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    NexGard 中阿福拉納提取與純化工藝研究

    2021-01-09 07:31:26趙晶晶
    中國(guó)動(dòng)物保健 2020年11期
    關(guān)鍵詞:拉納阿福二氯甲烷

    趙晶晶

    (山西省畜牧產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)中心太原 030027)

    隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展,人們對(duì)生活品質(zhì)的要求日益提高,越來(lái)越多家庭加入科學(xué)養(yǎng)寵隊(duì)伍,據(jù)粗略統(tǒng)計(jì)目前中國(guó)在冊(cè)的寵物犬?dāng)?shù)量已超7,500 萬(wàn),其中,城鎮(zhèn)地區(qū)養(yǎng)犬量超5,500 萬(wàn)只[1,2]。然而,寵物犬好動(dòng),喜歡到處玩耍、聞舔,極易感染寄生蟲病、皮膚病、傳染性疾病等,其中以寄生蟲病最為多發(fā)。常見(jiàn)的體外寄生蟲有蜱蟲、跳蚤等,體內(nèi)寄生蟲有心絲蟲、蛔蟲、鉤蟲、鞭蟲等,不僅影響寵物的身心健康,還因繁殖力強(qiáng)而污染環(huán)境,進(jìn)而給人的健康帶來(lái)隱患;此外,也極大地減弱寵物主與寵物的親密接觸意愿,因此,防治寵物犬寄生蟲病尤為重要[3,4]。

    臨床上,寵物犬體內(nèi)寄生蟲病的防治主要依賴大環(huán)內(nèi)酯類抗寄生蟲藥物,應(yīng)用最為廣泛的有伊維菌素、塞拉菌素、莫昔克丁、米爾貝肟等。近年來(lái),藥物化學(xué)家們依次發(fā)現(xiàn)幾種新型異噁唑啉類小分子化合物對(duì)犬跳蚤和蜱蟲等體外寄生蟲有突出的藥理活性,如阿福拉納(a foxolaner)[5]、氟雷拉納(fluralaner)[6]、沙羅拉納(sarolaner)[7]和洛替拉納(lotilaner)[8](結(jié)構(gòu)如圖1所示),該類藥物擬通過(guò)抑制GABA氯離子通道,使節(jié)肢動(dòng)物神經(jīng)高度興奮導(dǎo)致死亡,是強(qiáng)效殺蟲劑。2017年8月,勃林格殷格翰宣布其針對(duì)跳蚤和蜱蟲兩類寄生蟲的犬用口服驅(qū)蟲藥“尼可信”(NexGard,商品名為阿福拉納咀嚼片[9])在中國(guó)上市,次年8月又宣布首個(gè)犬用口服體內(nèi)外寄生蟲同驅(qū)產(chǎn)品“超可信”(NexGardSpectra,商品名為阿福拉納米爾貝肟咀嚼片)在中國(guó)上市。這兩款寵物藥很快在中國(guó)寵物市場(chǎng)占領(lǐng)了一席之地,消費(fèi)者反饋良好。我國(guó)很多新藥研發(fā)機(jī)構(gòu)也紛紛加入這兩款藥物的自主研發(fā),期望以“阿福拉納”為敲門磚,啟發(fā)開拓異噁唑啉類活性物質(zhì)研發(fā)思路。

