

1.2.11 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品以10倍濃度進(jìn)行稀釋，稀釋濃度梯度不少于5個(gè)，每個(gè)梯度設(shè)置3次重復(fù)。熒光定量PCR結(jié)束后，根據(jù)熒光定量儀中的Eco軟件獲得質(zhì)?？截悢?shù)與Ct值對(duì)應(yīng)的線性關(guān)系，制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.12 待測樣品熒光定量分析 樣品和質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的 PCR 反應(yīng)體系均為 10 μL，包括模板1 μL、上下游引物各 0.5 μL、滅菌超純水 3 μL、熒光定量試劑盒混合體系5 μL。各細(xì)菌RT-PCR擴(kuò)增參數(shù)均與普通PCR擴(kuò)增參數(shù)相同，其中熔解參數(shù)為95 ℃ 15 s，55～60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。絕對(duì)定量前將待測樣品統(tǒng)一稀釋到10 ng/μL，將待測樣品Ct值帶入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到菌群拷貝數(shù)，菌群拷貝數(shù)計(jì)算公式參考李大彪等[11]的研究。菌群數(shù)量最終采用1 mL樣品中16S rDNA拷貝數(shù)的常用對(duì)數(shù)值表示。

1.2.13 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用 SAS 9.2 中 GLM 程序，采用Duncan’s法對(duì)熒光定量數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行多重比較方差分析，差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品基因組總DNA提取結(jié)果

粗提瘤胃液總 DNA 中，D260 nm/D280 nm值在1.8～2.0 之間，質(zhì)量濃度在 152～897 ng/μL 之間，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，目的條帶均位于2 000 bp以上，說明所提瘤胃總DNA純度較高，濃度較大，目的條帶大小正確。粗提總DNA的10 g/L瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1。

圖 1 瘤胃液基因組DNA凝膠圖Fig.1 Electrophoretogram of rumen fluid genomic DNA

2.2 目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

8種瘤胃微生物經(jīng)普通PCR擴(kuò)增后進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，檢測后發(fā)現(xiàn)各目的條帶均與預(yù)測條帶一致，無非特異性擴(kuò)增條帶，說明可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。瘤胃厭氧真菌及其他7種瘤胃細(xì)菌普通PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2。

2.3 藍(lán)白斑篩選結(jié)果

目的基因連接轉(zhuǎn)化后均勻涂布于含顯色底物及Amp的固體平板培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～20 h后，培養(yǎng)基上均長出藍(lán)、白色單克隆菌，且單克隆菌落間界限清晰，顯色明顯，可進(jìn)行單個(gè)白色重組質(zhì)粒菌落篩選，用于下一步試驗(yàn)。部分目的基因藍(lán)白篩選見圖3。

圖 2 8種瘤胃微生物的普通PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Normal PCR amplification results of eight kinds of ruminal microbes

2.4 菌液PCR鑒定結(jié)果

8種瘤胃微生物菌液目標(biāo)條帶與預(yù)測條帶基本一致（圖4），說明膠回收產(chǎn)物與克隆載體連接成功，成功構(gòu)建了含有目標(biāo)片段的重組質(zhì)粒，可送檢測序。

2.5 陽性克隆測序結(jié)果

將8種瘤胃微生物測序結(jié)果在NCBI(GenBank)上比對(duì)，結(jié)果顯示8種瘤胃微生物目的片段序列與文庫菌株相似性在95%～100%之間，表明成功構(gòu)建了帶有目的片段的重組質(zhì)粒，能進(jìn)行8種瘤胃微生物質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備。

2.6 重組質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線及擴(kuò)增和熔解曲線結(jié)果

