白狐源星狀病毒RdRp基因的鑒定及遺傳演化分析

冀錦朝，黃 勉，盧 剛，歐嘉俊，彭仕明，薩家祺，李守軍

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院/廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642；2 廣州動(dòng)物園，廣東 廣州 510070)

星狀病毒(Astrovirus)是一種無囊膜二十面體單鏈正鏈RNA病毒，于1975年首次在腸炎患兒的糞便中發(fā)現(xiàn)，主要引發(fā)人和動(dòng)物的胃腸道疾病[1]。該病毒粒子負(fù)染后經(jīng)透射電子顯微鏡觀察，可見表面具有特征性的五角或六角星狀結(jié)構(gòu)，因此命名為星狀病毒[2]。該病毒基因組全長為6.1～7.9 kb，基因組結(jié)構(gòu)包括5′UTR、3個(gè)開放閱讀框(ORF1a、ORF1b和ORF2)及3′UTR、多聚腺苷酸(PolyA)尾。其中ORF1a、ORF1b編碼星狀病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，包含跨膜域、核定位信號(hào)、核糖體移框信號(hào)、絲氨酸蛋白酶及RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)；ORF2則編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白?衣殼蛋白，其全長氨基酸序列可以作為星狀病毒種間劃分的依據(jù)[3]。目前，星狀病毒科Astroviridae分2個(gè)屬：哺乳動(dòng)物星狀病毒屬M(fèi)amastrovirus和禽類星狀病毒屬Avastrovirus。哺乳動(dòng)物感染星狀病毒后通常會(huì)引起胃腸炎，少數(shù)情況下會(huì)引起神經(jīng)綜合征和腦炎[4]；禽類感染星狀病毒后可引起腸炎、肝炎和腎炎等多種疾病[5]。星狀病毒在我國哺乳動(dòng)物及禽類養(yǎng)殖場(chǎng)中普遍存在，在寵物貓狗臨床上常與其他病毒發(fā)生混合感染。

星狀病毒自被發(fā)現(xiàn)以來，一直被認(rèn)為是人和動(dòng)物胃腸炎的重要病原之一。近年來，隨著現(xiàn)代分子檢測(cè)技術(shù)與病原診斷技術(shù)的不斷進(jìn)步，越來越多的星狀病毒在哺乳動(dòng)物和禽類中被相繼發(fā)現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)星狀病毒也可以感染哺乳動(dòng)物的腸外器官，如腦[6]、肺臟[7]、脾臟[7]、腎臟[7]等，并且高度分化的星狀病毒可以越過胃腸道直接感染其他組織或器官[8]。星狀病毒感染宿主通常具有種屬特異性，然而報(bào)道顯示該病毒在人和動(dòng)物上存在跨種傳播的現(xiàn)象[9]。目前，星狀病毒在世界范圍內(nèi)流行，不僅對(duì)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)和珍稀野生動(dòng)物造成極大損失和危害，也對(duì)人類健康產(chǎn)生了巨大的威脅。本研究利用半巢式RT-PCR對(duì)1只死亡白狐Alopexlagopus的心臟、肺臟、肝臟及腎臟進(jìn)行星狀病毒RdRp基因的檢測(cè)，并對(duì)擴(kuò)增鑒定出的病毒株的RdRp基因進(jìn)行序列測(cè)定和分析，以期了解星狀病毒的遺傳及進(jìn)化狀況，為該病毒的診斷及引發(fā)疾病的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

2019年1月采集1只死亡白狐的心臟、肺臟、肝臟及腎臟。

1.2 主要試劑

RNAiso Plus購自 Takara Bio 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 Hiscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、膠回收試劑盒 FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit購自諾唯贊生物科技股份有限公司(南京)；預(yù)混酶2×TaqPCR StarMix with Loading Dye 購自 GeneStar；連接酶pCloneEZ-NRS-Omni-Amp/HC購自中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司；感受態(tài)細(xì)胞DH5α Chemically Competent Cell購自上海唯地技術(shù)有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

針對(duì)星狀病毒RdRp基因的保守區(qū)域，參照文獻(xiàn)[10]設(shè)計(jì)引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為342 bp，引物由廣州天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。引物序列信息見表1。