    我國(guó)關(guān)于阿福拉納的各項(xiàng)研究均處于萌芽階段,化合物的合成及純化、成品的質(zhì)量研究及藥理毒理研究均未取得較理想的成果。造成這一難題無(wú)法向前推進(jìn)的一個(gè)基本原因,就是無(wú)法取得對(duì)照品或高純度樣品,使得現(xiàn)有研究成果可靠性、科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性都十分不足,包括結(jié)構(gòu)確證、分析方法等研究方面均無(wú)法準(zhǔn)確定位。陳春青等人[10]早前發(fā)明了同類產(chǎn)品“氟雷拉納(fluralaner)咀嚼片”中提取并純化主成分的方法,滿足了前期對(duì)較純化合物的量的需求,并為后期檢驗(yàn)工作提供了參考。目前,阿福拉納對(duì)照品暫無(wú)銷售渠道,本試驗(yàn)或能參考此專利方法,試從上市制劑“尼可信”中提取出阿福拉納化合物,經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的分離純化從而得到高純度產(chǎn)品,純度檢測(cè)采用薄層色譜和高效液相色譜法相結(jié)合,該研究?jī)?nèi)容國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。Zhuang 等人[11]運(yùn)用手性HPLC 法對(duì)阿福拉納作了大量分析,這為本方法中HPLC 法的建立提供了基礎(chǔ)依據(jù)。本方法能夠快速解決短期內(nèi)因合成工藝復(fù)雜而無(wú)法取得一定需求量的化合物(純度符合要求,不低于99%),也能為后期關(guān)于該藥物藥動(dòng)、藥代學(xué)研究樣品前處理方法中的幾項(xiàng)參數(shù)確定提供研究思路,如組織中藥物提取溶劑、方法、萃取溶劑等。

    圖1 四種獸醫(yī)臨床常用的異噁唑啉類驅(qū)蟲藥

    1 材料與方法

    1.1 主要材料與儀器

    1.1.1 材料與試劑阿福拉納咀嚼片(梅里亞有限公司法國(guó)吐魯茲生產(chǎn)廠,規(guī)格:136mg);100~200 目層析硅膠、磷酸、二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、石油醚(國(guó)藥試劑,AR);乙腈(HPLC)。

    1.1.2 主要儀器萬(wàn)能粉碎機(jī)、磁力攪拌器、反應(yīng)瓶、油浴鍋、冷凝管、水泵、布氏漏斗、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、層析柱、微量進(jìn)樣器、硅膠板G254、紫外分析儀、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、超純水儀、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、紅外光譜儀、核磁共振波譜儀。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 粉碎取60 粒阿福拉納咀嚼片,約300g,置于萬(wàn)能粉碎機(jī)中,粉碎成小顆粒狀,備用。

    1.2.2 提取取粉碎后樣品約10g (相當(dāng)于2 粒阿福拉納咀嚼片,含C26H17ClF9N3O3約272mg),加入提取溶劑(從4 種常用溶劑中篩選),開啟攪拌,加熱至回流,抽濾。濾渣同法進(jìn)行二次提取,合并濾液,照薄層色譜法進(jìn)行TLC 點(diǎn)板,在紫外分析儀254nm 處檢測(cè),判定主斑點(diǎn)深淺及雜質(zhì)斑點(diǎn)個(gè)數(shù)及深淺,粗略判定純度;然后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮至干,得粗品(TLC 純度不低于85%)。

    1.2.2.1 溶劑的選擇分別選擇4 種常用溶劑(包括二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、石油醚)按1.2.2 項(xiàng)下提取方法進(jìn)行提取試驗(yàn),篩選出最優(yōu)提取溶劑。

    1.2.2.2 溶劑量的確定分別加入樣品的10 倍、20 倍、30 倍體積質(zhì)量比的1.2.2.1 項(xiàng)篩選出的最優(yōu)提取溶劑,照1.2.2 項(xiàng)下提取方法進(jìn)行提取試驗(yàn),確定最優(yōu)提取溶劑量。

    1.2.2.3 回流時(shí)間的確定在樣品中加入1.2.2.1 項(xiàng)和1.2.2.2項(xiàng)擇出的最優(yōu)溶劑種類及溶劑量,照1.2.2 項(xiàng)提取方法進(jìn)行試驗(yàn),分別回流1h、2h、3h,篩選出最合適的回流時(shí)間。

    1.2.3 分離純化取定量粗品進(jìn)行柱層析分離,濕法上樣,以二氯甲烷/ 甲醇(40:1,v/v)為洗脫液進(jìn)行洗脫,收集洗脫液并即時(shí)進(jìn)行紫外分析,待分析結(jié)果顯示有目標(biāo)單體時(shí)(粗品點(diǎn)板主斑點(diǎn)Rf值作為參考對(duì)照),開始收集洗脫液并做標(biāo)記,至分析結(jié)果無(wú)目標(biāo)物時(shí),結(jié)束收集,合并所有標(biāo)記的洗脫液,濃縮至干,得產(chǎn)品(TLC純度不低于95%)。