8種瘤胃微生物標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，且斜率在?3.75～?3.20范圍內(nèi)，表明拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值與Ct值之間呈較好的線性關(guān)系，符合熒光定量PCR反應(yīng)要求；8種瘤胃微生物熒光定量PCR擴(kuò)增效率在85%～105%之間，從擴(kuò)增曲線可以看出均檢測出了樣本熒光信號(hào)。同時(shí)從熔解曲線可以看出退火溫度單一，表明PCR產(chǎn)物特異性較強(qiáng)。以上結(jié)果均表明熒光定量結(jié)果符合要求，能夠用于定量分析。部分圖譜見圖5、6、7。

圖 3 部分目的基因藍(lán)白篩選圖Fig.3 White-blue plaque selection of partial target gene

圖 4 8種瘤胃微生物菌液PCR擴(kuò)增Fig.4 Bacterial fluid PCR amplification of eight kinds of ruminal microbes

圖 5 瘤胃厭氧真菌和瘤胃總細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curves of rumen anaerobic fungi and rumen general bacteria

圖 6 瘤胃厭氧真菌和瘤胃總細(xì)菌擴(kuò)增曲線Fig.6 Amplification curves of rumen anaerobic fungi and rumen general bacteria

圖 7 瘤胃厭氧真菌和瘤胃總細(xì)菌熔解曲線Fig.7 Melt curves of rumen anaerobic fungi and rumen general bacteria

2.7 普通金霉素預(yù)混劑顆粒及4種金霉素微囊化顆粒對(duì)綿羊瘤胃微生物數(shù)量的影響

普通金霉素預(yù)混劑顆粒和4組金霉素微囊化顆粒均會(huì)對(duì)瘤胃微生物菌群數(shù)量產(chǎn)生一定影響(表2)。相對(duì)于空白對(duì)照組，氫化油/單甘脂(質(zhì)量比為9︰1)處方組金霉素微囊化顆粒及PEG4000/單甘脂(質(zhì)量比為5︰5)處方組金霉素微囊化顆粒分別只對(duì)牛鏈球菌及產(chǎn)琥珀酸擬桿菌的數(shù)量有降低趨勢(P<0.05)。普通金霉素預(yù)混劑顆粒、氫化油處方組金霉素微囊化顆粒以及氫化油/單甘脂(質(zhì)量比為8︰2)處方組金霉素微囊化顆粒對(duì)多種瘤胃微生物菌群數(shù)量均有降低的趨勢(P<0.05)，其中普通金霉素預(yù)混劑顆粒和氫化油/單甘脂(質(zhì)量比為8︰2)處方組金霉素微囊化顆粒對(duì)產(chǎn)琥珀酸擬桿菌及牛鏈球菌數(shù)量有降低趨勢(P<0.05)，而氫化油處方組金霉素微囊化顆粒對(duì)三大綿羊瘤胃纖維降解菌（產(chǎn)琥珀酸擬桿菌、白色瘤胃球菌、黃化瘤胃球菌）以及牛鏈球菌數(shù)量均有降低趨勢(P<0.05)。因此，氫化油/單甘脂(質(zhì)量比為9︰1)處方組及PEG4000/單甘脂(質(zhì)量比為5︰5)處方組金霉素微囊化顆粒有相對(duì)較好的效果。

與普通金霉素預(yù)混劑顆粒相比，氫化油處方組金霉素微囊化顆粒對(duì)黃化瘤胃球菌和白色瘤胃球菌的數(shù)量有更大的降低趨勢(P<0.05)；PEG4000/單甘脂(質(zhì)量比為5︰5)處方組金霉素微囊化顆粒對(duì)溶纖維丁酸弧菌有增加趨勢(P<0.05)；氫化油/單甘脂(質(zhì)量比為8︰2)處方組金霉素微囊化顆粒處理的各微生物菌群數(shù)量均未有明顯變化；氫化油/單甘脂(質(zhì)量比為9︰1)處方組金霉素微囊化顆粒顯著增加了產(chǎn)琥珀酸擬桿菌的數(shù)量(P<0.05)，對(duì)其他幾種瘤胃微生物菌群數(shù)量影響均不顯著(P>0.05)；因此，氫化油/單甘脂(質(zhì)量比為9︰1)處方組金霉素微囊化顆粒相對(duì)普通金霉素預(yù)混劑顆粒有較好的效果。