表 1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.4 病毒RNA的提取

取 50 mg 樣品加入 1 mL RNAiso Plus在液氮?jiǎng)驖{機(jī)中充分勻漿，將勻漿液轉(zhuǎn)移至RNase Free管中，室溫 (15～30 ℃)條件下靜置 5 min；12 000 r/min、4 ℃條件下離心5 min；小心吸取上清液，轉(zhuǎn)至新的RNase Free管。利用 RNAiso Plus對(duì) 4 種樣品進(jìn)行RNA提取，將獲得的樣品RNA置于?80 ℃保存，備用。

1.5 cDNA的合成

反轉(zhuǎn)錄體系 (總體積為 20 μL)：樣品 RNA 7 μL、Random hexamers 1 μL、2×RT Mix 10 μL、HiScript II Enzyme Mix 2 μL。用移液器輕輕吹打混勻，瞬時(shí)離心。cDNA 合成反應(yīng)條件：25 ℃ 5 min，50 ℃45 min，85 ℃ 2 min。cDNA 產(chǎn)物立即用于半巢式RT-PCR反應(yīng)。

1.6 半巢式RT-PCR檢測(cè)

以合成的cDNA為模版，以asrRdRp2F、asrRdRp1R為第1輪引物進(jìn)行半巢式擴(kuò)增。PCR體系 (總體積 20 μL)：樣品 cDNA 2 μL、上游引物asrRdRp2F 1 μL、下游引物 asrRdRp1R 1 μL、2×TaqPCR StarMix with Loading Dye 10 μL、RNase Free ddH2O 6 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，45 ℃ 退火 60 s，72 ℃ 延伸 60 s，共 36 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 終延伸 10 min。以 asrRdRp2F、asrRdRp2R為第2輪引物，擴(kuò)增程序與第1輪相同，擴(kuò)增片段大小約為 432 bp。取 10 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物，用 10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。根據(jù)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果分別分析星狀病毒在4種白狐內(nèi)臟器官中的感染情況。

1.7 目的基因的克隆及測(cè)序

通過 FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit試劑盒對(duì)陽性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收，取回收得到的產(chǎn)物與pCloneEZ-NRS-Omni-Amp/HC 載體連接，25 ℃條件下反應(yīng)5 min；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌EscherichiacoliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，并接種于含Amp的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)12 h；挑取單個(gè)菌落接種于1 mL含Amp的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃條件下?lián)u床震蕩培養(yǎng)6 h。取試劑盒提供的M13F/M13R作為鑒定重組子的引物，取2 μL菌液作為模板進(jìn)行菌液PCR；將鑒定為陽性的菌液送至廣州天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測(cè)序。

1.8 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建及相似性分析

測(cè)序結(jié)果經(jīng) DNASTAR Version 7.1 拼接后與GenBank上發(fā)表的 FAstV-K40、GZBY-128、FL-2007等9株病毒分離株進(jìn)行比較，通過Lasergene DNASTARTM 5.06軟件進(jìn)行序列比對(duì)與相似性分析，使用MEGA 7.0軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 星狀病毒RdRp基因半巢式RT-PCR檢測(cè)

通過半巢式RT-PCR對(duì)白狐的心臟、肺臟、肝臟及腎臟進(jìn)行檢測(cè)，在腎臟樣品中擴(kuò)增得到大小約342 bp的片段，與預(yù)期大小相符。瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1。

圖 1 白狐腎臟星狀病毒RdRp基因的半巢式 RT-PCR 鑒定Fig.1 Semi-nested RT-PCR identification of astrovirus RdRp gene in kidney of Alopex lagopus

2.2 白狐源星狀病毒RdRp基因序列相似性分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)顯示，白狐源星狀病毒Guangzhou 2019RdRp基因與貓?jiān)葱菭畈《?1637F、FAstV-K40、Fc13053，獵豹源星狀病毒 FL-2007，家鼩源星狀病毒GZBY-128分為同一大支，其中與香港貓?jiān)捶蛛x株1637F親緣關(guān)系最近；與豬源星狀病毒 SF9Cro、PAstV-GX1、Shanghai 2008，犬源星狀病毒Gillingham 2012的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 目的基因測(cè)序及相似性分析