    1.2.4 最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定取樣品適量,加流動(dòng)相溶解并稀釋制成5μg/mL 的溶液,在200~600nm 測(cè)定吸光度,供試品在312nm 附近有最大吸收。

    1.2.5 純度測(cè)定建立HPLC 檢測(cè)方法并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,按面積歸一化法計(jì)算純度。

    1)色譜條件:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,推薦AgilentZorbaxSB-C18(150mm×4.6mm,5 μm);以0.05%磷酸溶液(pH 2.4)為流動(dòng)相A,乙腈為流動(dòng)相B,按下表進(jìn)行線性梯度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng)為312nm;流速為1.0mL/min;柱溫為35℃;進(jìn)樣體積為20μL。

    表1 流動(dòng)相梯度

    2)分析方法:取純化后樣品適量,精密稱定,加流動(dòng)相超聲溶解并定容制成5μg/mL的溶液,搖勻。精密量取20μL注入液相色譜儀,按面積歸一化法以峰面積計(jì)算。

    3)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:分別配制2、4、5、10 和20μg/mL的對(duì)照樣品供試液,依次進(jìn)樣,得到色譜圖,按面積歸一化法,用峰面積對(duì)進(jìn)樣濃度進(jìn)行線性回歸分析。

    4)精密度:取對(duì)照樣品溶液(5μg/mL)連續(xù)進(jìn)樣5 次,記錄色譜圖,計(jì)算RSD。

    5)溶液穩(wěn)定性:將對(duì)照樣品溶液(5μg/mL)分別于0、2、4、6、8、12 和24h 取樣分析,記錄色譜圖,計(jì)算RSD。

    6)重現(xiàn)性:稱取對(duì)照樣品6 等份,配制為5μg/mL,進(jìn)樣,記錄色譜圖,計(jì)算RSD。

    7)準(zhǔn)確度:稱取3 份對(duì)照樣品,分別配制為4、5 和6μg/mL,進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,計(jì)算回收率及RSD。

    1.2.6 結(jié)構(gòu)確證依次通過(guò)紅外光譜(IR)、質(zhì)譜(MS)、核磁共振氫譜(1HNMR)進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 提取方法的確定

    2.1.1 不同提取溶劑對(duì)提取效率的影響由表2 可知,二氯甲烷的提取效率最好,因此二氯甲烷為本試驗(yàn)最優(yōu)提取溶劑。

    表2 不同溶劑對(duì)提取結(jié)果的影響

    2.1.2 不同溶劑量對(duì)提取效率的影響采用二氯甲烷按1.2.2 項(xiàng)提取方法進(jìn)行試驗(yàn),分別吸取部分提取液稀釋至同一比例后再進(jìn)行TLC 點(diǎn)板,結(jié)果顯示20 倍、30 倍體積比的二氯甲烷提取效率較好(表3),考慮到經(jīng)濟(jì)環(huán)保,最終選擇20 倍體積比二氯甲烷為最優(yōu)提取溶劑量。

    表3 不同溶劑量對(duì)提取結(jié)果的影響

    2.1.3 不同回流時(shí)間對(duì)提取效率的影響采用20 倍體積比的二氯甲烷按1.2.2 項(xiàng)提取方法進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果顯示回流2h、3h 后的提取效率較好(表4),考慮到操作效率,最終選擇回流2h 為最優(yōu)回流時(shí)間。

    表4 不同回流時(shí)間對(duì)提取結(jié)果的影響

    2.2 分離純化結(jié)果

    由表5 可知,采用20 倍體積比的二氯甲烷提取,回流2h 后進(jìn)行柱層析分離純化的效率可觀,3 批次提取純化的阿福拉納提取率均達(dá)到80%,TLC 點(diǎn)板顯示無(wú)雜質(zhì)斑點(diǎn),主斑點(diǎn)深,說(shuō)明提取物純度極高。