表 2 普通金霉素預(yù)混劑顆粒及4種金霉素微囊化顆粒對(duì)綿羊瘤胃微生物數(shù)量的影響Table 2 Effects of normal chlortetracycline premix granule and four kinds of chlortetracycline microcapsules on the quantity of ruminal microbe of sheep

3 討論與結(jié)論

金霉素屬于廣譜抗生素，對(duì)大部分革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、立克次體、支原體、衣原體以及阿米巴原蟲等均有抑制效果。從20世紀(jì)80年代開始，飼料級(jí)金霉素就在我國作為抗菌、促生長飼料添加劑使用[12-13]。目前FDA已批準(zhǔn)金霉素預(yù)混劑顆粒用于多種動(dòng)物細(xì)菌性疾病的臨床防治，其中在反芻動(dòng)物臨床應(yīng)用中主要用于牛，治療大腸埃希菌和沙門氏菌引起的牛細(xì)菌性腸炎，以及多殺性巴氏桿菌引起的牛細(xì)菌性肺炎，每天給藥劑量約22 mg/kg，且給藥時(shí)間不超過5 d，尚未批準(zhǔn)用于治療大腸埃希菌及沙門氏菌引起的綿羊細(xì)菌性腹瀉疾病。本研究認(rèn)為可能是治療大腸埃希菌引起的綿羊腹瀉所需的普通金霉素預(yù)混劑顆粒的劑量較大，綿羊口服大劑量的普通金霉素預(yù)混劑顆粒對(duì)瘤胃微生物抑制作用也較大，因此FDA暫未批準(zhǔn)金霉素預(yù)混劑顆粒用于綿羊細(xì)菌性疾病的治療。本試驗(yàn)在給藥劑量及療程上參考普通金霉素預(yù)混劑顆粒治療由大腸埃希菌引起的牛細(xì)菌性腹瀉的劑量及療程，普通金霉素預(yù)混劑顆粒及金霉素微囊化顆粒給藥劑量均定為每天 25 mg/kg，給藥療程均為 5 d，分析比較普通金霉素預(yù)混劑顆粒及自主研制的4種金霉素微囊化顆粒對(duì)綿羊瘤胃微生物菌群的影響。

為了降低反芻動(dòng)物口服抗生素后對(duì)瘤胃微生物的影響，近年來國內(nèi)開展了反芻動(dòng)物口服抗生素微囊化制劑的研究試驗(yàn)，如反芻動(dòng)物口服恩諾沙星微囊顆粒的研制[14]及過瘤胃包被恩諾沙星微丸的制備等[15]，但此類研究相對(duì)較少，且國內(nèi)外關(guān)于反芻動(dòng)物口服金霉素微囊顆粒制劑的研究報(bào)道也較少。對(duì)于反芻動(dòng)物口服普通金霉素顆粒劑對(duì)瘤胃微生物的影響，國外學(xué)者進(jìn)行了大批量試驗(yàn)。Turner等[16]選取3頭體質(zhì)量在27.7～31.8 kg之間的綿羊，按每頭750 mg普通鹽酸金霉素顆粒(約23.6～27.1 mg/kg)的劑量口服灌胃給藥，發(fā)現(xiàn) 2 h后3頭綿羊瘤胃總細(xì)菌數(shù)量均減少到了75%左右，2 d后瘤胃總細(xì)菌數(shù)量才逐漸恢復(fù)；Lodge等[17]發(fā)現(xiàn)長時(shí)間在飼料中按照每頭肉牛240 mg/d及80 mg/d的劑量添加普通金霉素顆粒均會(huì)降低肉牛瘤胃纖維消化率；另有研究表明長時(shí)間口服普通金霉素預(yù)混劑顆粒會(huì)造成小肉牛瘤胃細(xì)菌菌群紊亂、食欲下降、個(gè)體瘤胃兼性厭氧菌增加和纖維消化細(xì)菌減少等[18]。以上研究均表明反芻動(dòng)物長時(shí)間大劑量口服普通金霉素顆粒會(huì)對(duì)其瘤胃微生物菌群造成不良影響。