目的基因克隆測(cè)序結(jié)果正確，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行相似性比較。結(jié)果(表2)顯示：白狐源星狀病毒Guangzhou 2019RdRp基因與豬源星狀病毒 PAstVGX1等9株毒株的核苷酸相似性為67.5%～96.2%。其中，與香港貓?jiān)葱菭畈《?637F的相似性最高，為96.2%；與犬源星狀病毒Gillingham 2012的相似性最低，為67.5%。

圖 2 白狐腎臟星狀病毒RdRp基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of astrovirus RdRp gene in kidney of Alopex lagopus

表 2 白狐腎臟星狀病毒RdRp基因核苷酸相似性分析1)Table 2 Nucleotide similarity analysis of astrovirus RdRp gene in kidney of Alopex lagopus %

3 討論與結(jié)論

迄今為止，已在多種禽類和哺乳動(dòng)物中檢測(cè)到星狀病毒。星狀病毒感染宿主通常具有種屬特異性，但近年來越來越多的研究表明星狀病毒可跨越物種屏障進(jìn)行傳播，其中包括野生動(dòng)物與人[11]、野生動(dòng)物與圈養(yǎng)家畜[12]之間的跨種傳播。RdRp基因的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，跨種傳播是導(dǎo)致星狀病毒長期進(jìn)化的重要因素[13]。本研究結(jié)果顯示白狐源星狀病毒的RdRp基因與貓?jiān)葱菭畈《揪哂懈叨认嗨菩?，進(jìn)一步證明星狀病毒跨種傳播的可能性。

星狀病毒主要感染人和動(dòng)物的消化系統(tǒng)，通過改變腸上皮細(xì)胞屏障的通透性引發(fā)腸炎及腹瀉等癥狀[14]。近年來，由星狀病毒引起的哺乳動(dòng)物腸外疾病也相繼出現(xiàn)，如人和牛的腦炎及神經(jīng)系統(tǒng)疾病[15]、水貂顫抖綜合征[16]以及仔豬先天性震顫和呼吸系統(tǒng)疾病[17]。哺乳動(dòng)物腎臟感染的病例報(bào)道較少，目前僅在豬和免疫缺陷小鼠的腎臟中鑒定出星狀病毒[18]。本研究對(duì)1只死亡白狐進(jìn)行了剖檢，發(fā)現(xiàn)腎臟蒼白腫大，被膜難以剝離，對(duì)其進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，成功鑒定出一株白狐源星狀病毒。

本研究中白狐感染星狀病毒可能與園內(nèi)流浪貓的活動(dòng)有關(guān)。近來有報(bào)道稱，動(dòng)物園內(nèi)發(fā)現(xiàn)一例星狀病毒在東北虎與貓之間傳播的事件，該東北虎表現(xiàn)出嚴(yán)重流涎癥狀[19]。有調(diào)查顯示星狀病毒在我國家貓中的感染率高達(dá)23.4%(46/197)，遠(yuǎn)高于其他國家，其中無癥狀感染者可達(dá)8.7% (8/92)[20]。星狀病毒主要通過糞?口途徑傳播，也可以通過飲用水源或污水傳播[21]，同時(shí)隱性感染動(dòng)物的存在為該病毒在空間和時(shí)間上提供了更多的傳播機(jī)會(huì)。城市中活動(dòng)自由的流浪貓極有可能成為星狀病毒傳播過程中的中間宿主，提高野生動(dòng)物感染該病毒的潛在風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于星狀病毒的防治，應(yīng)著手加強(qiáng)對(duì)城市內(nèi)流浪動(dòng)物的收治管理，降低圈養(yǎng)野生動(dòng)物與城市流浪動(dòng)物之間的接觸機(jī)會(huì)，建立有效保護(hù)區(qū)域，提高食物水源安全性等，以期降低珍稀野生動(dòng)物感染該病毒的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究在白狐腎臟中鑒定出1株星狀病毒，該病毒與香港貓?jiān)葱菭畈《?637F的相似性較高，達(dá)到96.2%。對(duì)其基因序列進(jìn)行分析，初步了解了病毒的進(jìn)化情況，為星狀病毒在野生哺乳動(dòng)物間的跨種傳播以及腸外器官中的感染提供了依據(jù)，有助于了解該病毒在圈養(yǎng)野生動(dòng)物與城市流浪動(dòng)物之間的傳播情況，以及感染其他動(dòng)物的潛在可能性。