    表5 提取純化結(jié)果

    2.3 樣品中阿福拉納純度測(cè)定

    本試驗(yàn)經(jīng)多次條件摸索,最終建立了高效液相色譜法測(cè)定阿福拉納純度,該方法經(jīng)系統(tǒng)方法學(xué)驗(yàn)證,準(zhǔn)確度良好,4、5 和6μg/mL濃度的回收率分別為99.55%、99.34%和99.86%;精密度高,連續(xù)進(jìn)樣,主峰峰面積RSD 低于2.0%,重現(xiàn)性好;在2~20μg/mL呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)(r>0.999)。

    3 批次提取純化樣品的純度測(cè)定結(jié)果分別為99.52%、99.26%和99.31%(圖2),達(dá)到藥物研發(fā)工作對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度需求。

    圖2 阿福拉納(3 批次)液相圖譜

    2.4 樣品中阿福拉納的結(jié)構(gòu)確證

    本試驗(yàn)提取純化的阿福拉納經(jīng)紅外光譜、質(zhì)譜及核磁共振光譜法分別分析鑒定,圖譜見(jiàn)圖4~6,其特征結(jié)構(gòu)由以下特征數(shù)據(jù)確證:

    1)紅外光譜[IR(KBr),ν(c m-1)]:3305,1694,1653,1529,1331,1306,1277,1240,1169,1137c m-1。

    圖3 阿福拉納結(jié)構(gòu)

    2)質(zhì)譜[ESI-MS(m/z)]:648.2[M+Na]+。

    3)核磁共振氫譜[1HNMR(300MHz,DCl3),δ(p p m)]:1H NMR(300MHz,DMSO-D6),δ(p p m):8.95 (t,1H),8.84(d,1H),8.74 (t,1H),8.40 (d,1H),8.10 (d,2H),7.93(d,2H),7.75-7.04(m,3H),4.64(s,2H),4.08-4.00(m,4H)。

    3 討論

    本試驗(yàn)確定的提取方法操作簡(jiǎn)便,所用試劑易得且可回收,提取率達(dá)到80%;提取產(chǎn)物經(jīng)純化后,產(chǎn)品純度達(dá)到99%,顯示提取與純化方法符合高效便捷的實(shí)際應(yīng)用要求。本試驗(yàn)中建立的純度檢測(cè)方法可靠,準(zhǔn)確度和精密度均符合獸藥檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。此外,本試驗(yàn)還對(duì)國(guó)內(nèi)不同廠家提供的阿福拉納原料進(jìn)行了較系統(tǒng)全面的質(zhì)量研究,各家產(chǎn)品僅在純度控制上有差異,這與合成工藝的不同息息相關(guān),后期對(duì)雜質(zhì)的控制與研究應(yīng)進(jìn)一步加深。

    阿福拉納目前在國(guó)外已被廣泛應(yīng)用,我國(guó)引入后應(yīng)用反饋也十分滿意,但國(guó)內(nèi)關(guān)于阿福拉納的各項(xiàng)研究均處于起步階段,相關(guān)報(bào)道也甚少。根本原因?yàn)榘⒏@{進(jìn)口對(duì)照品價(jià)格昂貴,難于獲得且合成難度大,因此,本試驗(yàn)提供的快速獲得高純度的原料方法將為我國(guó)自主研發(fā)阿福拉納及其相關(guān)類型的新藥提供新思路與動(dòng)力。本試驗(yàn)建立的提取方法也可為阿福拉納制劑研究及藥代動(dòng)力學(xué)研究過(guò)程中樣品前處理方法的建立打下基礎(chǔ),建立的高效液相色譜法為之后該藥物系統(tǒng)的質(zhì)量研究工作具有重要指導(dǎo)意義。

    圖4 阿福拉納紅外光譜圖

    圖5 阿福拉納質(zhì)譜圖

    圖6 阿福拉納核磁氫譜圖

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