考慮到不同粗精比日糧對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃微生物菌群的多樣性及細(xì)菌數(shù)量影響較大[19-22]，為了減少試驗(yàn)結(jié)果誤差，18頭綿羊統(tǒng)一飼喂相同配比的粗精料15 d且體況均表現(xiàn)正常后，再開始正式試驗(yàn)。羊、牛等反芻動(dòng)物能夠有效消化吸收纖維類植物飼料并將其轉(zhuǎn)化為自身主要能量來源，得益于反芻動(dòng)物自身瘤胃微生物菌群對(duì)纖維類植物的消化降解作用，其中起主要作用的優(yōu)勢菌株為白色瘤胃球菌、黃化瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸擬桿菌三大瘤胃纖維分解菌[23-24]。另外還有溶纖維丁酸弧菌[25]和牛鏈球菌[26-27]等綿羊瘤胃細(xì)菌以及瘤胃真菌[28]等也被證明對(duì)纖維的分解起一定作用。本試驗(yàn)主要研究了反芻動(dòng)物口服普通金霉素預(yù)混劑顆粒及4種金霉素微囊化顆粒對(duì)瘤胃厭氧真菌及7種瘤胃細(xì)菌數(shù)量的影響。Koike等[8, 29]及 Michalet-Doreau 等[30]研究表明，產(chǎn)琥珀酸擬桿菌在3種主要瘤胃纖維分解菌中在數(shù)量上占絕對(duì)優(yōu)勢，比黃化瘤胃球菌和白色瘤胃球菌高1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。本試驗(yàn)結(jié)果中，空白對(duì)照組綿羊產(chǎn)琥珀酸擬桿菌、黃化瘤胃球菌和白色瘤胃球菌數(shù)量的數(shù)量級(jí)分別為1010、109和108，產(chǎn)琥珀酸擬桿菌數(shù)量分別比黃化瘤胃球菌和白色瘤胃球菌數(shù)量高1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，與前期研究結(jié)果一致，證實(shí)了本試驗(yàn)定量結(jié)果的真實(shí)準(zhǔn)確性。在普通金霉素預(yù)混劑顆粒和4組金霉素微囊化顆粒對(duì)瘤胃微生物數(shù)量影響的研究中，與空白對(duì)照組相比，普通金霉素預(yù)混劑顆粒組和4種金霉素微囊化顆粒組綿羊的瘤胃總細(xì)菌、瘤胃真菌以及普雷沃氏菌屬數(shù)量均未發(fā)生顯著變化(P＞0.05)，其中瘤胃總細(xì)菌的數(shù)量變化與Munch-Petersen等[18]在飼料中加入普通金霉素預(yù)混劑顆粒后瘤胃總細(xì)菌數(shù)量增加的結(jié)果有所不同。

普通金霉素預(yù)混劑顆粒及4種金霉素微囊化顆粒均或多或少使瘤胃微生物數(shù)量產(chǎn)生變化，但相對(duì)于普通金霉素預(yù)混劑顆粒和其他3種金霉素微囊化顆粒，氫化油/單甘脂(質(zhì)量比為9︰1)處方組金霉素微囊化顆粒對(duì)綿羊瘤胃微生物數(shù)量的抑制作用較小。因此本試驗(yàn)結(jié)果可為金霉素微囊化顆粒制劑處方的進(jìn)一步篩選提供科學(xué)合理的數(shù)據(jù)，同時(shí)也能為下一步臨床試驗(yàn)研究提供參考。